专利名称：快速检测烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的dot-ELISA方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明所属的领域为生物技术领域，尤其是涉及一种携带番茄黄化曲叶病毒的烟粉虱的快速检测方法及应用。
背景技术：
番爺黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)属于双生病毒科(feOTifliririt/ae)菜豆金色花叶病毒属Uiegomovirus、，该属病毒在自然条件下只能由烟粉IS,(.Bemisia iaAaci)以持久方式传播,因而又被称为粉風传双生病毒。番爺黄化曲叶病害的大规模流行往往伴随着传毒介体烟粉虱的爆发。在我国，番茄黄化曲叶病最初仅分布在海南、云南、广东和广西等省，自2006年上海和浙江先后在番茄上发现番茄黄化曲叶病毒以来，该病害在华东地区迅速蔓延开来，已在我国北京、上海、山东、新疆等18个省份的番茄上流行爆发。番茄黄化曲叶病导致番茄叶片上卷或下卷、叶片黄化、叶脉外突、植株矮化，严重时致番茄绝收。近年来，由于全球气候变暖和农业发展格局的变化，烟粉虱在我国北方地区也呈爆发趋势，使得番茄黄化曲叶病害在我国自南向北迅速扩散和蔓延开来，对番茄生产构成巨大威胁。番茄黄化曲叶病毒不能机械传播，不经卵传播，只由烟粉虱成虫以持久性方式传播，且烟粉虱一旦获毒，即终身带毒。烟粉虱传毒效率高，每株植株上只要I头带毒B型或Q型烟粉虱成虫取食，则病毒传毒率达50-55%，因此烟粉虱的爆发往往导致番茄黄化曲叶病害的大流行，在生产上造成巨大危害，经济损失严重。实际生产中，田间烟粉虱是否携带番茄黄化曲叶病毒，带毒率高低等问题往往难以掌握。近年来我国番茄黄化曲叶病毒病发生处于上升时期，暴发态势仍将延续，利用现代科学技术提高我国对于番茄黄化曲叶病毒的早期监测和预警能力迫在眉睫。以往对于烟粉虱带毒率的检测只能依赖PCR的方法，而该方法受仪器依赖性强、成本高等限制只能检测多头烟粉虱的混合样本，因而PCR方法得到的实验数据只是个粗略值，无法明确单头烟粉虱的带毒情况。另外，由于植物与昆虫的本质区别使得适用于植物的血清学方法无法应用到介体昆虫的检测中。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种快速检测烟粉虱体内携带番茄黄化曲叶病毒的方法及其应用。一种快速检测烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的dot-ELISA方法，包括如下步骤 O田间烟粉虱的采集、预处理及研磨；
2)硝酸纤维素(NC)膜准备用铅笔在NC膜外层纸上划线，使NC膜印上方格线痕迹，每格规格1X1 cm,平整放入培养皿中央；
3)点样吸取研磨的烟粉虱研磨液2μ ,点样于NC膜的格子中央；4)封闭点样后，将NC膜静置晾干10分钟，使用按5g脱脂奶粉加100 mL PBST缓冲液(含O. 05% Tween-20的O. 01 mol/L PBS)的比例配制得到5%的脱脂奶粉封闭，37°C静置.O. 5-1小时；
5)加一抗加入中国专利申请号为201210004197.7的番茄黄化曲叶病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体用5%的脱脂奶粉1:2000倍稀释，37°C孵育I小时；
6)洗涤弃液体，NC膜用PBST缓冲液摇动洗脱5次，每次3分钟；
7)加酶标二抗弃洗脱液，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗(A4416Sigma), 二抗用5%的脱脂奶粉1:1000倍稀释，37°C孵育I小时；
8)洗涤弃液体，NC膜用PBST缓冲液摇动洗脱5飞次，每次5分钟；
9)显色弃洗脱液，将NC膜用滤纸吸干或静置晾干，加入TMB显色液(W4121Promega)显色，避光静置5 10分钟；
10)终止反应待NC膜上的样品呈现蓝色而阴性对照未显色时弃显色液终止反应；
