专利名称：固相萃取-高效液相色谱法检测生活污水中土霉素的方法
技术领域：
本发明属生活污水中土霉素的检测领域，特别是涉及固相萃取一高效液相色谱法检测 生活污水中土霉素的方法。
背景技术：
近年来，环境中的微量污染物被不断探测到，引起了人们的广泛关注。抗生素被长期 大量地用于人和动物的疾病治疗，并以亚治疗剂量添加于动物饲料长期用于动物疾病的预 防和促进生长,大部分抗生素不能完全被机体吸收,而有高达85%以上抗生素以原形或代谢 物形式经由病人和畜禽粪尿排入环境,经不同途径对土壤和水体造成污染。而抗生素的滥 用、大量耐药性致病菌的出现使得抗生素在环境中的残留、归趋以及对环境的影响成为关 注焦点。我国是抗生素的生产和使用大国。在农用抗生素中,土霉素和等四环素类抗生素是 应用最广泛、使用量最大的一类抗生素，2003年我国仅土霉素产量就达到了10000t,占世 界土霉素生产总量的65%。随着环境中微量污染物问题被不断提出，对这些抗生素的检测 就越来越重要，而抗生素的检测方法成为相关研究的重要因素。
通常的对水环境中的土霉素的液相色谱法测定中，由于在水中天然有机质(主要为腐殖 酸)含量常常很高,对HPLC检测有很大的影响。处理样品时，如果只用HLB小柱纯化和富集， HLB小柱在吸附土霉素的同时也会吸附大量的有机质。在洗脱时,由于洗脱液的洗脱性很强， 在完全洗脱土霉素的同时,也会洗脱大量的其它有机物,导致色谱分离时,有机质的峰很高, 并形成拖尾。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供固相萃取一高效液相色谱法检测生活污水中土霉 素的方法，该方法建立了一种串联固相萃取一高效液相色谱的方法测定生活污水中痕量土 霉素含量的方法，方法先进、准确，并简化了样品前处理过程。
本发明的固相萃取一高效液相色谱法检测生活污水中土霉素的方法，包括
(1) 用0.1mol/L-0.5mol/L的盐酸溶液溶解土霉素标品，之后不断稀释，配制不同浓 度梯度在500吗/L 10mg/L的标准溶液；
(2) 制备待测样品取生活污水在离心机上离心10 min，取上清液作为待下步处理
样品；
(3) 使用包括二元泵、恒温箱、紫外检测器及化学工作站组成的HPLC仪，以超纯 水/乙腈为流动相，恒速洗脱，色谱条件如下vi. 色谱柱Eclipse XDB-C18 ;
vii. 流动相水相A:超纯水(pH调至2.1)
有机相B:乙腈(色谱纯)
Viii. 洗脱方式恒速
ix. 检测UV350nm;
x. 柱温25-30°C
xi. 进样量25pL 、 20pL、 lO^L或5|aL
分别取0.45 u m针头过滤器过滤后的系列标准夜进行谱图及回归曲线的测定；
(4) 待测样品在SPE装置中真空负压下过SAX-HLB固相萃取小柱，SAX及HLB固 相萃取小柱均需先经过活化处理，即先用丙酮、甲醇和超纯水预处理，滤液过柱流速 3-5mL/min;萃取完成后，移去SAX小柱，用5。/。的甲醇溶液淋洗HLB小柱，再用丙酮(含 5%甲醇)洗脱土霉素，将洗脱液水浴40'C下N2吹干，超纯水溶解，0.45um针头过滤器 过滤后在步骤(3)所述色谱条件下测定土霉素的含量；
(5) 依据色谱峰面积，利用外标法由土霉素标准溶液的回归方程计算样品中土霉素 的含量。
本发明中水相A和有机相B体积比为70: 30以流速1.5-3mL/min恒速洗脱。 本发明中采用SAX-HLB串联小柱固相萃取水样中土霉素物质。 本发明中色谱柱为C18硅胶色谱柱，能在3min内完成对一个水样的出图检测。 在样品制备时，本发明采用了离心分离法去除水样中颗粒物，离心分离具有较高的分
离效果，能够有效去除容易堵塞萃取柱的物质。
在固相萃取过程中，本发明采用强阴离子交换柱与非极性萃取柱串联的方法，水样首
先通过SAX小柱时，生活污水中的有机酸类物质都以阴离子形式存在,在通过SAX柱时可
以被去除,而土霉素可以通过SAX柱，在HLB小柱上被富集。这样既可以去除有机质的干
扰，又避免了水样前处理的大量工作，很大程度的提高检测效率。
本发明分别获得了对测定生活污水中痕量土霉素含量的高效液相色谱法有重要影响
的几个条件检测波长、柱温、流动相配比和流速等，并考察了回归方程、相关系数及线
性范围，获得较好的精密度与加标回收率。
有益效果
(1)本发明建立了一种串联固相萃取一高效液相色谱的方法测定生活污水中痕量土 霉素含量的方法，方法先进、准确，并简化了样品前处理过程；
4(2)通过对超纯水pH与流动相配比的调整，使分析方法中土霉素的色谱图出峰稳定， 峰形良好，出峰的拖尾现象消除，并能得到准确的结果。
