专利名称：高迁移率族蛋白b1作为电离辐射生物剂量计的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于电离辐射生物剂量计，具体涉及高迁移率族蛋白Bl(High mobility group box LHMGB1)作为电离辐射生物剂量计的应用。
背景技术：
核能的和平应用以及放射性核素在医学、工业和农业等各领域的广泛应用给人类 带来了巨大的利益。核技术在造福人类的同时，也对公共安全与公众健康构成了潜在的威 胁。因此，正确估算辐射事故受照者及肿瘤放疗病人的受照剂量，有利于改进辐射防护措 施、指导临床治疗、预测病情发展。多年来辐射生物剂量估算领域已开展了大量工作，虽然 已建立了多种辐射生物剂量计，然而在实际应用中均不同程度存在耗时、费力、费用昂贵等 问题，仍不十分理想。因此，近来国内外相关实验室进行了一些新生物剂量计的研究，如 GADD45 (growth arrest and DNA damage gene 45)基因表达测定、线粒体DNA基因突变分 析等，迄今这些研究也还处于探索、尝试阶段，因而有必要寻找新型、快速、可靠的电离辐射 生物剂量指标。高迁移率族蛋白l(high mobility group box-1, HMGB1)是上世纪70年代发现的 存在于真核细胞核内的非组蛋白染色体结合蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中 迁移速度快而得名。HMGBl普遍存在于哺乳动物组织细胞中，而在胸腺、淋巴组织等组织中 呈高表达。以前人们较关注HMGBl的核蛋白功能，1999年Wang等首次报道HMGBl作为新 的、潜在的晚期炎症介质参与了脓毒症的发病过程，是内毒素致死效应的晚期重要炎症介 质。近年还发现细胞外的HMGBl可通过多种机制促进肿瘤的存活、生长和转移，参与肿瘤的 发生和发展。
发明内容
本发明目的是提供高迁移率族蛋白Bl (High mobility group box 1，HMGB1)作为 电离辐射生物剂量计的应用。为达到上述目的，本发明采用的技术方案是高迁移率族蛋白Bl(High mobility group box 1,HMGB1)作为电离辐射生物剂量计的应用。一种检测离体细胞所受的辐照剂量的方法，包括以下步骤(1)按照常规方法培养离体细胞，将离体细胞置于已知辐射强度的环境中接受辐 照，然后在两个以上时间点采集辐射照射后的离体细胞，测定其中的高迁移率族蛋白Bl的 表达水平，获得该离体细胞的接受的辐照剂量和高迁移率族蛋白Bl表达水平的关系的标 准曲线；(2)收集接受了待测剂量的辐射照射的离体细胞，测定其中的高迁移率族蛋白Bl 的表达水平，根据步骤(1)获得的标准曲线计算得到该离体细胞所受的辐照剂量。上述技术方案中，所述离体细胞选自小鼠成纤维细胞、人外周抗凝全血细胞、人 宫颈癌细胞-HeLa、乳腺癌细胞_MCF_7、人肺癌细胞-A549或正常人成纤维母细胞株GM细胞以及其它组织器官细胞样品。上述技术方案中，测定离体细胞中的高迁移率族蛋白Bl的表达水平的方法为采 用Western blot方法和HMGBl检测试剂盒测定离体细胞中的HMGBl的蛋白表达水平。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点由于离体细胞辐照后，尤其是血液在辐照后，其中HMGBl含量的增加与受到的电 离辐射剂量成正比，存在一定的剂量-效应关系，且于照射后24h即可采用ELISA法等简便 易行的方法进行快速检测，因此，HMGBl可作为辐射生物剂量计；并且可以采用HMGBl测量 人体和动物受到电离辐射辐照后的生物辐射剂量。
