专利名称：荧光化合物的制作方法
荧光化合物本申请要求于2007年12月14日提交的美国临时专利申请61/013，956的权益， 在此将其全文引入作为参考。
背景技术：
荧光染料广泛用于生物学研究和医学诊断。荧光染料优于常规的放射性物质，因 为荧光染料通常是足够灵敏的而被检测，且花费更少、毒性更低。具体地，具有可区别的色 彩范围(color range)的不同荧光团(fluorophore)使得进行多种测定法(multiplexed assays)变得更实际可行，所述多种测定法能够平行检测多重生物学靶标。通常需要使多重 靶标平行显现的能力，用来描绘体外和体内不同生物学靶标之间的空间和时间关系。此外， 宽范围的荧光染料的产生开启了进行高通量和自动化测定的新途径，由此显著地降低了对 每测定的单元花费。此外，荧光染料的低毒性提供了体外操作的容易性，并且也使得其进行 体内生物活性成像(imaging biological activities)更安全。尽管荧光染料具有多种优点，但常规染料具有许多深切的限制。例如，常规荧光染 料通常易于发生染料间淬灭(inter-dye quenching)，这是已知为减小染料的有效亮度的 现象。常见的实践是，使给定的靶标与多种染料分子缀合，以便使得经标记的靶标(例如生 物分子如蛋白质或DNA)的亮度最大化。对于许多常规荧光染料而言，经标记的靶标的荧光 强度通常与所连接的染料分子的数目不成正比，而是比预测的强度低，这时由于例如与靶 标连接的多种染料之间发生淬灭。所述淬灭效应可部分归因于所连接的染料分子之间的物 理相互作用，这种物理相互作用可导致非荧光性染料二聚体的形成。二聚体形成可由疏水 相互作用(hydrophobic interaction)驱使。因为许多传统的荧光染料如各种若丹明染 料(rhodamine dye)和花青染料(cyanine dye)是高度疏水的芳族化合物，这些常用的染 料特别易于在经标记的生物分子上形成二聚体。已显示将磺酸根基团(sulfonate group) 加到染料中减少二聚体形成。参见，例如美国专利5，268，486和6，977，305,6, 130，101和 Panchuk-Voloshina 等人，J. Histochem. Cytochem. 47(9)，1179(1999)。然而，尽管磺化作 用可减少二聚体形成，但也将负电荷引入到了生物分子中，由此可增加破坏经标记的生物 分子的生物活性的危险。此外，仅取代有磺酸根基团的染料在受试者体内使用时可显示出 较短的血清半衰期。常规荧光染料的另一种限制因素是个体荧光基团所固有的较低荧光亮度。这种 特性通常由荧光基团的荧光量子产率(fluorescence quantum yield)决定。低的荧光量 子产率通常是由于能量从分子的电子激发态(excited electronic state)转移到振动态 和转动态(vibrational and rotational states)引起的，这是电子能量转换为热能而非 光能的过程。改善荧光基团的荧光量子产率的一种途径是使染料结构刚性化(rigidify)， 从而染料具有受限的振动和转动模式。参见例如美国专利5，981，747和5，986，093，这些 专利描述了经两个碳的链刚性化的单次甲基花青染料(monomethine cyanine dye)，所述 两个碳的链连接两个苯并噁唑鐺(benzazolium)氮原子。类似地，在美国专利6，133，445 中，三次甲基花青染料通过将桥基引入到含有三个环的稠合环系中而刚性化。刚性化的花青染料与非刚性化的对应染料相比都具有显著改善的量子产率。然而，量子产率的改善是 以损害了其它期望的特性为代价的。例如，由于这些刚性化染料的结构相对复杂，它们与常 规花青染料相比通常花费若干更多的步骤来合成，这常常伴随着较低的收率。高度刚性化 的染料也可能显示了在蛋白质上聚集的更高倾向。例如，已显示刚性化的花青染料即使当 其在蛋白质上的标记程度大大低于非刚性化花青时也形成二聚体(C00per，et al. Journal of Fluorescence 14,145(2004))。此外，已显示与常规非刚性化三次甲基花青染料相比， 刚性化的三次甲基花青染料显著降低了耐光性(photostability)(参见例如美国专利 6，133，445)。