专利名称：精子活力的调节的制作方法
技术领域：
本发明涉及精子的活力(motility)，更具体地涉及提高精子活力的方法。 背景4支术
精子活力不足是雄性哺乳动物(例如人)不育的常见原因。因而，提高精 子活力的简单无毒的方法将提供令人高度期望的对不育中的精子活力不足 的治疗。
发明内容
本发明人已经发现使来自人精子活力不足(asthenozoospermic)的受试者 的精子体外暴露于腺苷5'-三磷酸(ATP)提高了精子运动的前进速度 (progressive velocity)和直线性(linearity)。因此本发明的特征为通过使精子暴 露于细胞外的ATP来提高精子活力的方法以及使用ATP处理过的精子进行 人工受精和体外受精(IVF)的方法。
更具体而言，本发明^是供了一种提高哺乳动物精子活力的方法。该方法 包括使来自哺乳动物受试者的精子与细胞外的腺苷5'-三磷酸(ATP)接触。在 所述接触之前，来自所述哺乳动物受试者的多个精子已经被鉴定为具有降低 的活力。所述哺乳动物受试者可以是例如人受试者或马科动物受试者。所述 精子可以得自精子活力不足的受试者。所述接触可包括在其中溶有ATP的生 理培养基中培养精子。此外，所述接触可以达约IO分钟至约120分钟，例 如达约60分钟。在所述接触初始时细胞外ATP的浓度可以为约100pM至约 5mM,例如约2.5mM。所述接触可以在约18。C至约37°C,例如在约37。C。 在所述接触之前，所述精子可以基本上已经与精浆分离。在所述接触之后， 可以评定精子的活力。此外，所述接触可以在雌性哺乳动物的生殖道 (reproductive tract)中进行，以及所述雌性哺乳动物可以是人或马科动物受试 者。
本发明的特征还为 一种使哺乳动物卵子(egg)受精的方法。所述方法包括
4使哺乳动物卵子与已经经历了上述提高哺乳动物精子活力的方法的哺乳动 物精子接触。所述哺乳动物卵子的接触可以在体外发生，以及在哺乳动物卵 子的接触和经接触过的卵子已经受精并成为胚胎之后，可以将所述哺乳动物 卵子置于哺乳动物子宫内。可选择地，所述哺乳动物卵子的接触可在体内例 如在雌性生殖道中发生。所述哺乳动物精子可以是人的精子以及所述哺乳动 物卵子可以是人的卵子。此外，所述哺乳动物精子可以是马科动物的精子以 及所述哺乳动物卵子可以是马科动物的卵子。所述精子可以得自精子活力不 足的受试者。
本文所用术语"ATP"是指腺苷5'-三磷酸。它包括酸形式以及盐，例如但 不限于腺苷5'-三磷酸二(三)盐二水合物(5'-ATP-二(三)盐)；腺苷5'-三磷酸二 钾盐二水合物(5'-ATP-K2);腺芬5'-三磷酸二钠盐(ATP二钠盐)；腺苷5'-三磷 酸二钠盐一水合物(ATP 二钠盐一水合物)；腺香5'-三磷酸镁盐(ATP镁盐)； 及耐水解的ATP类似物例如腺苦5'-(3-硫代三磷酸)四锂盐(ATPYS)和腺苷 5'-((3j-亚氨基)三磷酸四锂盐(AppNHp, AMP-PNP)。
应理解的是，在本文所述的本发明所有方法中，ATP可被尿苷-5'-三磷 酸(UTP，包括与上面针对ATP列出的那些形式相对应的化学形式)代替。
在本文中术语"精子(spermatozoon)"和"精子(spermatozoa)"与术语"精子 (sperm)"互换使用。
除非另外指出，本文中所用的所有科技术语具有与本发明相关的领域内 的普通技术人员所通常理解的含义相同的含义。当发生沖突时，以本文件(包
材料用于本发明的实施或试验中，但是下文描述了优选的方法和材料。本文 提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均整体并入本文作为参 考。本文披露的材料、方法和实例仅用于说明并不旨在受限于此。
