专利名称：甲胎蛋白检测用丝网印刷电极传感器的制作方法
技术领域：
甲胎蛋白检测用丝网印刷电极传感器技术领域：
本实用新型涉及一种用于检测肿瘤标志物-甲胎蛋白的磁性复合纳米微粒修饰电极传感器，该传感器器件是基于抗体/抗原特异性反应的丝网印刷电极，属于分析测试领域。
背景技术：
甲胎蛋白(a-fetoprotein，简称AFP)是由胎儿肝细胞合成、胚胎发育早期的一种主要血清蛋白，成人由肝细胞产生。正常成人血清中AFP含量甚少，但大多数原发性肝癌和畸胎瘤病人血清中AFP含量较高，而且其含量与病情的严重程度密切相关。因此血清中AFP含量不仅可作为原发性肝癌和畸胎瘤的早期诊断指标之一，也可作为疗效观察和愈后判断的指标，血清中AFP的升高对原发性肝癌诊断具有重要意义，具有确立诊断、早期诊断、鉴别诊断的作用。目前临床检测血清中AFP大多用放射免疫法(简称RIA)、化学发光法(简称CL)、 时间分辨免疫荧光分析法(简称TRFIA)以及酶联免疫吸附试验法(简称ELISA)。RIA法虽然有较好的灵敏度，但稳定性欠佳，且有放射性污染之嫌，操作时间长。CL法虽然有较好的灵敏度和稳定性，但目前试剂和仪器全部为进口产品，成本相对较高。TRFIA法需要稀土离子标记抗原或抗体，标记物制备复杂、耗时且由于各批次检测结果均采用同一标准曲线定量，所以标准曲线要求很高。ELISA法灵敏度及稳定性不够好，假阳性较高。电化学免疫传感器结合了电化学检测的高灵敏度和免疫分析的高特异性，具有样品用量小、检测快速、结果准确等突出优点，已广泛用于肿瘤标志物检测。基于丝网印刷电极(简称SPCEs)构建的电化学免疫传感器，具有能够实现批量生产、电极集成、样品用量小、成本低且一次使用可抛弃的优点，避免了共用同一电极检测多个样本时的交叉干扰问题，为推动安培免疫传感器走向廉价、大规模应用提供了一种具有前景的途径。纳米修饰电化学传感器由于其卓越的灵敏度引起人们的广泛关注。碳纳米管(简称CNTs)具有比表面积大，明显促进生物分子的电子传递、扩增响应电流以及电化学催化等性质；铁磁性氧化物粒子形成的核壳结构纳米复合材料-Fe304/Au (金磁复合纳米微粒)，具备Au表面生物分子快速标记和Fe3O4超顺磁性的双重特质，在生物物质分离及医学检测方面具有重要的应用价值。Nafion是一种全氟化高分子聚合物阳离子交换剂，由于其优良的成膜、溶解分散、抗干扰能力及离子交换等特性，已广泛用于生物传感器表面敏感膜构建。SPCEs与电化学检测技术联用将具有分析速度快、信息量大、试剂消耗少、污染小、 操作费用低、仪器简便以及检测速度和灵敏度俱佳等优点。目前，在SPCEs技术领域，利用磁性复合纳米微粒修饰SPCEs来快速、准确检测肿瘤标志物-AFP的相关技术和方法尚未见报道。
实用新型内容本实用新型需解决的技术问题是，在丝网印刷技术这样一个总的技术框架内，研发出一种应用于快速、准确检测肿瘤标志物-AFP的丝网印刷电极传感器。根据上述的技术问题，设计了一种丝网印刷电极传感器，其包括一基片、设于基片上的反应腔、位于反应腔内的三个相互独立设置的电极和设于基片上一端的接头，所述三个电极分别为工作电极、对电极和参比电极，三个电极分别通过三条相互绝缘的连接引线与接头相连。所述三个电极均采用丝网印刷技术于陶瓷基底的SPCEs表面印制，集成于反应腔中，三电极材料以及形状均可以任意选定，材料可以是碳、银以及金等等；任意选定的形状例如方片形状、半圆形片状、条形状等等。但是，出于尽量少用待测液样以及降低试剂损耗等方面的考虑，所述电极形状最好均选用毫米级的宽度。所述反应腔是用于肿瘤标志物-AFP抗体、抗原等生物蛋白质发生免疫反应的场所，反应腔形状可以是任意选定的形状，圆形空腔状、方柱形空腔状、椭圆形空腔状等等。本实用新型SPCEs传感器当然还可以进一步包括一些附件，所述附件例如电化学工作站以及电极连接头等等，所述电化学工作站的技术含义以及电极连接头的技术含义是公知的。