因此，对允许在各种应用中便利和有效地标记宽范围的分子的改进组合物和方法 仍然存在相当的需求。本发明满足了这种需求，并且提供了额外的优点。因此，本发明提供了可具有下列特征的任何一种或所有特征的荧光化合物。在一 方面，使用本发明的荧光化合物制备的经标记的生物分子显示了显著降低的二聚体形成。 在其它方面，本发明的化合物和经标记的生物分子显示了其它期望的特性，如更高的水溶 性，改善的荧光量子产率，改善的耐光性、相对简单的合成、对标记的缀合物(conjugate) 的改善的特异性，和/或改善的体内半衰期。本发明提供了式I化合物
权利要求
式I化合物其中F为荧光团；T为由一个或多个化学键形成且连接三个或更多不同部分的结合部分，以及其中所述结合部分含有约1 100个原子；m和n独立为0至20的整数；R1、R2和R3各自独立为(R)p (L)q ；R1、R2和R3中的每个L独立为由一个或多个化学键形成且含有约1 100个原子的连接部分；R1、R2和R3中的每个p为1至20的整数；R1、R2和R3中的每个q为0至20的整数；R1、R2和R3中的每个R独立为i)当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；ii)水溶性聚合物基团；iii)烷基、三氟烷基、卤素基团、磺酰基、磺酸根基团、膦酸根基团或磺酰胺基；或iv) H；以及其中R1、R2和R3中的至少一个R为反应性基团且R1、R2和R3中的至少另一个R为水溶性聚合物基团。FPA00001204839100011.tif
2.权利要求1的化合物，其中所述荧光团为占吨染料、香豆素染料、芘染料或花青染料。
3.权利要求1的化合物，其中所述荧光团为香豆素染料。
4.权利要求1的化合物，其中所述荧光团为芘染料。
5.权利要求1的化合物，其中所述荧光团为若丹明染料。
6.权利要求1的化合物，其中所述水溶性聚合物为聚环氧烷。
7.权利要求1的化合物，其中所述水溶性聚合物为聚环氧乙烷。
8.权利要求1的化合物，其中所述水溶性聚合物为碳水化合物。
9.权利要求1的化合物，其中所述水溶性聚合物为多肽。
10.权利要求1的化合物，其中所述水溶性聚合物的分子量大于约300Da。
11.权利要求1的化合物，其中所述水溶性聚合物的分子量大于约800Da。
12.权利要求1的化合物，其中所述水溶性聚合物分子量为约SOODa至约3000Da。
13.权利要求1的化合物，其中所述反应性基团与氨基、巯基或羟基亲核基形成共价键。
14.权利要求1的化合物，其中所述反应性基团为异硫氰酸酯基团、异氰酸酯基团、一 氯三嗪基团、二氯三嗪基团、卤素取代的吡啶基团、卤素取代的二嗪基团、亚磷酰胺基团、马 来酰亚胺基团、氮丙啶基团、磺酰卤基团、酰卤基团、羟基琥珀酰亚胺基酯基团、羟基磺基琥 珀酰亚胺基酯基团、四氟苯酚酯基团、亚胺酯基团、胼基团、叠氮基硝基苯基、叠氮基团、炔 基团、3_(吡啶-2-基二硫基)_丙酰胺基团、乙二醛基团或醛基团。
15.权利要求1的化合物，其中所述化合物的最大荧光激发波长范围为约350至约1200nm。
16.权利要求1的化合物，其中所述化合物的最大荧光发射波长范围为约360至 1250nm。
17.权利要求1的化合物，其中所述荧光团为下式的香豆素其中Ra、Rb、R。、Rd、民和&部分中的一个为将所述荧光团与所述-(L)m-部分或所述部分连接的键；Ra、Rb、R。、Rd、Re和Rf的各剩余部分具有式(R) p_ (L) ，其中Ra、Rb、R。、Rd、Re和Rf的每个R独立为i)当与反应底物反应时能够形成共价键的反应 性基团；ii)水溶性聚合物基团；iii)烷基、三氟烷基、卤素基团、磺酰基、磺酸根基团、膦酸 根基团或磺酰胺基；或iv)-H;Ra、Rb、R。、Rd、Re和Rf中的每个L为由一个或多个化学键形成且含有约1-100个原子的 连接部分；Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf中的每个ρ独立为1至20的整数；以及 Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf中的每个q独立为0至20的整数。
18.权利要求17的化合物，其中Rl>0<R2 9\φ具有式