基于下面的说明、附图和权利要求书，本发明的其它特性和优点(例如 提高精子活力)将是显然的。
图1是利用自动细胞运动分析仪观察到的活动精子所采取的轨迹的图 示。图中说明了术语VSL、 VCL、 ALH、 VAP、中位轨迹(median trajectory), 曲纟戋4九迹(curvilinear trajectory)和直纟戋运动。图2是一系列棒图，显示了在具有或不具有细胞外ATP的条件下已经 培养1小时的精子(来自27位精子活力不足的男性受试者)的平均直线速度 (mean straight line velocity(VSL)， 见图2A)、 平均曲线速度(mean curvilinear velocity(VCL)，见图2B)、平均直线性(mean linearity即LIN,见图2C)和外 侧头位移(lateralheaddisplacement(ALH),见图2D)。所示的P值是通过斯氏 t试验由标准偏差确定的。
具体实施例方式
部分基于本发明人的上述发现，本文提供了提高哺乳动物精子活力的方 法和利用所述精子进行哺乳动物授精的方法。 提高哺乳动物精子活力的方法
此处提供了提高哺乳动物精子活力的方法。所述方法包括使来自哺乳动 物受试者的精子与细胞外ATP源接触。所述精子通过本领域已知的方法来源 于相关物种的雄性受试者，包括作为雄性受试者射出的精液的一种组分。作 为选择，可通过从所述雄性受试者的输精管、附睾或睾丸抽吸来取出精子。 所述精液优选是在克制射精一段时间(例如，6小时、12小时、l天、2天、 3天，4天、5天、7天、10天、12天、14天或更长)后获得的。在与ATP 接触之前，可以任选地通过标准方法(例如实施例1中所述的一种方法)洗涤 精子，从而使精子与ATP的接触在基本上不含精液(seminal fluid)的溶液(例 如培养基)中进行。本文所用的"基本上不含精液"是指包含低于10%(例如低 于8%; 6%; 4%; 2%; 1%; 0.1%或0.001%)源于精液的组分(例如蛋白质、 脂质或者核酸)，所述源于精液的组分出现在用于获得所述精子的精液中。
雄性哺乳动物受试者可以是任何哺乳动物，包括人(例如人类患者)，非 人类的灵长动物(例如猴、猩猩或猿)，马科动物受试者(例如马、驴或斑马)， 猪，山羊，牛科动物(例如公牛)，绵羊，狗，猫，兔，豚鼠，仓鼠，沙鼠，
大鼠或者小鼠。
一般而言，所述哺乳动物受试者将是其精子具有低于正常直线速度(前 进速度)并因此是相对不育的哺乳动物。本文所用的"正常直线速度"是该物种 能育雄性受试者(即，其精子不具有明显丧失的使与所述精子相同物种的卵 子受精的能力的受试者)的精子所呈现的直线速度。然而，应理解的是，所 述方法也可用于来自看上去上完全正常的受试者(例如其精子不具有明显丧失的使合适的卵子受精的能力但希望提高其受孕可能性的受试者)的精子。
在所述4妄触之前，可以任选地对来自所述受试者的多个(例如，5、 10、 15、 20、 30、 40、 50、 70、 100、 200、 500、 800、 1000、 2000、 5000、 10000
或更多个)精子进行活力(即，正常的、增高的或降低的活力)测试。以该方式 测试的精子可以从与用于获得与ATP接触的精子相同的精液样品获得或者 从与所述受试者的精液不同的样品获得。此外，在所述接触之后，可以任选 地针对活力对所述精子的数目进行测试，目的是测试所述接触的效力。本文 所用的、应用于精子的术语"活力"指的是直线速度或前进速度，两者均用缩 写"VSL"进行指定(参见实施例1)。与活力不同，可以在所述接触之前和之后 测量直线性(即，精子轨迹的笔直程度)。
