一种成倍提高高效液相色谱仪分析通量的结构的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种成倍提高高效液相色谱仪分析通量的设计。本发明在原有恒压交错平行分离高效液相色谱系统的基础上进行了改进，对样品实行交错平行分离，让质谱仪有效地避开进样等待、出峰延迟、及分离后的柱平衡，从而大大地提高了分离的通量，实现了100％的占空比及色谱仪结构的简化，提高了分离的重现性和稳定性。本发明交错平行分离中的四根色谱柱两两成对，每一对色谱柱在任何时刻都共享同一流动相，实现了对残留样品有效的洗脱，解决了携带污染问题。
【专利说明】一种成倍提高高效液相色谱仪分析通量的结构
【技术领域】
[0001]本发明涉及了一种成倍提高高效液相色谱仪分析通量的设计。
【背景技术】
[0002]组学(包括蛋白质组学、代谢组学)是一个新兴的交叉学科，需要生物化学、分析化学、生物信息学等多学科方法和技术的同步发展和有效结合。分析化学中基于高效液相色谱-质谱联用的方法和技术，尤其是高通量、高重现性的分离鉴定，是组学技术的基础和核心。在现今的后基因时代，很多物种的全基因序列都已经或正在被测定出来，这使得蛋白质组的全面深入研究成为可能。由于大部分生物功能都是通过蛋白质来传递和实现的，蛋白质组学将在基因组学的基础上更加直接、更加快速地推动系统生物学及个性化药物的发展。在过去的十多年中，基于质谱的蛋白质组学在方法和技术上渐趋成熟，已经能够对蛋白质组进行比较全面快速的表征。但是，目前蛋白质组学分析的重现性仍不理想，同时也未能独立有效地发现可用于临床检测的疾病标志物。美国食品与药品管理局已经批准的癌症生物标志物的浓度都在纳克级(每毫升)甚至皮克级(每毫升)，与其他高丰度蛋白相差10个数量级以上的动态范围。目前质谱仪的最大检测动态范围为6个数量级，因此如果要对超低丰度的蛋白质以及潜在的生物标志物进行高灵敏度、高重现性地检测，就必须发展高通量、高分辨的分离方法来进一步扩大动态范围。生物或疾病标志物的发现不仅要对正常样本及某一疾病样本进行差异表征；同时，为了保证标志物的专一性，还必须确认该标志物在其他相关疾病样本中没有类似差异表达。为了确保正常及疾病样本之间的差异的统计意义，除技术重复试验外，还必须做数以百计甚至数以千计的生物样本重复实验来有效地消除各个个体因性别、年龄、种族、饮食、生活方式、生活环境等方面所带来的差异。要有效地对如此多的样品进行高通量地分析，就必须发展重现性好的高通量方法和技术。
[0003]在过去几年中，蛋白质组学中基于凝胶的离线分离已渐渐地被在线毛细管液相色谱分离所取代。液相色谱能通过电喷雾与质谱仪有效地在线联用，从而实现高通量、高灵敏度的分析。目前商业化的高效液相色谱仪基本上还是单柱设计，液质联用分析中很多时间被浪费在分离前的进样、分离中的出峰延迟、以及分离后的柱平衡过程中，无法实现高通量；同时，单柱系统无法有效地回避相邻分离分析中的携带污染问题，重现性自然不会太好。