11)记录结果ddH2O浸泡NC I吴，晚干后记录结果。所述的田间烟粉虱的采集、预处理及研磨包括如下步骤
1)烟粉虱采集从大田中用吸虫器采集捕获烟粉虱；
2)烟粉虱存放95%的酒精中室温存放；
3)烟粉虱预处理移液枪吸掉95%的酒精，ddH20清洗3遍，去掉酒精；
4)烟粉虱研磨用毛笔蘸取单头烟粉虱，置于干净的封口膜上，室温晾干5分钟；晾干后，每头烟粉虱滴加2 μ L 0.05 mol/L PBS缓冲液，用O. 5 mL离心管底磨碎至肉眼不能看到明显组织。一种快速检测烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒dot-ELISA试剂盒，包括以下步骤
1)试剂盒中主要试剂与材料
O.05 mol/L PBS10 ml
单克隆抗体O. I ml
HRP标记羊抗鼠IgG 二抗O. I ml
TMB显色底物液10 ml
IOX浓缩封闭液10 ml
IOX浓缩抗体稀释液20 ml
20 X浓缩洗涤液60 ml
封闭剂15 g
NC膜5张
2)试剂盒操作步骤使用说明
2. I)单头烟粉虱置于封口膜上，加入2-3 ul O. 05 mol/L PBS，用0.5 ml离心管底磨
碎；
2. 2)取2 ul上清点到硝酸纤维素(NC)膜上，室温干燥10分钟；
2. 3) NC膜浸入到含5%封闭剂的I X封闭液中室温封闭30分钟；
2. 4) NC膜放入用I X抗体稀释液1: 2000倍稀释的单抗中室温孵育30-60分钟；
2.5)IX洗涤液洗膜3-4次，每次3分钟；
2.6)NC膜放入用I X抗体稀释液1:1000倍稀释的HRP标记羊抗鼠IgG 二抗中(A4416Sigma)室温孵育30-60分钟；
2.7)IX洗涤液洗膜5-6次，每次3分钟；
2.8)用滤纸吸干膜后将TMB底物显色液(W4121 Promega)滴加到膜表面进行显色反应，肉眼观察结果，待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时记录检测结果，显色时间约5-20分钟。所述的检测烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的dot-ELISA快速鉴定方法及其试剂盒的应用，利用该方法对田间烟粉虱的带毒情况进行调查，精确计算烟粉虱带毒率，预测番茄黄化曲叶病在田间的流行爆发趋势以及时采取防治措施。本发明有益效果 1)本发明提供了一种专门针对传毒介体烟粉虱，快速检测其体内携带病毒的血清学方
法;
2)本发明还提供了一种检测烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的快速检测试剂盒；
3)利用本发明可实现对单头烟粉虱带毒情况的检测，且精确性高；
4)本发明提供的鉴定方法灵敏度高，特异性强，操作简便，快速高效，检测结果可靠；
5)本发明提供的试剂盒不依赖仪器、成本小、操作简便；可同时检测几百至几千头烟粉虱样品，高通量又省时高效，适于在田间大规模推广应用；
6)利用本发明可对田间烟粉虱的带毒情况进行大规模调查，精确计算烟粉虱带毒率，及时预测番茄黄化曲叶病在田间的流行爆发趋势以及时采取防治措施。
图I田间米集的烟粉風样品；
图2烟粉風研磨示意 图3部分田间烟粉虱样品带毒率检测结果；
图4检测烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的dot-ELISA试剂盒的外包装；
图5检测烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的dot-ELISA试剂盒的材料和试剂；
图6应用试剂盒检测田间烟粉虱的带毒情况。
具体实施例方式以下通过附图和实施例对本发明作进一步的阐述。实施例一田间烟粉虱样品带毒率检测