所述接触可以在体外或体内进行。当所述接触在体外进行时，将精子(通 常作为多个精子之一)培养在处于各种温度中的任意温度(例如，在约15。C至 约39。C，在约17。C至约38°C，在约18。C至约37°C，在约34。C,在约35。C, 在约36。C，在约37。C，或者在约38。C)的生理培养基(例如，组织培养基)中。 这些温度的上下文中所用的术语"约"是指所述温度可偏离所指出的温度至 多2°C。所述生理培养基可以是其中哺乳动物精子可以保持活力并保持其4受 精能力的任意培养基。合适的培养基的实例包括BWW培养基或Dulbecco 改良的Eagle培养基(DMEM)。可将各种培养基增补剂(supplement)中的任意 一种增补剂加至所述培养基中。所述增补剂包括细菌抗生素和真菌抗生素 (例如，青霉素、链霉素、庆大霉素和/或两性霉素B)以及来自相同物种但与 供精者不同个体的血清(即，同种异体的血清)，来自供精者的血清(即，自体 同源的血清)或者来自与供精者不同物种的一个或多个个体的血清(即，异种
的血清)。异种的血清可以是例如胎牛血清(FBS)、马科动物血清(例如马血 清)、山羊血清、绵羊血清或者猪血清。用于增补组织培养基的血清优选是 同种异体的血清或自体同源的血清。因此，当供精者是人时，所述血清优选 是人血清；而当供精者是马时，所述血清优选是马血清。当使用人血清时， 所述血清优选来自一个或多个具有AB血型的个体。在使用之前，也可对用 作培养基增补剂的血清进行筛选以确定是否存在抗精子抗体。含有可检测水 平的所述抗体的那些血清将排除使用。其它培养基增补剂包括各种非必需氨 基酸或者必需氨基酸(例如谷氨酰胺)、蛋白质(例如，人或牛的血清白蛋白、 胰岛素和运铁蛋白)、碳水化合物(例如糖类如葡萄糖)、核酸、核苷酸、核苦和/或脂质。
将精子的含精子样品(优选至少洗涤一次以基本上除去精液)与培养基
结合。可以在培养基与精子混合之前已经将ATP加至培养基中，或者可以在 培养基与精子混合之后将ATP加至培养基中。加入的ATP使得初始浓度(即， 在培育ATP/精子/生理溶液混合物之前的浓度)为约100 mM至約10mM,即， 约100 pM至约5mM，约500 pM至约5mM,约1 mM至约5mM，约1 mM 至约2.5mM,约1 mM，约2 mM，约2.5mM或者约3 mM。在这些ATP浓 度的上下文中，术语"约"说明所述浓度可以以所指出的值的至多约10%变化。 可用的ATP的化学形式包括所有上述的那些形式。
在将精子、ATP和生理培养基混合之后，将所得的混合物在上面列出的 温度中的一个或多个温度培育任意宽范围的时间，例如，培育约5分钟至约 180分钟、约IO分钟至约150分钟、约IO分钟至约120分4中、约20分钟至 约120分钟、约30分钟至90分钟、约30分钟至约60分钟、约120分钟、 约90分钟、约60分钟或约30分钟。在这些时间段的上下文中，术语"约" 说明所述时间可以以所指出的值的至多约20%变化。在培育之后，精子的含 并青子群(spermatozoon-containing population)可以用于各种4受津青方'法(参见下文) 中的任意一种中，任选地在用生理溶液(例如生理盐水、磷酸緩冲盐水(PBS) 或者组织培养基)洗涤之后。
精子与ATP在体内的接触可以通过将含ATP的组合物和精子的含精子 样品递送至雌性生殖道中来实现。因此，例如在相关物种的;^性受试者和雌 性受试者性交之前或者紧接其后将含ATP的组合物置入所述雌性受试者的 阴道中。可选择地，将精液或者经洗涤基本上不含精液的精子人工灌入或注 入到所述雌性受试者的阴道中。 一般而言，在将精子递送至雌性生殖道之前 或之后不超过约60分钟、约45分钟、30分钟、20分钟、10分钟、5分钟、 2分钟或1分钟时将所述组合物置入。在这些时间段的上下文中，术语"约" 说明所述时间可以以所指出的值的至多约10%变化。在这些方法中，递送至 雌性阴道中的精子与ATP接触。自然地，雌性物种可以是上面作为精子来源 的供精者列出的物种中的任一物种。作为精子来源的^M生和向其生殖道中递 送精子的雌性通常是同一物种，但这不是必须的。
