专利名称：氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水产品中氯霉素残留检测用试剂盒，尤其是一种操作简单、快捷、成本低廉、灵敏度高的氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒。
背景技术：
氯霉素是一种广谱抗生素，曾经被广泛应用于水产养殖业。但是，氯霉素存在着严重的毒副作用，能引起人的再生障碍性贫血，新生儿、早产儿灰色综合征等；低浓度的残留可引起人体内细菌的抗药性，对人体健康存在潜在的威胁。为此，欧盟对进口水产品中氯霉素的残留量定为O. Iyg /kg，美国FDA对进口水产品中氯霉素的残留量定为O. 3yg /kg。目前对水产品中氯霉素残留的检测方法主要有气象色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱质谱联用技术(LC-MS)、酶联免疫检测(ELISA)，气象色谱法、高效液相色谱法、色谱质谱联用技术均能够满足检测需要，但是其设备昂贵、操作复杂。ELISA法具有检测快捷、成本低廉等优点，但是，却存在着检测灵敏度低的缺点。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种灵敏度高高、检测快捷、成本低廉的氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒。本发明的技术解决方案是一种氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于包含酶标板及如下试剂· 酶标板氯霉素与牛血清白蛋白偶联物作为抗原包被于96孔酶标板中，包被抗原浓度为 5 μ g/ml ；
试剂I :氯霉素单克隆抗体，浓度为1:8000 ;
试剂II :辣根过氧化物酶标记兔抗鼠抗体，浓度为1:1000 ；
试剂III :氯霉素标准品，浓度分别为0ng/ml、0. 01ng/ml、0. lng/ml、lng/ml、10 ng/ml、
20ng/ml ；
试剂IV :含有体积分数为O. 05%吐温-20的pH7. 4,0. 01mol/L的磷酸盐缓冲液；
试剂V :鲁米诺溶于O. lmol/L的NaHCO3,形成浓度为O. 01mol/L的发光液A ；
试剂VI :体积分数30%的H2O2溶于pH8. 8的HCl-Tris溶液，形成发光剂B。使用本发明可以将抗体与抗原结合的高度特异性与酶催化的高效性相结合，对样品中氯霉素残留量进行化学发光酶联免疫检测。本发明分析灵敏度为0. 08ng/ml，线性检测范围为0. Of 20ng/ml，变异系数2. 6^9. 5，回收率为87°/Γ 14%，与红霉素、庆大霉素、甲砜霉素、土霉素的交叉反应率小于0. 1%，检测过程需I. (Tl. 5小时，具有操作简单、快捷、成本低廉、灵敏度高等优点。
图I是本发明实施例的标准曲线图。
具体实施例方式本发明的氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒包含酶标板及如下试剂
酶标板以氯霉素与牛血清白蛋白偶联物(购自广州艾柏金斯生物公司)为抗原包被于
96孔聚苯乙烯酶标板上，包被抗原浓度为5 μ g/ml ;是用pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液对抗原进行稀释，按100 mL/孔进行包被，即4°C过夜(12h)，次日以pH值为7. 4的磷酸盐洗涤液进行洗涤，拍干，以250 mL/孔含体积分数2%的BSA封闭液封闭2 h后，用洗液洗涤，干燥后存放于4°C冰箱待包装测试盒用。试剂I :氯霉素单克隆抗体(购自广州艾柏金斯生物公司)，浓度为1:8000 ；
试剂II :酶标记物，即辣根过氧化物酶标记兔抗鼠抗体(购自上海生工生物公司)，浓度为 1:1000 ；试剂III :氯霉素标准品，浓度分别为0ng/ml、0. 01ng/ml、0. lng/ml、lng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml ；
试剂IV :含有体积分数为O. 05%吐温-20的pH7. 4,0. 01mol/L的磷酸盐缓冲液；
试剂V :鲁米诺溶于O. lmol/L的NaHCO3,形成浓度为O. 01mol/L的发光液A ；
试剂VI :体积分数30%的H2O2溶于pH8. 8的HCl-Tris溶液，形成发光剂B。使用本发明实施例进行氯霉素化学发光酶联免疫检测程序如下
