专利名称：一种快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程中病毒检测技术领域，特别涉及一种快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法。
背景技术：
番茄是我国主要的蔬菜品种之一，在全国各蔬菜产区均有大面积的种植，而且在蔬菜周年供应中占有非常重要的地位。随着温室大棚蔬菜种植技术的推广以及蔬菜反季节栽培经济效益的提高，温室番茄栽培面积连年增长。与此同时，其病害的发生也呈现逐步加重的趋势番茄花叶病毒病(Tomato mosaic virus,TMV)和黄瓜花叶病毒病(Cucumber mosaic virus, CMV) 一直是番茄生产中的主要病毒病，但近年来，在番茄主产区相继发现了一种新的病毒病一番茄黄化曲叶病毒病。番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus, TYLCV)属于双生病毒科iPeminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begoinovirus)，主要通过烟粉虱iBemisia tabaci)传播，可以侵染茄科、豆科等多种植物，是分布广泛的世界性番茄病毒之一。由 TYLCV引起的番茄黄化曲叶病毒病是一种毁灭性病害，自1964年发现以来，已给许多国家和地区造成了严重危害。低密度烟粉虱就可以导致病毒扩散与流行，且可以终生传毒。番茄在开花前感染黄化曲叶病毒病造成的减产幅度很大，一般减产在80%以上，严重的甚至绝收，坐果后染病会有一定的产量，但果实品质很差。番茄植株感染病毒后，初期主要表现为生长点叶片叶缘先变黄色，后整个叶片黄化，生长迟缓甚至停滞生长，茎节间明显变短， 植株矮化现象明显，叶片变小变厚、有褶皱、叶缘向上卷曲，叶质脆硬，这些症状主要表现在植株上部叶片上，下部老叶症状不明显；如果在苗期染病则植株严重矮化，无法正常开花结果；在生长发育后期染病植株仅上部叶片和新芽表现症状，但坐果数量明显减少，果实膨大速度慢、果实小，成熟期果实着色不均勻是该病在果实上的表现症状，果实产量和商品价值均大幅度下降，经济效益受到严重损失。此病一旦发生，除了砍掉染病的植株，尚未寻找到有效诊治和防止病害扩散的方法，而且将会给当地的番茄生产带来巨大的损失，因此能否有效及时地诊断番茄病害已成为制约番茄高产的关键因素。番茄黄化曲叶病毒病在全世界广泛分布，目前至少有39个国家的棉花、木薯和番茄等作物正在遭受此病毒的毁灭性危害，因而成为各国学者的研究热点。近年来，番茄黄化曲叶病毒病在我国的上海、广西、陕西、云南、江苏、浙江、重庆、广东等地广泛发生，并对上述地区的番茄生产构成了严重威胁，而且有向北方扩展的可能性和趋势。2007年10月河南开封市开封县1000多亩温室番茄普遍发生病毒病，症状和番茄黄化曲叶病毒病相同，毁种面积大约占五分之一，勉强没有毁种的大棚预计减产都在30% ；2007年11月山东济宁报告温室番茄发生疑似的番茄黄化曲叶病毒病，另外，自2005年以来在山东潍坊、菏泽及寿光等部分地区也发现类似的病毒病症状。可见对于保护地番茄种植地区来说，建立长期有效的番茄病毒检测体系，完善检测技术已是迫在眉睫，要严防该病发生，如若控制不当，将造成灾难性的后果。ITLCV的早期诊断主要依赖于感病作物的症状，但症状往往随着土壤、生长条件和
3气候的变化而出现差异；加之基层农技人员对该番茄病害的症状了解得不够清楚，易于与其他番茄病害产生混淆，从而误诊误治，延误病情，甚至造成病害的大面积传播。因此，寻找一种大众型、经济型、实用型、快捷型的检测方法显得尤为重要。目前，植物病毒检测的主要方法是以PCR为基础的分子生物学检测法和以ELISA 为代表的免疫学检测法。虽然PCR法是业界公认的准确性比较高的检测方法，但该法专业性强、技术含量高，检测试剂昂贵，而且还需要PCR仪等贵重仪器，造成检测成本居高不下， 因此，只能局限在实验室内进行专业检测，难以作为一种常规检测技术进行推广应用。运用血清学检测是一种既准确直观又经济简便的途径，最经典的方法当属Clark 和Adams于1977年建立的双抗体夹心法。1976年由Voller、Clark和Adanls引入植物病毒的检测。