递送至雌性生殖道(例如，通过施力o(application)、灌入或注入)的ATP组 合物可以采用下面的形式，例如散剂、颗粒剂、片剂、胶嚢剂、锭剂(troche)、液体(例如洗剂)、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂或者乳剂。当采用液体、凝胶剂、
软膏剂、乳膏剂或者乳剂形式时，所述ATP可以是溶解的或在悬浮液中，并 且其在组合物中的浓度一般与上面针对精子和ATP体外接触所列出的浓度 相同。所述组合物通常包含ATP和可药用载体。本文所用的"可药用载体" 包括与药学给药相容的溶剂、^:介质、包衣(coating)、抗菌剂和抗真菌剂、 等渗剂和吸收延迟剂(absortion delaying agent),等等。也可将增补的活性化 合物结合到所述组合物中。
所述组合物优选是无菌的。其在制造和存储条件下应该是稳定的，且应 防腐保存以防止微生物如细菌和真菌的污染作用。所述载体可以是含有例如 水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)或者它们的合适混 合物的溶剂或分散介质。例如，可以通过使用包衣例如卵磷脂、通过在^t 情形下保持所需的颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。 可通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现防止微生物的作用，所述抗菌剂和抗真 菌剂为例如对羟基苯曱酸酯类(paraben)、氯丁醇(chlorobutanol)、苯酚 (phenol)、抗坏血酸(ascorbic acid)、硫柳汞(thimerosal)等。在许多情形时，常 常期望在所述组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇和山梨糖 醇)以及氯化钠。在散剂情形下，制备方法可包括真空干燥或冷冻干燥，这 从其溶液中产生活性成分加上任何其它所期望的成分的散剂。
所述散剂、颗粒剂、片剂、胶嚢剂和锭剂包含1。/o至95。/o(w/w)的活性化 合物。在一些实施方案中，所述活性化合物的范围为5。/。至70。/。(w/w)。合适 的载体是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、 黄蓍胶、曱基纤维素、羧曱基纤维素钠、低熔蜡(lowmeltingwax)、可可油， 等等。术语"制剂"旨在包括以封装材料作为载体的活性化合物的剂型，提供 如下胶嚢，在所述胶嚢中，具有或不具有其它载体的活性组分被载体包围， 所述载体因此与所述活性组分结合。
可通过将ATP溶于水中并按需要加入合适的着色剂、稳定剂和增稠剂 来制备水溶液。可用粘性物质(例如天然胶或合成胶、树脂、曱基纤维素、 羧曱基纤维素钠和其它公知的悬浮剂)将微细粉碎的活性组分分散在水中来 制备水性混悬剂。
所述组合物也可以制备成栓剂形式(例如， -使用常规的栓剂基底 (suppository base)如可可油和其它的甘油酯)或者制备成用于阴道递送的持留灌肠剂(retention enemas)形式。