(I)样品(水产品)处理
称取I. 5±0. 05g的样品均质物至离心管中，加入I. 5ml的去离子水充分混匀再加入3ml乙酸乙酯，震荡5min，室温4000r/min离心lOmin。取2ml上层液体50 60 0C空气流吹干，用0. 5ml正己烷溶解干燥物，用0. 5ml复溶液工作液强烈震荡混合；室温下(2(T25°C)4000r/min离心5min ;取50ml下层水相用于分析。复溶液工作液PH7.4的0.01mol/L PBS (磷酸盐缓冲液)+1%BSA (牛血清白蛋白)，即IOOml液体中加入lgBSA。(2)检测步骤
a.将本发明实施例各组分取出在室温条件下放置30min，使其恢复室温；
b.取96孔酶标板，按50ml/孔向各孔中加入试剂III(不同浓度氯霉素标准
品，每种浓度对应N孔)，随后加入试剂I 50ml/孔，振荡30s混匀后，置于37 0C孵育30min后取出；
c.洗板用试剂IV按250ml/孔加入，拍干，重复进行4 5次，每次间隔2(T30s；
d.100ml/孔加入试剂II，37°C孵育30min，取出重复c步骤洗板；
e.将试剂V与试剂VI按I:I混合后，100 ml/孔加入，进行化学发光酶联免疫检测，测得各浓度发光值，绘制标准曲线(见图I)。按照上述a'步骤，将样品替代试剂III，将测得的发光数据代入标准曲线，即可得到样品中氯霉素的含量。实验I :本发明实施例灵敏度检测
按上述检测方法同时测定10个试剂IIK氯霉素标准品0ng/ml浓度)发光值，得到样本
均数(Jf )和标准差⑶，计算:t +2&带入图I所示标准曲线，得到的数值为本试剂盒方法学灵敏度。经测定本发明实施例的灵敏度为O. 08ng/ml。实验2 :本发明实施例的精密度和回收率实验
取O. 01,0. Ulng/ml三种浓度的氯霉素加入到上述水产品组织中进行精密度和回收率检测，精密度以变异系数表示，批内变异系数和回收率以同一天内5个重复数据进行检测，批间变异系数以不同的5天5个重复数据进行检测。精密度和回收率实验结果分别如表I、表2 :
权利要求
1.一种氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于包含酶标板及如下试剂酶标板氯霉素与牛血清白蛋白偶联物作为抗原包被于96孔酶标板中，包被抗原浓度为 5 μ g/ml ； 试剂I :氯霉素单克隆抗体，浓度为1:8000 ； 试剂II :辣根过氧化物酶标记兔抗鼠抗体，浓度为1:1000 ； 试剂III :氯霉素标准品，浓度分别为0ng/ml、0. 01ng/ml、0. lng/ml、lng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml ； 试剂IV :含有体积分数为O. 05%吐温-20的pH7. 4,0. 01mol/L的磷酸盐缓冲液； 试剂V :鲁米诺溶于O. lmol/L的NaHCO3，形成浓度为O. 01mol/L的发光液A ; 试剂VI :体积分数30%的H2O2溶于pH8. 8的HCl-Tris溶液，形成发光剂B。
全文摘要
本发明公开一种操作简单、快捷、成本低廉、灵敏度高的氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒，包含酶标板及如下试剂酶标板氯霉素与牛血清白蛋白偶联物作为抗原包被于96孔酶标板中，包被抗原浓度为5μg/ml；试剂Ⅰ氯霉素单克隆抗体，浓度为1:8000；试剂Ⅱ辣根过氧化物酶标记兔抗鼠抗体，浓度为1:1000；试剂Ⅲ氯霉素标准品，浓度分别为0ng/ml、0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml；试剂Ⅳ含有体积分数为0.05%吐温-20的pH7.4、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液；试剂Ⅴ鲁米诺溶于0.1mol/L的NaHCO3，形成浓度为0.01mol/L的发光液A；试剂Ⅵ体积分数30%的H2O2溶于pH8.8的HCl-Tris溶液，形成发光剂B。
文档编号G01N21/76GK102914653SQ20121040179
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月22日 优先权日2012年10月22日
发明者张峰, 郑峻峰, 吕丽, 卢亚楠 申请人:大连海洋大学, 张峰