本发明利用dot-ELISA的方法检测田间烟粉虱对番茄黄化曲叶病毒的携带情况，计算烟粉虱带毒率，预测当地番茄黄化曲叶病毒的爆发趋势，以提早做好防治措施，为农业生产服务。从杭州农科院蔬菜所大田中用吸虫器采集烟粉虱110头(图I)并短期存放于4°C冰箱。从4°C冰箱中取出烟粉虱后，置于培养皿中，用ddH20浸泡，用枪头蘸取单头烟粉虱，置于干净的封口膜上，室温晾干。在硝酸纤维素膜外层纸上用铅笔划线，使膜印上方格线痕迹，每孔规格1X1 cm，在膜的一角用铅笔做标记，平整放入培养皿中央。封口膜上晾干的烟粉虱每头滴加2 ul O. 05 mol/L PBS，用0.5 ml离心管底磨碎至肉眼不能看到明显组织(图2)，用移液枪吸取I μ L上述含有烟粉虱组织的PBS，点样于划好的格子中央，并设置阳性、阴性对照，同时吸取O. 3 μ L作为模板进行PCR验证。点样后，将膜静置晾干，加入20ml左右5%的脱脂奶粉，37°C封闭30分钟；弃脱脂奶粉，加入1: 2000倍稀释的番茄黄化曲叶病毒的单克隆抗体(中国专利申请号201210004197. 7)，37°C静置孵育I小时；弃液体，用PBST (含O. 05% Tween-20的O. 01 mol/L PBS)摇动洗脱3次，每次3分钟；弃洗脱液，加入1:1000倍稀释的辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗(A4416 Sigma)，37°C静置孵育I小时；弃液体，用PBST于水平摇床上摇动洗脱5次，每次5分钟；弃洗脱液，将膜用滤纸吸干后加入TMB显色液(W4121 Promega)显色，避光静置5 10分钟，待阳性呈现蓝色而阴性未显色时弃显色液终止反应；ddH2 O浸泡后晾干，用滤纸夹起保存拍照；计算烟粉虱对TYLCV的带毒率(带毒率=阳性数/样品总数X 100%)。检测结果显示110头烟粉虱中有17头呈阳性反应(图3)，经计算，烟粉虱对TYLCV的带毒率为15. 45%，预测该地将有TYLCV流行趋势，建议防治烟粉虱，番茄大棚铺60目防虫网并适时喷洒农药清除烟粉虱，必须栽培抗番茄黄化曲叶病毒的番爺品种。实施例二 检测烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒dot-ELISA试剂盒的开发 1.检测烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)dot-ELISA试剂盒(图4)包含以下材料与试剂
1)试剂盒使用说明书I份
2)试剂与材料
O.05 mol/L PBS10 ml
TYLCV单克隆抗体O. I ml
HRP 标记羊抗鼠 IgG 二抗(A4416 Sigma)O. I ml
TMB 显色底物液(W4121 Promega)10 ml
IOX 浓缩封闭液(O. I mol/L PBST)10 ml
10X浓缩抗体稀释液(50%的脱脂奶粉、0. lmol/L PBST) 20 ml 20X 浓缩洗涤液(O. 2 mol/L PBST)60 ml
封闭剂(脱脂奶粉)15 g
NC 膜(Amersham)5 张
2.试剂盒使用说明书包括
2.I试剂盒原理
dot-ELISA是以硝酸纤维素膜(NC膜)为固相载体的ELISA检测方法，具有简便、快速、特异、敏感、便于推广、不需特殊仪器等优点，应用前景广。携带番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的烟粉虱样品的匀浆液点到NC膜上，干燥形成固相抗原；加入抗TYLCV的鼠单抗，则单抗与固相抗原(TYLCV)形成抗原-抗体复合物；再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗鼠IgG抗抗体(即二抗)，则抗抗体与上述抗原-抗体复合物结合形成抗原-抗体-酶标抗抗体复合物；加入显色底物，复合物上的酶催化底物生成沉淀型有色产物而显色。由于每步之间均有洗涤的步骤，若待测烟粉虱样品中不含TYLCV，则酶标抗体将被洗掉，底物不显色而呈阴性反应。肉眼观察斑点颜色有无及深浅来进行样品中TYLCV的定性和半定量检测。2. 2主要试剂与材料(图5)
0.05 mol/L PBS10 ml
TYLCV单克隆抗体0. I mlHRP 标记羊抗鼠 IgG 二抗(A4416 Sigma)O. I ml