在一个实施方案中，将ATP与载体一起制备，所述载体将保护所述化 合物免于从身体快速消去，例如控制释放制剂，包括植入物和微嚢递送系统。 可使用可生物降解性、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯共聚物、聚 酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备上述制剂的方法对本领域的 4支术人员来i兌是显而易见的。材料也可从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals, Inc商购。脂质体混悬液也可用作可药用载体。这些可才艮据 本领域技术人员已知的方法(例如在美国专利4,522,811中所述的方法)制备。
为了易于给药和使剂量一致，有利的是可以剂量单位形式配制组合物。 本文所用的剂量单位形式指的是对于治疗的受试者适于作为单元剂量的物 理上离散的单位；各单位包含预定量的ATP,对所述预定量进^f亍计算以与所 需的药用载体结合产生所期望的活力提高效果。剂量单位还可附有用法说明 书。
本文还提供了制品，其包含含有ATP和包装材料的容器和/或递送媒介 物(例如瓶、小瓶(vial)、胶嚢或药片)和/或包装嵌入物(insert),所述包装嵌入 物含有如何实施上述提高精子活力的方法中任一种方法的说明书。
授精方法
如上所指出，已经体外与ATP接触的精子群中的精子可用于本领域已 知的各种IVF和人工受精方法中的任种一方法中。这样的方法的实例详细描 述于Hall等人的(1997) Sa/〃&my C7/w. (7;/""eco/. 11:711-24; Van
Steirteghem的(1994) CWr. Op/w. 06"". G^weco/. 6:173-177;以及Van Voorhis 的(2007)W.人iV/ed 356:379-386中，将它们公开内容整体并入本文作为
参考。 '
在用于这些方法—之前，可任选地(但不是必须地)清洗精子从而使其不含 或者基本上不含含有ATP的生理培养基。本文所用的"基本上不含含有ATP 的生理培养基"是指包含少于10%(例如，少于8%; 6%; 4%; 2%; 1%; 0.1%或0.001°/。)用于使精子与ATP接触的含ATP的生理培养基。
实质上，IVF方法牵涉培育来自任一上面所列物种的雌性受试者的卯子 与来自相同物种的任一雄性受试者的、并且已经经历上述活力提高方法的精 子。在培育之后，将在精子穿入一个或多个卵子后发育成的一个或多个胚胎 置入雌性受试者的子宫中，所述受试者是(通常但非必须)最初从其获得卵子的受试者。同样，精子的雄性供体和卵子的雌性供体可以是上面所列物种中 的任一种。通常但不是总是，所述雄性和雌性是同一物种。
一般而言，在卵
子被精子穿入的16-24小时后，出现精子和卵核的熔合(即，形成受精卵)。 在精子穿入卵子的约48小时后，形成胚胎即通常含有两个细胞的结构。在 该阶段或者在胚胎成熟的稍后阶段(精子穿入卵子后的至多5天)，将胚胎移 至雌性受试者的子宫中。在转移之前，可通过本领域内技术人员熟悉的方法 对卵子的受精和随后胚胎的形成进行测试。
人工受精方法包括，例如，将已经经历上述活力提高方法的精子递送至 雌性受试者的生殖道(例如，阴道和/或子宫)。在这种情形下，希望所述精子 会与由雌性受试者所产生的卵子接触并使之受精。同样，精子的雄性供体和 雌性受试者可以是上面列出物种中的任一种。通常但不是总是，所述雄性和 雌性是同一物种。
下面的实施例用于说明而非限制本发明。
实施例
实施例1:材并+和方法 精子活力
根据世界卫生组织(WHO)实验室手册[用于检查人的精液和精子-子宫 颈粘液相互作用的世界卫生组织(1999) WHO实验室手册，第128页。剑桥 大学出版社，剑桥，其公开内容整体并入本文作为参考]标准对精子活力按a 至d的等级进行评级，如下所述
等级a(快速前进)精子以直线形式快i4向前游动；
等级b(缓慢前进)精子向前游动，但是以曲线形式或歪斜形式游动， 或緩慢游动(緩慢的线性或者非线性的活动(motility));