它将酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合，既保持了酶催化反应的敏感性，又保持了抗原抗体反应的特异性，因而极大的提高了灵敏度； 同时它又是一种非均相分析过程，即在反应中的每一步之后都有洗涤过程，从而排除了未反应物质的干扰。现在该法被普遍应用于各种植物的病毒检测上。Ellis采用该法进行了 PVY的鉴定和PVY血清型的地理分布工作；崔荣昌等运用双抗体夹心法对PVX°，PVYn, PVA, PVS, PVM, PLRV和TRV，进行了检测，并首次查明了黑龙江省内存在PVYn和PVM病毒；杨元军等通过该技术检测了单株组培苗不同茎段的PVX、PVY病毒浓度。研究结果表明运用 DAS-ELISA方法(酶联免疫吸附测定)检测病毒，特异性强，重复性好，灵敏度高，非常适合大规模的检测。但在国内外尚未见应用DAS-ELISA技术来检测番茄黄化曲叶病毒的报道。据报道，病毒外壳蛋白具有良好的抗原特异性。利用基因工程技术克隆病毒外壳蛋白，并以此为抗原制备抗血清，能够克服常规途径的诸多困难，已成为病毒抗血清制备的新途径，该途径现成功应用于多种植物病毒的血清学检测，但关于番茄黄化曲叶病毒的相关研究还比较少。
发明内容
为了解决以上无快捷、准确检测番茄黄化曲叶病毒方法的问题，本发明提供了一种大众、经济、实用、快捷的使用酶联免疫吸附法快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法。本发明是通过以下方式实现的
一种快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法，包括以下步骤
(1)从感染黄化曲叶病毒病的番茄病叶中提取总DNA，以此为模板通过PCR扩增获得 TYLCV-CP基因的特异性DNA片段，所用引物为
TYCPl :5，-GCGGAATTCATGTCGAAGCGACCAGGCGAT-3‘下划线为^boRI 酶切位点， TYCP2 :5，-GCGCTCGAGATTTGATATTGAATCATAG-3‘下划线为损ο I 酶切位点；
(2)将ITLCV-CP基因片段与表达载体pET-3h连接，转化受体菌获得抗性菌落，筛选出阳性克隆，然后在含有0. 1-0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的条件下进行诱导表达，离心收集菌体，菌体破碎后纯化目的蛋白；
(3)以纯化的目的蛋白为抗原免疫家兔，效价为1:16000时取血收集抗血清，将抗血清纯化，获得纯度为95-98%，浓度为20-24. 3mg/mL的抗体IgG ；
(4)用戊二醛一步法对纯化的抗体进行碱性磷酸酶标记，获得碱性磷酸酶标记抗体 IgG-AP，其中 IgG 浓度为 0. 822-1. 145mg/mL ；
(5)以健康的幼苗为阴性对照，以感病幼苗为阳性对照，纯化的IgG进行包被后与碱性
4磷酸酶标记抗体IgG-AP对待检样品进行DAS-ELISA检测，最后加入PNPP配成的底物溶液进行显色；其中IgG包被浓度为6. 25 μ g/mL，酶标抗体稀释度为1:400 ；IgG包被条件为4°C 过夜，封闭时间为60min，酶标抗体作用时间为120min，底物显色条件为37°C条件下30min。步骤(4)对纯化的抗体进行碱性磷酸酶标记时，将Img纯化的IgG与800IU的碱性磷酸酶混勻，加PBS缓冲液到0. 5mL ；在其混合液中加入4 μ L 25%戊二醛，室温放置2h， 每30min上下颠倒一次；4°C中用PBS缓冲液透析过夜，透析物转移至离心管中，加入5mg牛血清白蛋白(BSA)，4°C保存备用。步骤(2)纯化目的蛋白为使用蛋白纯化柱HiTrap Chelating HP纯化。抗血清纯化时使用抗体纯化柱lmL的HiTrap Protein A抗体纯化柱。步骤(2)中受体菌为 E. co7iBL21 (DE3)。底物溶液为将5mg对硝基苯磷酸二钠溶于7. 5mL的含11. 6% 二乙醇胺的pH为9. 8 的底物缓冲液中。TYLCV-CP基因的特异性DNA片段的PCR扩增的反应体系为2x Taq MasterMix 12. 5 μ LjTYCPI (10 pmol/L) 1. 0 μ L, TYCP2 (10 pmol/L) 1. 0 μ L，模板 DNA 1.0 yL，加双蒸水至终体积25. 0 μ L ；PCR反应条件为94°C变性lmin，55°C退火45s，72°C延伸45s，35 个循环，72°C继续延伸IOmin。步骤(2)中诱导表达步骤如下将获得的阳性菌落接种到LB液体培养基中，37°C 培养过夜，将该培养物以1:100的比例转入新鲜的LB液体培养基中，37°C培养至0D_为 0. 8时，分组加入IPTG使其终浓度分别为0. Immol/L、0. 3mmol/L和0. 5mmol/L, 37°C诱导表达4 h。本发明的有益效果