19.权利要求17的化合物，其中所述荧光团被一个或多个磺酸根基团取代。
20.权利要求1的化合物，其中所述荧光团为下式的化合物
21.权利要求20的化合物，其中m为0且f
22.权利要求21的化合物，其中R1包括水溶性聚合物基团且R2包括反应性基团,
23.权利要求22的化合物，其中R1包括聚乙二醇。
24.权利要求22的化合物，其中R2包括N-羟基琥珀酰亚胺基团。
25.具有最大荧光激发波长的化合物，其中所述化合物具有式II的结构
26.权利要求25的化合物，其中当存在至少两个相邻的R1和/或两个相邻的R2时，所 述两个相邻的R1和/或所述两个相邻的R2结合形成6元环，所述6元环是未取代的或被一 个或多个(R) P-(L)q-取代。
27.权利要求26的化合物，其中当所述两个相邻的R1和/或所述两个相邻的R2结合 形成6元环时，如此形成的环为芳族的。
28.权利要求25的化合物，其中当Ψ为式1且所述化合物的最大荧光激发波长等于或 大于660nm时，或当Ψ不是式1时，则R5和R6独立为(R)p-(L) ，或R5和R6可结合形成环 状部分，所述环状部分是未取代的或被一个或多个(R) p- (L) q-取代。
29.权利要求25的化合物，其中Y为
30.权利要求25的化合物，其中R1和R2中至少
31.权利要求25的化合物，其中R1和R2中至少
32.权利要求25的化合物,其中R1和R2中每个R包括磺酸根基团或膦酸根基团-个R为带电部分。-个R包括磺酸根基团或膦酸根基团。
33.权利要求25的化合物，其中X2和X3独立为
34.权利要求25的化合物，其中X2和X3独立为^Cy
35.权利要求25的化合物，其中所述水溶性聚合物为聚环氧烷。
36.权利要求25的化合物,其中所述水溶性聚合物为聚环氧乙烷。
37.权利要求25的化合物,其中所述水溶性聚合物的分子量大于约300。
38.权利要求25的化合物,其中所述水溶性聚合物的分子量大于约800。
39.权利要求25的化合物，其中所述水溶性聚合物分子量为约800至约3000。
40.权利要求26的化合物，其中两个相邻的(R1)a与环A中它们所连接的原子结合形 成碳环。
41.权利要求40的化合物，其中所述碳环为芳族的。
42.权利要求26的化合物，其中两个相邻的(R2)b与环B中它们所连接的原子结合形 成碳环。
43.权利要求42的化合物，其中所述碳环为芳族的。
44.权利要求25的化合物，其中所述化合物具有式 -X X·(Rl)a~TT(R2)b
45.权利要求25的化合物，其中所述化合物具有式
46.权利要求25的化合物，其中所述化合物具有式
47.权利要求25的化合物，其中所述化合物具有式
48.权利要求25的化合物，其中所述化合物具有式
49.权利要求25的化合物，其中所述化合物具有式
50.权利要求25的化合物，其中所述化合物的最大荧光激发波长范围为约350至约 1200nm。
51.权利要求25的化合物，其中所述化合物的最大荧光发射波长范围为约360至约1250nm。
52.权利要求25的化合物，其中所述水转針生聚合物为聚环氧烷。
53.权利要求25的化合物，其中所述水转針生聚合物为聚环氧乙烷。
54.权利要求25的化合物，其中所述水转針生聚合物为碳水化合物。
55.权利要求25的化合物，其中所述水转針生聚合物为多肽。
56.权利要求25的化合物，其中所述水转針生聚合物分子量大于300。
57.权利要求25的化合物，其中所述水转針生聚合物分子量大于800。
58.权利要求25的化合物，其中所述化合物为
59.取代的花青染料，所述取代的花青染料含有反应性基团和一个或多个水溶性聚合 物基团，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大荧光激发波长。
60.取代的花青染料，所述取代的花青染料含有反应性基团和一个或多个水溶性聚合 物基团，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大吸收波长。
61.权利要求59或60的取代的花青染料，其中所述染料被非螺环部分取代。
62.结合剂，所述结合剂用权利要求59或60的取代的花青染料标记，其中所述结合剂 与靶标多肽选择性结合以形成复合物，以及其中复合物的形成产生了至少为100的荧光信 噪比。