等级c(不前进)精子移动其尾部，但不向前移动(只是原地活动)；以及
等级d(不游动的)精子根本不动。
"快速"和"緩慢"是精子运动的定性特征，其是由观察样品的操作者基于 他或她^r查精子的经^r来确定。
认为低百分率的等级a和b活力和高百分率的等级c和d表明了弱的精 子授精能力。
患者选择分析了因不育而求助于男科中心(帕多瓦大学，内^"与外科科学系，内
分泌学部分)的27位精子活力不足而其它方面健康的男性的精子。本文所用 术语"精子活力不足的"指的是其具有活力等级a的精子的百分数加上具有等 级b的精子的百分数低于50%的雄性受试者。来自所有受试者的精液样品的 等分试样的培养物都显示样品没有细菌污染，并且在上述任一受试者的精液 中均未检测到抗精子抗体。 精子特征如下
精子活力等级a的百分数+等级b的百分数(用光学显微镜评价)< 50%。
精液中的精子浓度220 x 106/ml
具有正常形态学的精子2 30%
精子存活率(viability): 2 50%
实验方案
节欲3天后，将精液样品收集在无菌的容器中。在室温时液化30分钟 之后，根据WHO实验室手册[同上]检查标准精液参数。
对于精子移动分析，将精液等分试样(IO pl)置于Makler室，随机检查每 室的10个不同区域(field)，并且就所述室的每个区域而言对至少100个精子 进行评分。利用自动分析仪(37°C) (CellTrack VP1 10，美国加州Palo Alto的 Motion Analysis Corporation)对能游动的精子的百分凄t和移动特性进行分析。 仅对能游动的精子进行精子速度和动态参数的评价，并表达为平均值。计算 标准偏差并通过斯氏t检验(Stuents，s West)确定显著性P值。
确定下面的精子参数
曲线速度(VCL)，也称为轨迹速度，并且是精子沿各轨道的速度(单位为 (j_m/s);
直线前进速度(VSL),是从轨道的起点到终点以直线测量的平均速度(单 位nm/s);
外侧头位移(ALH)的幅度，是精子头部摆动的平均宽度(单位拜)；以及
直线性系数(linearity coefficient)(LIN = VSL/VCL x 100)，是精子轨迹的 笔直程度(单位％)。
这些参数图表形式显示于图1中。在图1中，VAP指的是平滑精子路线 的平均速度(lim/s)。
为了分析细胞外ATP对来自精子活力不足的受试者的精子活力参数的作用，通过如下方式将来自该受试者的精子样品进行一次洗涤添加BWW 培养基(Biggers-Whitten-Whittingham培养基；95mMNaCl， 4.8mMKCl， 1.7 mM CaCl2, 1.2 mM KH2P04, 1.2 MgS04， 25 NaHC03, 5.6 mM果糖，0.25 mM 丙酮酸钠，3.7 ml/1的60%乳酸钠糖浆，104 IU/ml青霉素，以及10 mg/ml 链霉素)，并以800xg离心10分钟。离心后弃去上清液，将精子沉淀小5求 以浓度10x 1(^个精子/毫升悬浮于BWW培养基中，分成两等分，并^f吏它们 恢复15分钟。然后将一等分试样用ATP(2.5mM的最终浓度，由100mM母 液通过用生理溶液(0.9%的NaCl蒸馏水溶液)稀释ATP而制备)在37。C培育， 而另一等分试样仅用相同量的生理溶液在37。C培育(作为阴性对照)。在培育 60分钟之后，如上所述确定精子活力参数。
实施例2:用细胞外ATP处理来自精子活力不足的受试者的精子 检查了细胞外ATP对如下精子的精子活力参数的作用，所述精子来自 患有精子活力不足症受试者，洗去精液后悬浮于BWW培养基(10x 106个精 子/毫升)。