使用DAS-ELISA检测番茄黄化曲叶病毒，检测灵敏度高，可用于定性、定量分析，最低检测限为9. 75ng/mL ；此检测方法操作简单快速，可在数小时内完成；特异性强，重复性好， 针对番茄黄化曲叶病毒有非常明显的免疫学反应；可靠性高，其检出准确率与PCR法非常接近；检测成本低廉，试剂用量少并可以较长时间保存，非常适合大规模的常规检测。
图1为不同浓度IPTG诱导表达的SDS-PAGE检测结果图，其中，M为蛋白质分子质量标准，1和5为未加IPTG的细菌裂解物；2 4为使用p3h-CP的诱导表达产物，IPTG浓度依次为0. 1,0. 3,0. 5 mmol/L ；6为使用p28a_CP的诱导表达产物，IPTG浓度为0. 5 mmol/L ；7 为使用p22b-CP的诱导表达产物，IPTG浓度为0. 5 mmol/L ；8为使用pE2_CP的诱导表达产物，IPTG 浓度为 0. 5 mmol/L ；
图2为ITLCV-CP基因表达产物的纯化分析图，其中，M为低分子量蛋白marker ； Γ2为无IPTG诱导；3、为IPTG诱导的全菌裂解液；5为超声破碎后上清液；6为流穿收集液；7、 为目的蛋白洗脱液；
图3为重组蛋白的Western blot分析图，M为低分子量蛋白marker ；广2为目的蛋白洗脱液，3为无IPTG诱导；4为ρΕΤ-3^ι空载体；5为0. 5 mmol/L IPTG诱导的表达产物；
图4为IgG的纯化结果，M为蛋白质分子质量标准；1为未诱导的细菌裂解物2为 IPTG(0. 5mmol/L)诱导的表达产物；3为纯化的IgG ； 图5为酶标抗体活性曲线；
5图6为建立的DAS-ELISA操作步骤图； 图7为ELISA正交试验因素水平检测结果图； 图8为检测灵敏度结果图； 图9为标准抗原浓度与吸光值的相关性图； 图10为田间病样的DAS-ELISA检测结果； 图11为5个样品不同体积提取液的检测结果图。
具体实施例方式所用到的工具酶及化学试剂来源及配制方法如下
Xhol和I限制性内切酶、碱性磷酸酶购自宝生物工程有限公司，植物基因组DNA 提取试剂盒、凝胶快速纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒、Simple克隆试剂盒、蛋白定量试剂盒等购自北京全式金生物技术有限公司，蛋白纯化柱HiTrap Chelating HP (1 mL)、抗体纯化柱 HiTrap Protein A (1 mL)均购自美国 GE 公司。2x Taq MasterMix,DNA Marker、中等分子量标准蛋白购自MBI公司；抗His标签单克隆抗体、HRP标记羊抗兔IgG 购自北京康为世纪生物科技有限公司；IPTG、弗氏完全佐剂(货号F5881)、弗氏不完全佐剂 (货号F5506)、PNPP等均购自Sigma公司。LB液体培养基LB培养基胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g,950mL去离子水溶解，调节PH至7.0.用去离子水定容至1L，121°C高压下蒸汽灭菌20min。ELISA所用试剂
包被缓冲液(碳酸盐缓冲液0. 05M pH 9. 6 ) =NaCO3 1. 59g，NaHCO3 2. 9g，加蒸馏水至 1000mL。PBS 缓冲液137 mM NaCl, 2. 7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM ΚΗ2Ρ04。封闭液牛血清白蛋白(BSA) 3克溶于IOOmL的PBS中。洗涤液(PBST):Tween-20 0. 5mL 溶于 IOOOmL 的 PBS 中，混勻。抗体稀释液牛血清白蛋白(BSA) Ig溶于洗涤液至100mL。提取缓冲液2gPVP-40000，IgBSA溶于洗涤液至100mL。。底物溶液将5mg对硝基苯磷酸二钠(PNPP)溶于7. 5mL的含11. 6% 二乙醇胺的底物缓冲液(PH9.8)中。载体及宿主菌
原核表达载体pET-32a、pET-28a和pET_2^购自美国Merck公司，原核表达载体和五cWi BL21 (DE3)感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法，包括以下步骤