63.权利要求62的结合剂，其中所述取代的花青染料取代有非螺环取代基。
64.权利要求62的结合剂，其中所述结合剂为多肽。
65.权利要求63的结合剂，其中所述多肽为抗体。
66.式III化合物
67.权利要求66的化合物，其中R6、R7、R8或R9中的至少一个可与邻近的R1或R2和所 述邻近的R1或R2所连接的环中任何间插原子结合形成5元或6元环，所述5元或6元环是 未取代的或被一个或多个(R)p-(L)tl-取代。
68.权利要求67的化合物，其中当R6、R7、R8或R9中的至少一个可与邻近的R1或R2结合形成5元或6元环时，所述环是不饱和的。
69.权利要求67的化合物，其中当R6、R7、R8或R9中的至少一个可与邻近的R1或R2结 合形成5元或6元环时，所述环是饱和的。
70.权利要求66的化合物，其中X1为=NH2+。
71.权利要求66的化合物，其中X1为=0。
72.权利要求66的化合物，其中X2为-0H。
73.权利要求66的化合物，其中X2为-NH2。 权利要求66的化合物，其中所述化合物的最大荧光激发波长范围为约450至 权利要求66的化合物，其中所述化合物的最大荧光发射波长范围为约470至 式V的化合物
74.
75.
76.RpR^R3 和 R4 各自独立为(R)p-(L)q-,礼、R2, R3和R4中的每个R独立为i)当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基 团；ii)水溶性聚合物基团；iii)烷基、三氟烷基、卤素基团、膦酸根基团、磺酸根基团或磺 酰胺基；或iv)-H;Ri、R2、R3和R4中每个L独立为由一个或多个化学键形成且含有约1-100个原子的连接 部分，礼、R2、R3> R4> R5> R6和R7中每个P独立为1至20的整数，礼、R2、R3> R4> R5> R6和R7中每个q独立为0至20的整数，a、b、c和d独立为0、1、2或3，礼、R2、R3和R4中至少一个R为反应性部分，以及礼、R2、R3和R4中至少一个R为水溶性聚合物基团。
77.试剂盒，其包括i)权利要求1、25、59、60、66或76的化合物；ii)缓冲剂；iii)用于纯化缀合产物的材 料或装置；以及ν)指示所述化合物用法的说明书。
78.生物分子，其包括具有权利要求1、25、59、60、66或76的式的结构的标记物，其中对 所述式的至少一个反应性部分已进行了将标记物与生物分子连接的反应。
79.权利要求78的包括标记物的生物分子，其中所述生物分子包括多核苷酸。
80.权利要求78的包括标记物的生物分子，其中所述生物分子包括多肽。
81.权利要求80的生物分子，其中所述多肽还包括抗原结合位点。
82.权利要求80的生物分子，其中所述多肽为完整免疫球蛋白。
83.权利要求80的生物分子，其中所述多肽为Fab片段。
84.免疫球蛋白，其包括具有权利要求1、25、59、60、66或76的式的结构的标记物，其中 对所述式的至少一个反应性部分已进行了将标记物与免疫球蛋白连接的反应，其中所述免 疫球蛋白为与癌细胞上的抗原特异性结合的抗体。
85.权利要求84的免疫球蛋白，其中所述抗体与erb2结合。
86.制备经标记的生物分子的方法，其包括使权利要求1、25、59、60、66或76的化合物 与底物生物分子在足以实现所述化合物和底物生物分子之间发生交联的条件下反应。
87.权利要求86的方法，其中所述底物生物分子为多肽、多核苷酸、碳水化合物、脂质 或它们的组合。
88.权利要求87的方法，其中所述底物生物分子为多核苷酸。
89.标记细胞群落中细胞，由此使所述细胞相对于群落中的相邻细胞被差异性标记的 方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求78的生物分子接触，其中所述生物分子包括靶 标部分，所述靶标部分与作为细胞指示的结合配偶体结合，由此使所述细胞相对于群落中 的相邻细胞被差异性标记。
90.权利要求89的方法，所述方法还包括对细胞进行成像的步骤，所述成像步骤包括i)将激发波长导向所述细胞；以及 )检测从所述细胞发射的荧光。
91.权利要求89的方法，其中所述标记在体外发生。
92.权利要求89的方法，其中所述标记在体内发生。