作为本实用新型进一步改进，所述工作电极的数量是一个，且该工作电极的表层修饰有磁性复合纳米微粒。磁性复合纳米颗粒修饰有助于大幅度地扩展工作电极的有效工作界面并扩增响应电流，磁性颗粒有利磁场条件下电极表面的迅速更新，并且，进一步地， 将电子媒介体包埋于Nafion膜中还使得该工作电极具备良好的抗干扰性。磁性复合纳米颗粒溶解于一定质量分数的Nafion溶液中并在电极表面成膜，以及，将包被肿瘤标志物 AFP抗原的i^304/Au微粒通过外加磁场吸附于SPCEs表面的Nafion膜，Naf ion膜与包被肿瘤标志物AFP抗原的!^e3O4Au微粒在电极表面可以浑然一体。作为本实用新型进一步改进，所述工作电极表面上覆盖有一层Nafion敏感膜。所述Nafion膜中复合纳米颗粒修饰的工作电极，其中复合纳米颗粒(CNTs浓度以及电子媒介体(普鲁士蓝、二茂铁、等)浓度)可以根据响应电流大小以及检测限的需要而优化。所述 Nafion膜表面采用磁场吸附的包被肿瘤标志物AFP抗体的i^304/Au纳米颗粒的粒径不限， 所述纳米颗粒的直径可以是根据需要设定任意的尺寸，但是，所述纳米颗粒的优选直径范围是介于10纳米至50纳米之间。作为本实用新型进一步改进，所述三条连接引线均采用导电银浆印制而成，各表
面覆盖有绝缘层。作为本实用新型进一步改进，所述基片与反应腔位置对应的底部贴附有一强磁铁，用来控制反应腔中金磁微粒在电极表面的吸附与脱附，达到迅速更新电极表面的目的。与现有技术相比，本实用新型的优点是在一块基片上集成了三个电极，其集成构造的结构特点以及工作电极的复合纳米微粒修饰特异形态决定了该电极的使用有助于减小样液用量，有利于加快AFP诊断效率，有助于降低AFP诊断费用。
图1是本实用新型实施方式丝网印刷电极传感器的构造轮廓示意图；图2是本实用新型实施方式丝网印刷电极传感器与电化学工作站联用时的整体结构示意图；图3是本实用新型实施方式丝网印刷电极传感器检测不同浓度AFP抗原时的电化学电流响应图。
具体实施方式
以下结合附图和实施方式对本实用新型作进一步说明。如图1所示，本实用新型SPCEs传感器的结构中包括组合在一起的三电极，该三个电极分别是装设位置不同的工作电极1、参比电极2和对电极3，该三个电极均集成于反应腔4中。反应腔4设置于基片的一端。该反应腔4内容纳了工作电极1、参比电极2和对电极3，该工作电极的表层修饰有磁性复合纳米微粒，磁性复合纳米微粒溶解于一定质量分数的Nafion溶液中并在电极表面成Nafion敏感膜。反应腔4的容积大小可以根据需要随意设定，实际操作中为了降低样品耗费，一般设置为25yL 35yL。三个电极的一端经由装设位置不同但都起到导电作用的采用银浆印制的三条连接引线5、6、7分别通过电极连接头9与电化学工作站11连接，如图2。三条连接引线5、6、7的表面覆盖了一薄层的绝缘膜8，防止电解质溶液将三电极联通，造成短路。基片与反应腔位置对应的反面(也即基片与反应腔4对应的底部)附贴有一强磁铁10， 强磁铁10用来控制电极反应腔中包被有AFP抗体的金磁微粒在电极表面的吸附与脱附，达到迅速更新电极表面的目的。本实用新型SPCEs传感器一次性免疫分析法测定AFP抗原浓度的具体检测步骤如下1、合成包被AFP抗体的Fe304/Au纳米颗粒。在5mL 0. 02mol 'L^1Tris-HCl缓冲液的离心管中加入5 μ L Img .HiL-1Fe3CVAu溶液与10 μ L Img 'mL^AFP抗体，35°C下振荡反应 20min后，将离心管置于磁性分离器中磁性分离3min，弃上清液，重新加入5mL Tris-HCl缓冲液和5 μ L牛血清蛋白溶液(w = 0. 25%)室温下搅拌lh，以封闭未包被AFP抗体的Fe3O4/ Au表面，磁性分离，弃上清。如此操作重复3次，在Fe3O4Au中加入IOmLTris-HCl缓冲液， 轻摇重悬磁粒，制得Fe3O4Au包被AFP抗体溶液(Fe304/Au-AFP)，冰箱中4°C保存备用。