TMB 显色底物液(W4121 Promega)10 ml
IOX 浓缩封闭液(O. I mol/L PBST)10 ml
IOX浓缩抗体稀释液(50%的脱脂奶粉、O. lmol/L PBST) 20 ml 20X 浓缩洗涤液(O. 2 mol/L PBST)60 ml
封闭剂(脱脂奶粉)15 g
NC 膜(Amersham)5 张
以上试剂均保存于4°C下
2.3操作步骤
1)单头烟粉虱置于封口膜上，加入2-3ul O. 05 mol/L PBS，用0. 5 ml离心管底磨碎；
2)取2ul上清点到硝酸纤维素(NC)膜上，室温干燥10 min;
3)NC膜浸入到含5%封闭剂的封闭液中室温封闭30 min;
4)NC膜放入用抗体稀释液1: 2000倍稀释的单抗中室温孵育30-60 min;
5)用洗涤液洗膜3-4次，每次3min;
6)NC膜放入用抗体稀释液1:1000倍稀释的HRP标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60
min;
7)用洗涤液洗膜5-6次，每次3min;
8)用滤纸吸干膜后将TMB底物显色液滴加到膜表面进行显色反应，肉眼观察结果，待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时记录检测结果，显色时间约5-20 min。2. 4缓冲液配方
I)磷酸盐缓冲液(PBS，0. 05 mol/L, ρΗ7· 4)。2)含5%封闭剂的封闭液用去离子水将10Χ浓缩封闭液按I :9体积比进行稀释(I份10Χ浓缩封闭液+9份去离子水)，稀释后按每20 ml稀释封闭液加入Ig封闭剂配制成含5%封闭剂的封闭液，配制好的封闭液在4°C冰箱可保存一个月。3)洗涤液用去离子水将20X浓缩洗涤液按I :19体积比进行稀释(或按需量稀释)(I份20X浓缩洗涤液+19份去离子水)，稀释后的洗涤液在4°C环境可保存一个月。4)抗体稀释液用去离子水将10X抗体稀释液按I :9体积比进行稀释(I份10X抗体稀释液+9份去离子水)，稀释后按每20 ml稀释液加入Ig封闭剂配制成抗体稀释液。配制好的抗体稀释液在4°C冰箱可保存一个月。2. 5注意事项
1)硝酸纤维素膜位于2张保护纸中间，不要用手直接触摸膜，用镊子或戴一次性PE手套取膜；
2)NC膜上滴加检测样品的一面为正面，整个实验过程中应朝上；
3)抗体在使用前10min之内稀释；
4)NC膜CK+处为阳性对照；NC膜CK-处为阴性对照(点健康的烟粉虱匀浆液)；
5)试剂盒反应温度为4-38°C，最佳反应温度为37°C；
6)试剂盒能检测200头粉虱。2. 6贮藏条件及保存期
试剂盒于2-8°C避光保存，抗体_20°C冷冻保存更佳。该产品有效期为6个月。
实施例二 利用试剂盒检测田间烟粉風
用该试剂盒检测田间烟粉虱样品的带毒率，可同时检测几千头烟粉虱，结果快速、可靠、高通量又操作简便。用于大规模调查田间烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的情况，及时预测该病害的流行爆发。图6是利用该试剂盒检测杭州田间蔬菜地烟粉虱的部分结果。
权利要求
1.一种快速检测烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的dot-ELISA方法，其特征在于包括如下步骤 O田间烟粉虱的采集、预处理及研磨； 2)硝酸纤维素(NC)膜准备用铅笔在NC膜外层纸上划线，使NC膜印上方格线痕迹，每格规格1X1 cm,平整放入培养皿中央； 3)点样吸取研磨的烟粉虱研磨液2μ ,点样于NC膜的格子中央； 4)封闭点样后，将NC膜静置晾干10分钟，使用按5g脱脂奶粉加100 mL PBST缓冲液的比例配制得到5%的脱脂奶粉封闭，37°C静置O. 5-1小时；所述的PBST缓冲液为含O. 