93.用荧光化合物标记的免疫球蛋白，所述荧光化合物包括聚环氧烷和最大吸收波长 等于或大于685nm的荧光团。
94.用荧光化合物标记的免疫球蛋白，所述荧光化合物包括聚环氧烷和最大吸收波长 等于或大于750nm的荧光团。
95.权利要求93或94的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白当与荧光化合物缀合时保持 了对靶标的结合特异性。
96.权利要求95的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白为与癌细胞上的抗原特异性结合 的抗体。
97.权利要求96的免疫球蛋白，其中所述抗体与erb2结合。
98.权利要求93或94的免疫球蛋白，其中所述荧光化合物为权利要求1、25、59、60、66 或76的化合物。
99.用荧光化合物标记的多肽，所述多肽呈现出的血清半衰期不短于缺少所述荧光化 合物的相应多肽的血清半衰期，其中所述荧光化合物为权利要求1、25、59、60、66或76的化 合物。
100.标记多肽的方法，其包括形成包括多肽和结合剂的复合物，其中所述结合剂包 括具有权利要求1、25、59、60、66或76的式的结构的荧光标记物，其中对所述式的至少一个 反应性部分已进行了将标记物与结合剂连接的反应。
101.权利要求100的方法，其中所述结合剂为抗体。
102.权利要求101的方法，其中所述复合物包括(a)与所述多肽结合的第一抗体，以及(b)结合剂，其起到第二抗体的作用，显示出与第一抗体结合的能力。
103.权利要求102的方法，其中所述标记发生在固体底物上。
104.权利要求102的方法，其对多肽进行细胞内标记。
105.权利要求102的方法，其中所述复合物产生大于约100的信噪比，其中所述信噪比 由下式计算(来自复合物的荧光信号)/ (来自多肽、同种型对照第一抗体和所述结合剂的荧光信 号)，其中所述复合物包括被第一抗体结合的多肽，所述第一抗体本身与所述结合剂结合。
106.权利要求102的方法，其中所述复合物产生大于约250的信噪比，其中所述信噪比 由下式计算(来自复合物的荧光信号)/ (来自多肽、同种型对照第一抗体和所述结合剂的混合物 的荧光信号)，其中所述复合物包括被第一抗体结合的多肽，所述第一抗体本身与所述结合 剂结合。
107.权利要求102的方法，其中所述复合物产生大于约270的信噪比，其中所述信噪比 由下式计算(来自复合物的荧光信号)/ (来自多肽、同种型对照第一抗体和结合剂的混合物的荧 光信号)，其中所述复合物包括被第一抗体结合的多肽，所述第一抗体本身与所述结合剂结
108.权利要求102的方法，其中所述复合物产生的总荧光信号与由相同第一抗体和相 同第二抗体形成的、用DyLight 680 染料进行了可比程度的标记的复合物所产生的总荧 光信号相比大至少5%。
109.权利要求102的方法，其中所述复合物产生的总荧光信号与由相同第一抗体和相 同第二抗体形成的、用Cy5. 5 染料进行了可比程度的标记的复合物所产生的总荧光信号 相比大至少5%。
110.权利要求102的方法，其中所述复合物产生的总荧光信号与由相同第一抗体和相 同第二抗体形成的用Alexa Fluor 680 染料进行了可比程度的标记的复合物所产生的总 荧光信号相比大至少5%。
111.权利要求108、109或110的方法，其中具有权利要求25的式的结构的标记物为具 有下式的化合物-R = -(CH2)5COMH(CH2CH2O)24CH3
112.权利要求111的方法，其中每种复合物在635nm或633nm激发。
113.权利要求111的方法，其中每种复合物以相同蛋白质浓度存在。
全文摘要
一般而言，本发明涉及涉及荧光染料。本发明提供了宽范围的荧光染料和含有所述荧光染料的试剂盒，它们适用于标记各种生物分子、细胞和微生物。本发明还提供了使用荧光染料用于研究和开发、法医鉴定、环境研究，以及对病症进行诊断、预测和/或治疗的各种方法。
文档编号G01N21/64GK101946171SQ200880126876
公开日2011年1月12日 申请日期2008年12月12日 优先权日2007年12月14日
发明者张正英, 梁伟义, 毛飞, 海·E·胡佛 申请人:拜奥蒂乌姆股份有限公司