(1)从感染黄化曲叶病毒病的番茄病叶中提取总DNA，并以此为模板通过PCR扩增获得 TYLCV-CP基因的特异性DNA片段，其序列如序列表中序列6所示，所用引物为
TYCPl :5，-GCG GAATTCATGTCGAAGCGACCAGGCGAT-3>,下划线为 &0RI 酶切位点， TYCP2 :5，-GCG CTCGAGATTTGATATTGAATCATAG-3',下划线为损ο I 酶切位点；
(2)将ITLCV-CP基因片段与表达载体pET-3h连接，转化受体菌获得抗性菌落，筛选出阳性克隆，然后在含有0. 1-0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的条件下进行诱导表达，离心收集菌体，菌体破碎后纯化目的蛋白；(3)以纯化的目的蛋白为抗原免疫家兔，效价为1:16000时采血收集抗血清，将抗血清纯化，获得纯度为95-98%，浓度为20-24. 3mg/mL的抗体IgG ；
(4)用戊二醛一步法对纯化的抗体进行碱性磷酸酶标记，获得碱性磷酸酶标记抗体 IgG-AP，其中 IgG 浓度为 0. 822-1. 145mg/mL ；
(5)以健康的幼苗为阴性对照，以感病幼苗为阳性对照，纯化的IgG进行包被后与碱性磷酸酶标记抗体IgG-AP对待检样品进行DAS-ELISA检测，最后加入PNPP配成的底物溶液进行显色；
其中IgG包被浓度为6. 25 μ g/mL，酶标抗体稀释度为1:400 ；IgG包被条件为4°C过夜， 封闭时间为60min，酶标抗体作用时间为120min，底物显色条件为37°C条件下30min。
一、TYLCV-CP基因特异性DNA片段的扩增
步骤(1)中，使用引物TYCP1与TYCP2进行PCR扩增，以得到TYLCV-CP基因片段的具体操作步骤是本领域普通技术人员可以不花费创造性劳动能够实现的，下面列举一下其中一种操作步骤
PCR 扩增的反应体系为2x Taq MasterMix 12. 5 μ L, TYCPl (10 pmol/L) 1. 0 μ L, TYCP2 (10 pmol/L) 1. 0 μ L，模板 DNA 1.0 μ L，加双蒸水至终体积 25. 0 μ L ；
PCR反应条件为94°C变性lmin，55°C退火45s，72°C延伸45s，35个循环，72°C继续延伸 IOmin0二、TYLCV-CP基因原核表达载体的构建
步骤(2)中，将步骤(1)中的PCR产物纯化后，经I和ZAo I双酶切定向插入到同样双酶切的pET-3h、pET-28a和pET_22b载体中，转化大肠杆菌五co7iBL21 (DE3)，在分别含有20 μ g/mL氨卞青霉素(Amp)或60 μ g/mL卡那霉素(Kan)抗性的平板上进行培养，获得阳性菌落。根据/7拟S7-E2表达载体的结构特点和TYLCV-CP基因序列，设计并合成引物TYCP3 和TYCP4，PCR扩增产物直接与载体相连接，转化大肠杆菌五co7iBL21 (DE3)，在含有20 μ g/mL Amp抗性的平板上进行培养，获得阳性菌落。所用引物为
TYCP35’ -ATGTCGAAGCGACCAGGCGAT-3’ TYCP45’ -ATTTGATATTGAATCATAG-3’
分别挑取阳性克隆进行PCR和酶切鉴定(如表1所示)，将连接方向正确的重组质粒分别命名为 p3h-CP、p28a-CP, p22b_CP 和 pE2_CP。表1构建的各表达载体的比较表
权利要求
1.一种快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法，其特征是包括以下步骤(1)从感染黄化曲叶病毒病的番茄病叶中提取总DNA，以此为模板通过PCR扩增获得 TYLCV-CP基因的特异性DNA片段，所用引物为TYCPl :5，-GCG GAATTCATGTCGAAGCGACCAGGCGAT-3 ,下划线为^boRI 酶切位点，TYCP2 :5，-GCG CTCGAGATTTGATATTGAATCATAG-3',下划线为损ο I 酶切位点；(2)将ITLCV-CP基因片段与表达载体pET-3h连接，转化受体菌获得抗性菌落，筛选出阳性克隆，然后在含有0. 