图1为实施例一中指数生长的L929细胞经不同剂量的X-线照射后24小时后完 成Western Blot法测定HMGBl蛋白含量；图2为实施例二中人抗凝外周血经不同量X射线照射4小时候HMGBl蛋白表达 量的变化图；图3为实施例二中人抗凝外周血经不同量X射线照射24小时候HMGBl蛋白表达 量的变化图；图4为实施例三中不同剂量6tlCo γ线引起GM细胞中HMGBl释放的剂量-效应曲 线。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述实施例一不同剂量电离辐射体外培养的小鼠成纤维细胞培养液中HMGBl蛋白释放的剂 量-效应关系(1)材料小鼠成纤维细胞株L929购于美国细胞收藏中心(ATCC)，并由本实验室 保存和培养；RPMI 1640培养基干粉，小牛血清，胰酶购自Gibco公司；amicon超滤离心管 购自美国Millipore公司。标准蛋白质分子量、SDS-PAGE上样缓冲液、RIPA蛋白裂解液、 TE电泳缓冲液、IOX转膜液、30% Acry-BiS、TriS-Hcl、过硫酸铵(AP)、SDS、四甲基乙二胺 (TEMED)购自江苏碧云天生物技术研究所；二甲基亚砜(DMSO)、琼脂糖和Tween-20来自上 海高科技生物工程有限公司；抗HMGBl等抗体购自美国Santa Cruzs生物技术公司。人类 HMGBl蛋白ELISA检测试剂盒购自上海西悦生物科技有限公司。(2)细胞培养L929细胞培养于含10 %小牛血清，谷氨酸胺及100万U/L青霉素 和链霉素的RPMI 1640培养基。细胞置于5% CO2, 37°C培养箱内培养，每2-3天传代1次， 取对数生长期细胞用于实验。(3)照射将步骤(2)所得细胞置于直线加速器下，射线性质为高能6兆伏χ-线， 照射野为IOcmX IOcm，源皮距为100cm，剂量率为200CGy/min。照射时培养皿面上覆盖 1. 5cm厚等效蜡板以调整照射剂量。(4)Western Blot法测定小鼠成纤维细胞培养液中HMGBl蛋白的量收集等量细 胞培养液并转至15ml的amicon超滤离心管中离心(4000Rcf/m) 20分钟进行样品浓集，采
4用分光光度计检测样品蛋白含量。各取等量样品加入蛋白上样缓冲液(5X)混勻，于100°C 加热5分钟，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至醋酸纤维膜上。膜采用封闭液(5%脱脂奶粉， 1 X T-BST缓冲液)封闭1小时。T-BST缓冲液洗涤3次，并加入一抗HMGBl (1 500稀释)， 室温孵育1小时。T-BST缓冲液洗膜3次，加入二抗(1 1000稀释)孵育1小时。T-BST 缓冲液洗膜3次，最后加ECL发光剂，显影、定影，胶片洗涤和干燥后，对所得结果进行扫描 分析。结果如图1所示，指数生长的L929细胞经0，3，6Gy的χ -线照射后24小时采用 超滤离心法收集细胞培养液上清，采用Western Blot法检测其中HMGBl蛋白的含量，结果 显示与未受电离辐射对照组相比，经3Gy χ -线照射后培养液中HMGBl含量增加了 11 %， 6Gy χ -线照射后HMGBl含量增加了 37 %。实验结果说明电离辐射后体外培养细胞释放至胞 外的HMGBl蛋白量随照射剂量的增加相应增加，与照射剂量正相关，呈现出一定的剂量_效 应关系。实施例二不同剂量电离辐射人外周抗凝全血中HMGBl蛋白释放的剂量-效应关系(1)人外周血采集，实验用人抗凝外周静脉血来自3例健康献血员，1男2女，年龄 为30岁左右，要求不吸烟，不饮酒，身体健康，无慢性病史，半年内无受照和炎症疾病。每 人各采血20ml，分装于6个小瓶，在室温分别接受χ -射线照射0，3，6Gy，照后于37°C静置 4h、24h收集血浆样本。(2) ELISA法测定步骤(1)所得人外周抗凝全血样本中HMGBl蛋白的量操作步骤 参见试剂盒使用说明，主要过程为各取100 μ 1样品加入酶标板加样孔，混勻后于37°C条 件下作用2小时，弃去样品液，充分洗涤4-6次。各孔加入一抗溶液100μ 1，37°C作用1小 时，洗涤加样孔4-6次。加入酶标抗体100μ1，37 作用30分钟，充分洗涤4-6次。