图1为本发明实施例不同浓度土霉素标准溶液的色谱图； 图2为本发明实施例污水处理厂进出水样的色谱图； 图3为本发明实施例标准曲线。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
实施例1
1. 不同浓度土霉素标准溶液的制备
取纯度2 99%的土霉素标样，用0.1mol/L的盐酸溶液溶解少量土霉素标品，之后不 断稀释，配制不同浓度梯度在50(Vg/L 10mg/L的标准溶液；
2. 生活污水处理厂进出水样的前处理
取生活污水处理厂进出水若干在离心机上转速4500 r/min离心10 min，取上清液各 2L，在SPE装置中真空负压下过SAX-HLB固相萃取小柱，SAX及HLB固相萃取小柱均 需先经过活化处理，即先用2mL丙酮、2mL甲醇、2mL超纯水预处理，滤液过柱流速 3mL/min。萃取完成后，移去SAX小柱；用2mL5y。的甲醇溶液淋洗HLB小柱，再用3mL 丙酮(含5%甲醇)洗脱土霉素，将洗脱液水浴40'C下N2吹干，0.5mL超纯水溶解；
3. 色谱条件
色谱柱Eclipse XDB-C18 (4.6Xi50mm， 5um);柱温25°C;流速1.5mL/min;进
样量20nL;检测器紫外检测器；检测波长355 nm。流动相A:超纯水(pH2.1)， 流动相B:乙腈，体积比70: 30。
4. 分别取标准样品溶液和污水厂进出水样经0.45nm针头过滤器过滤后注入液相色谱 仪进行分析测定，由化学工作站得到标准曲线回归方程及样品的色谱图。标准样品溶液的
色谱图见图l;生活污水厂进出水色谱图见图2;标准曲线见图3;表1回归方程及相关系数
样品线性回归方程相关系数线性范围 (|ag/mL)
土霉素y= 10.331X-1.90570.9997O.l—ll
表2精密度及回收率加标浓度 样品 (ng/L)实测浓度 (ng/L)回收率 (%)平均回收率 (%)RSD (%)
176.8088.4
200160.79 169.43 152.2780.4 84.7 76.182.4±5.36.4
355.3388.8
土霉素 400367.94 329.21 360.2792.0 82.3 卯.l88.3±4.24.8
202.40101.2
600182.61 178.09 180.0291.3 89.0 卯.O92.9±5.66.0
权利要求
1.固相萃取-高效液相色谱法检测生活污水中土霉素的方法，包括(1)用0.1mol/L-0.5mol/L的盐酸溶液溶解土霉素标品，配制浓度梯度在500μg/L～10mg/L的标准溶液；(2)取生活污水在离心机上离心10min，取上清液；(3)使用HPLC仪，以超纯水/乙腈为流动相，恒速洗脱，色谱条件如下i.色谱柱Eclipse XDB-C18；ii.水相A超纯水，pH调至2.1有机相B乙腈iii.检测UV 350nm；iv.柱温25-30℃v.进样量25μL、20μL、10μL或5μL过滤后的标准液进行谱图及回归曲线的测定；(4)步骤(2)上清液在SPE装置中真空负压下过SAX-HLB固相萃取小柱，过滤后在步骤(3)所述色谱条件下测定土霉素的含量；(5)依据色谱峰面积，利用外标法由土霉素标准溶液的回归方程计算样品中土霉素的含量。
2. 根据权利要求1所述的固相萃取一高效液相色谱法检测生活污水中土霉素的方法，其特 征在于所述步骤(3)水相A和有机相B体积比为70: 30以流速1.5-3mL/min恒速洗脱。
3. 根据权利要求1所述的固相萃取一高效液相色谱法检测生活污水中土霉素的方法，其特 征在于所述步骤G)色谱柱为C18硅胶色谱柱。
4. 根据权利要求1所述的固相萃取一高效液相色谱法检测生活污水中土霉素的方法，其特 征在于用于测定生活污水中的土霉素。
全文摘要
本发明涉及固相萃取-高效液相色谱法检测生活污水中土霉素的方法，采用备有紫外检测器的液相色谱仪和C<sub>18</sub>反相硅胶色谱柱。采用了强阴离子交换柱和非极性萃取柱串联的固相萃取方法。有机流动相和调过pH值的超纯水流动相作为恒速洗脱剂。本发明建立了一种串联固相萃取-高效液相色谱的方法测定生活污水中痕量土霉素含量的方法，方法先进、准确，并简化了样品前处理过程。
文档编号G01N30/00GK101561421SQ20091005185
公开日2009年10月21日 申请日期2009年5月22日 优先权日2009年5月22日
发明者吴雪峰, 张良亮, 杨煜东, 邱丽娟, 浩 闵, 亮 陈, 刚 陈, 陈东辉, 黄满红 申请人:东华大学