1-0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的条件下进行诱导表达，离心收集菌体，菌体破碎后纯化目的蛋白；(3)以纯化的目的蛋白为抗原免疫家兔，效价为1:16000时采血收集抗血清，将抗血清纯化，获得纯度为95-98%，浓度为20-24. 3mg/mL的抗体IgG ；(4)用戊二醛一步法对纯化的抗体进行碱性磷酸酶标记，获得碱性磷酸酶标记抗体 IgG-AP，其中 IgG 浓度为 0. 822-1. 145mg/mL ；(5)以健康的幼苗为阴性对照，以感病幼苗为阳性对照，纯化的IgG包被后与碱性磷酸酶标记抗体IgG-AP对待检样品进行DAS-ELISA检测，最后加入PNPP配成的底物溶液进行显色；其中IgG包被浓度为6. 25 μ g/mL,酶标抗体稀释度为1:400 ；IgG包被条件为4°C过夜，封闭时间为60min ；酶标抗体作用时间为120min，底物显色条件为37°C条件下30min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)对纯化的抗体进行碱性磷酸酶标记时，将Img纯化的IgG与800IU的碱性磷酸酶混勻，加PBS缓冲液到0. 5mL ；在其混合液中加入4 μ L 25%戊二醛，室温放置2h，每30min上下颠倒一次；4°C中用PBS缓冲液透析过夜，透析物转移至离心管中，加入5mg牛血清白蛋白，4°C保存备用。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(2)纯化目的蛋白为使用蛋白纯化柱 HiTrap Chelating HP 纯化。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于抗血清纯化时使用抗体纯化柱1mL 的HiTrap Protein A抗体纯化柱。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(2)中受体菌为 B. co7iBL21 (DE3)。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于底物溶液为将5mg对硝基苯磷酸二钠溶于7. 5mL的含11. 6% 二乙醇胺的pH为9. 8的底物缓冲液中。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于TYLCV-CP基因的PCR扩增反应体系为:2x Taq MasterMix 12. 5 μ L, 10 pmol/L 的 TYCPl 1.0 μ L，10 pmol/L 的 TYCP2 1.0 μ L，模板DNA 1. 0 μ L，加双蒸水至终体积25. 0 μ L ；PCR反应条件为94°C变性lmin，55°C 退火45s，72°C延伸45s，35个循环，72°C继续延伸IOmin。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(2)中诱导表达步骤如下将获得的阳性菌落接种到LB液体培养基中，37°C培养过夜，将该培养物以1:100的比例转入新鲜的LB液体培养基中，37°C培养至0D_为0. 8时，分组加入IPTG使其终浓度分别为0. Immol/ L、0. 3mmol/L 和 0. 5mmol/L, 37°C诱导表达 4 h。
全文摘要
本发明涉及基因工程中病毒检测技术领域一种快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法从病叶总DNA中克隆得到TYLCV-CP基因片段，与pET-32a连接转化受体菌，对阳性菌落诱导表达并纯化出目的蛋白；免疫家兔制备抗血清，对纯化的抗体进行碱性磷酸酶标记，使用DAS-ELISA方法对待检病株进行检测。本发明检测番茄黄化曲叶病毒的方法，其灵敏度高，可用于定性、定量分析，最低检测限为9.75ng/mL；操作简单快速，可在数小时内完成；特异性强，重复性好，针对番茄黄化曲叶病毒有非常明显的免疫学反应；可靠性高，其检出准确率与PCR法非常接近；检测成本低廉，试剂用量少并可以较长时间保存，非常适合大规模的常规检测。
文档编号G01N21/31GK102426234SQ20121000061
公开日2012年4月25日 申请日期2012年1月4日 优先权日2012年1月4日
发明者乔宁, 刘永光, 国家进, 李美芹, 王兴翠, 竺晓平 申请人:山东农业大学, 山东省蔬菜工程技术研究中心, 潍坊科技学院