05%Tween-20 的 O. 01 mol/L PBS ； 5)加一抗加入中国专利申请号为201210004197.7的番茄黄化曲叶病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体用5%的脱脂奶粉1:2000倍稀释，37°C孵育I小时； 6)洗涤弃液体，NC膜用PBST缓冲液摇动洗脱5次，每次3分钟； 7)加酶标二抗弃洗脱液，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗，二抗用5%的脱脂奶粉1:1000倍稀释，37°C孵育I小时； 8)洗涤弃液体，NC膜用PBST缓冲液摇动洗脱5飞次，每次5分钟； 9)显色弃洗脱液，将NC膜用滤纸吸干或静置晾干，加入TMB显色液显色，避光静置5 IO分钟； 10)终止反应待NC膜上的样品呈现蓝色而阴性对照未显色时弃显色液终止反应； 11)记录结果ddH2O浸泡NC I吴，晚干后记录结果。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述的田间烟粉虱的采集、预处理及研磨包括如下步骤 1)烟粉虱采集从大田中用吸虫器采集捕获烟粉虱； 2)烟粉虱存放95%的酒精中室温存放； 3)烟粉虱预处理移液枪吸掉95%的酒精，ddH20清洗3遍，去掉酒精； 4)烟粉虱研磨用毛笔蘸取单头烟粉虱，置于干净的封口膜上，室温晾干5分钟；晾干后，每头烟粉虱滴加2 μ L 0.05 mol/L PBS缓冲液，用O. 5 mL离心管底磨碎至肉眼不能看到明显组织。
3.—种如权利要求I所述的方法的试剂盒，其特征在于包括以下步骤 1)试剂盒试剂与材料 .O.05 mol/L PBS10 ml单克隆抗体O. I ml HRP标记羊抗鼠IgG 二抗O. I ml TMB显色底物液10 ml IOX浓缩封闭液10 ml IOX浓缩抗体稀释液20 ml .20 X浓缩洗涤液60 ml封闭剂15 gNC膜5张 2)试剂盒操作步骤.2. I)单头烟粉虱置于封口膜上，加入2-3 ul O. 05 mol/L PBS，用0.5 ml离心管底磨碎； . 2. 2)取2 ul上清点到硝酸纤维素(NC)膜上，室温干燥10分钟； .2. 3) NC膜浸入到含5%封闭剂的I X封闭液中室温封闭30分钟； .2. 4) NC膜放入用I X抗体稀释液1: 2000倍稀释的单抗中室温孵育30-60分钟； . 2.5)IX洗涤液洗膜3-4次，每次3分钟； .2. 6)NC膜放入用I X抗体稀释液1:1000倍稀释的HRP标记羊抗鼠IgG 二抗中室温孵育30-60分钟; . 2.7)IX洗涤液洗膜5-6次，每次3分钟； .2. 8)用滤纸吸干膜后将TMB底物显色液滴加到膜表面进行显色反应，肉眼观察结果，待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时记录检测结果，显色时间5-20分钟。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的快速检测烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的dot-ELISA方法及其试剂盒的应用，其特征在于利用该方法对田间烟粉虱的带毒情况进行调查，精确计算烟粉虱带毒率，预测番茄黄化曲叶病在田间的流行爆发趋势以及时采取防治措施。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的dot-ELISA方法及其应用。田间烟粉虱的采集、预处理及研磨后，利用番茄黄化曲叶病毒的单克隆抗体，建立检测传毒介体烟粉虱的dot-ELISA方法，并研发快速检测试剂盒，对田间烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的情况进行检测。利用该发明可对田间烟粉虱的带毒率进行大规模调查，预测田间番茄黄化曲叶病的流行爆发趋势。该检测方法快速高效、灵敏特异、高通量又操作简便，为番茄黄化曲叶病毒病的快速诊断、预测预报及科学防控提供技术支撑。
文档编号G01N33/577GK102937652SQ20121042323
公开日2013年2月20日 申请日期2012年10月30日 优先权日2012年10月30日
发明者谢艳, 周雪平, 吴建祥, 矫晓阳, 刘欢 申请人:浙江大学