各孔加 入100 μ 1底物反应液，37°C作用15分钟，加入终止液各100 μ 1，于酶标仪上读取450nm波 长吸光值，并对所得结果进行分析。(3)人抗凝外周血经0，3，6Gyx-线照射后于37°C静置4小时，离心获取血浆， 采用ELISA法测定HMGBl蛋白表达，其结果如图2所示，与未受照射的对照组血液样品相 比，经3Gy χ -线照射后4h人抗凝外周静脉血中HMGBl含量已出现不同程度的增加(增幅 分别为17. 6%，5. 4%,10.9% ),6Gyx-线照射后HMGBl含量增加则更明显(增幅分别为 25. 2%,63. 4%,52. 7% )。人抗凝外周血经0，3，6Gy χ -线照射后于37°C静置24小时，离心获取血浆，采用 ELISA法测定HMGBl蛋白表达，其结果如图3所示，χ -线照射后24h人抗凝外周静脉血中 HMGBl含量仍检测到不同程度的增加3Gy照射组增幅分别为23%，7%，1 %，6Gy照射组增 幅分别为50%,28%,25%0这些实验结果说明受到的电离辐射后早期即可检测到人抗凝外周静脉血中HMGBl 蛋白的释放量的增加，且与照射剂量成正比；随着照射后时间的延长，HMGBl依赖于照射剂 量的释放量的增加仍稳定存在；并且上述HMGBl在血液中的含量变化可采用简便易行的 ELISA方法进行检测。实施例三(1) GM细胞培养在含10 %小牛血清，谷氨酸胺及100万U/L青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基。(2)采用不同剂量水平的6tlCo γ线照射步骤⑴所得GM细胞培养液，按照实施例 二的方法，采用ELISA法检测辐照后细胞培养液中HMGBl蛋白含量的变化照后24h直接收 集细胞培养液上清，按照实施例二的方法，采用ELISA法对其中HMGBl含量进行检测，结果 如表1、图4所示。如表1所示，培养液中HMGBl含量随照射剂量的增加而逐渐增加与未受照射对照 组相比，各照射剂量组HMGBl含量均显著增加(0. 5Gy, IGy, 2Gy和4Gy照射组P < 0. 05,8Gy 照射组P <0.01)。表1不同剂量60Co γ线照射后GM细胞培养液中HMGBl蛋白释放量
权利要求
高迁移率族蛋白B1作为电离辐射生物剂量计的应用。
2.一种检测离体细胞所受的辐照剂量的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)按照常规方法培养离体细胞，将离体细胞置于已知辐射强度的环境中接受辐照，然 后在两个以上时间点采集辐射照射后的离体细胞，测定其中的高迁移率族蛋白Bl的表达 水平，获得该离体细胞的接受的辐照剂量和高迁移率族蛋白Bl表达水平的关系的标准曲 线.一入 ，(2)收集接受了待测剂量的辐射照射的离体细胞，测定其中的高迁移率族蛋白Bl的表 达水平，根据步骤(1)获得的标准曲线计算得到该离体细胞所受的辐照剂量。
3.根据权利要求2所述检测离体细胞所受的辐照剂量的方法，其特征在于，所述离体 细胞选自小鼠成纤维细胞、人外周抗凝全血细胞、人宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、人肺癌细胞 或正常人成纤维母细胞。
全文摘要
本发明属于电离辐射生物剂量计，具体涉及高迁移率族蛋白B1(High mobility group box 1，HMGB1)作为电离辐射生物剂量计的应用，由于离体细胞辐照后，尤其是血液在辐照后，其中HMGB1含量的增加与受到的电离辐射剂量成正比，存在一定的剂量-效应关系，且于照射后24h即可采用ELISA法等简便易行的方法进行快速检测，因此，HMGB1可作为辐射生物剂量计；并且可以采用HMGB1测量人体和动物受到电离辐射辐照后的生物辐射剂量。
文档编号G01T1/02GK101975964SQ20101025929
公开日2011年2月16日 申请日期2010年8月23日 优先权日2010年8月23日
发明者樊赛军, 焦旸 申请人:苏州大学