2、复合纳米微粒修饰SPCEs免疫电极的构建滴加含Nafion (w = 0. 2 % ), 0. 6mg · mL^CNTs 和 0. Imol · L—1 二茂铁(简称 Fe) 的二甲苯溶液5 μ L均勻涂覆于SPCEs的工作电极表面，待其自然干燥得到SPCEs | CNTs/Fc/ Nafion电极；继续滴加5 μ L Fe3O4Au-AFP抗体溶液，在电极底部加一块磁铁，借助磁力将 Fe3O4Au-AFP抗体吸附于电极表面，自然晾干即得SPCEs免疫电极。需要更新电极表面时， 移去磁铁并用ρΗ = 6. O磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗电极表面，即可实现电极再生。3、在SPCEs免疫电极的25 μ L反应腔中加入20 μ L ρΗ = 6. 0PBS，采用示差脉冲伏安(DPV)法检测其还原峰电流(I。)。4、在上述电极反应腔中再加入1 μ L不同浓度的AFP抗原溶液，并在35°C下温育 10min，DPV测定还原峰电流(I)。由于溶液中AFP抗原与电极表面AFP抗体发生免疫反应， 当被测AFP抗原浓度越高时DPV响应电流越小。这是因为AFP抗原浓度提高后，溶液中恒量的AFP抗体与电极表面AFP抗原结合形成免疫复合物机会增大，对电子媒介体Fc的电子传递阻碍增加，因此DPV还原峰电流随着AFP抗原浓度的增加不断下降。5、DPV还原峰电流下降百分比与被测AFP抗原在一定浓度范围内成线性关系，采用标准曲线法进行AFP抗原定量。图3为不同浓度的样品加入反应腔中采用一次性免疫分析法测定时的电化学DPV响应图。测定结果表明随着AFP抗原浓度的不断增加(a f)，DPV响应电流逐渐减小，电流下降百分比与AFP抗原浓度之间存在紧密的正相关性，可以用于定量分析。 以上所述的仅是本实用新型的实施方式，在此应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型创造构思的前提下，还可以做出改进，但这些均属于本实用新型的保护范围。
权利要求1.一种丝网印刷电极传感器，其特征在于所述丝网印刷电极包括一基片、设于基片上的反应腔、位于反应腔内的三个相互独立设置的电极和设于基片上一端的接头，所述三个电极分别为工作电极、对电极和参比电极，三个电极分别通过三条相互绝缘的连接引线与接头相连。
2.根据权利要求1所述的丝网印刷电极传感器，其特征在于所述工作电极的数量是一个，且该工作电极的表层修饰有磁性复合纳米微粒。
3.根据权利要求2所述的丝网印刷电极传感器，其特征在于所述工作电极表面上覆盖有一层Nafion溶液形成的敏感膜。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的丝网印刷电极传感器，其特征在于所述三条连接引线均采用导电银浆印制而成，各表面覆盖有绝缘层。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的丝网印刷电极传感器，其特征在于所述基片与反应腔位置对应的底部贴附有一强磁铁。
专利摘要本实用新型提供了一种甲胎蛋白(AFP)检测用丝网印刷电极传感器，所述丝网印刷电极包括一基片、设于基片上的反应腔、位于反应腔内的三个相互独立设置的电极和设于基片上一端的接头，所述三个电极分别为工作电极、对电极和参比电极，三个电极分别通过三条相互绝缘的连接引线与接头相连。本实用新型优点是有利于加快AFP诊断效率，有助于降低AFP诊断费用。
文档编号G01N27/327GK202041497SQ201120016568
公开日2011年11月16日 申请日期2011年1月11日 优先权日2011年1月11日
发明者李元祥, 杨欣, 袁吉, 陈迪钊 申请人:怀化学院