精子活力不足的受试者的精子在2.5mM的ATP存在下培育60分钟改 进了精子的活力参数，包括前进速度(对照23.81±6.04 pM/s， ATP: 28.85±7.27 pm/s; pi.0024)以及直线性(对照29.59±6.25， ATP: 37.7士7.9; p-0.0004)(参 见图2)。在ATP处理(2.5mM)后未观察到ATP处理对曲线速度和精子外侧头 位移的显著影响。
因此看来，来自精子活力不足的受试者的精子的ATP处理提高了精子 活力特性。这些发现对ATP如何提高人IVF成功率提供了机械学支持，并 说明使精子培育暴露于细胞外ATP对于不育可以是一种有用且无毒的治疗。
已经描述了多个本发明的实施方案。但是，应理解在不偏离本发明的精 神和范围的条件下可进行各种修改。因此，其它实施方案在所附的权利要求 书的保护范围内。
权利要求
1.一种提高哺乳动物精子活力的方法，该方法包括使来自哺乳动物受试者的精子与细胞外腺苷5′-三磷酸(ATP)接触。
2. 权利要求1的方法，其中，在所述接触之前，来自所述哺乳动物受 试者的多个精子经鉴定为具有降低的活力。
3. 权利要求1或2的方法，其中所述哺乳动物受试者是人受试者。
4. 权利要求1或2的方法，其中所述哺乳动物受试者是马科动物受试者。
5. 权利要求1至4中任一项的方法，其中所述接触包括在其中溶有ATP 的生理培养基中培养精子。
6. 权利要求1至5中任一项的方法，其中所述接触达约IO分钟至约120 分钟。
7. 权利要求1至6中任一项的方法，其中所述接触达约60分钟。
8. 权利要求1至7中任一项的方法，其中在所述接触初始时细胞外ATP 的浓度为约lOOpM至约5mM。
9. 权利要求1至8中任一项的方法，其中在所述接触初始时细胞外ATP 的浓度为约2.5mM。
10. 权利要求1至9中任一项的方法，其中所述接触在约18。C至约37 'C进行。
11. 权利要求1至10中任一项的方法，其中所述接触在约37。C进行。
12. 权利要求1至11中任一项的方法，其中在所述接触之前，所述精 子基本上与精浆分离。
13. 权利要求1至12中任一项的方法，其中在所述接触之后，对精子 活力进行评定。
14. 权利要求1至4中任一项的方法，其中所述接触发生在雌性哺乳动 物的生殖道中。
15. 权利要求14的方法，其中所述雌性哺乳动物为人。
16. 权利要求14的方法，其中所述雌性哺乳动物为马科动物受试者。
17. —种使哺乳动物卵子受精的方法，该方法包括使哺乳动物卵子与已 经经历权利要求1-16中任一项的方法的哺乳动物精子接触。
18. 权利要求17的方法，其中所述哺乳动物卵子的接触在体外发生。
19. 权利要求17的方法，其中在哺乳动物卵子的接触和接触过的卵子 已经受精并成为胚胎之后，将所述哺乳动物卵子置于哺乳动物子宫内。
20. 权利要求17的方法，其中所述哺乳动物卵子的接触在体内发生。
21. 权利要求20的方法，其中所述哺乳动物卵子的接触在雌性生殖道 内发生。
22. 权利要求17至21中任一项的方法，其中所述哺乳动物精子是人的 精子，所述哺乳动物卵子是人的卵子。
23. 权利要求17至21中任一项的方法，其中所述哺乳动物精子是马科 动物的精子，所述哺乳动物印子是马科动物的卵子。
24. 权利要求1至16中任一项的方法，其中所述精子得自精子活力不 足的受试者。
25. 权利要求17至23中任一项的方法，其中所述精子得自精子活力不 足的受试者。
全文摘要
本发明披露了提高哺乳动物精子授精能力的方法，包括使所述精子与腺苷5′-三磷酸接触，以及披露了使用所述方式处理过的精子进行授精的方法。
文档编号G01N33/483GK101688859SQ200880013833
公开日2010年3月31日 申请日期2008年2月27日 优先权日2007年2月27日
发明者古列尔莫·伯纳尼, 弗朗西斯科·蒂弗吉里奥, 马科·罗萨托 申请人:达斯卡科技公司