[0004]多柱复用平行分离或交错平行分离能有效地改善占空比。V.de Biasi和T.Wang等人发展起来的复用平行技术，主要用于单一组分的靶向分离和鉴定，如组合库的筛选和药物代谢动力学的研究。复用平行分析通过空间上紧靠的多个电喷雾喷嘴同时进样、间歇式连续取样界面(后被沃特世公司(Milford，MA)商业化为MUX界面)、或三重四级杆质谱仪同时靶向检测等设计来实现平行高通量检测。与复用平行分离同时进样不同，交错平行分离采用先后依次进样，进样间隔可控。在对单一化合物或简单混合物进行快速(分钟计)分离鉴定时，交错平行分离采用“切心”(heart-cutting)模式，通过液流选择阀只将平行分离中的靶向洗脱区域切换到检测器进行交错检测，有平行两柱(18)或四柱(19)(已有相应的来自于Thermo Fisher的商业化系统Aria LX4 (20))两种设计；可用于复杂样品高分辨长时间(小时计)交错平行分离的系统也有平行两柱或四柱两种设计。
[0005]综上所述，开发新型结构相对简单、稳定性好、重现性好的高通量高效液相色谱仪是液相色谱发展的当务之急。
【发明内容】
[0006]为了解决本领域的上述问题，作出了本发明。
[0007]本发明的目的在于提供一种成倍提高高效液相色谱仪分析通量的设计。
[0008]一种成倍提高高效液相色谱仪分析通量的结构，包括四根色谱柱、一个六通阀、三个四通阀、一个柱选择阀、二个进样泵；
[0009]六通阀的第一个接口与一自动进样器的出口相连，六通阀的第二个接口与第五个接口分别与一进样管的二端相连，六通阀的第三个接口与第一四通阀的第一个接口相连，六通阀的第四个接口与第一四通阀的第三个接口相连，于六通阀第三个接口与第一四通阀的第一个接口的连接管路上设有一流体入口，流体入口与第一进样泵的出口相连；六通阀的第六个接口放空或与一废液收集容器相连；
[0010]第一四通阀的第二个接口和第四个接口分别与第二四通阀和第三四通阀的第一个接口相连，第二四通阀和第三四通阀的第二个接口及第四个接口分别与四根色谱柱的进样端口相连；第二四通阀和第三四通阀的第三个接口相连通，且在它们的连通管路上设有一四通，四通的二个接头分别与第二四通阀和第三四通阀的第三个接口相连，四通的第三个接头与第二进样泵的出口相连，四通的第四一个接头接一根钼针；
[0011]四根色谱柱的出样端口分别与柱选择阀的第一个接口、第三个接口、第五个接口、第七个接口相连，柱选择阀的第二个接口、第四个接口、第六个接口、第八个接口分别放空或与一废液收集容器相连；柱选择阀的阀芯处接口设有毛细管喷嘴，毛细管喷嘴出口端置于质谱进样口前端，毛细管喷嘴面向质谱进样口。
[0012]四根色谱柱前端采用溶胶封口，所述前端为与质谱相连端、即出样端。
[0013]第一进样泵和第二进样泵均为高压液相泵，其中第二进样泵为恒流泵，又称之为等容泵；
[0014]电喷雾高压由四通接头处的钼针引入到流动相液流之中。
[0015]所有六通阀、四通阀、及柱选择阀均为流量为50-1000纳升/分钟的微流阀，其材质都是非金属，采用聚醚醚酮定子和转子。
[0016]第一个方面，本发明提供了全自动交叉平行四柱恒流毛细管高效液相色谱仪的设计、组装与调试技术，该技术包括以下步骤:
[0017]1.采用化学聚合的方法让一定比例的甲酰胺和硅酸鉀溶液(Krasil 1，PQ公司)先在空色谱柱(内径75微米，外径360微米)的前端生成一定长度的、能耐高压的溶胶；避开了用金属二通连接头/栅网来封装固定相颗粒；
[0018]2.在显微镜检测下，用高压有机溶剂(如乙腈)泥浆(slurry)法灌装固定相颗粒结构紧凑、均匀的毛细管色谱柱；
[0019]3.除自动进样器外，在铝型材小推车上组装交叉平行四柱恒流毛细管高效液相色谱系统，检验泵和微流阀是否工作正常，各个毛细管流路的连接和方向是否正确；[0020]4.将初步检验后的色谱系统与简易质谱仪(如单重四级杆质谱仪、飞行时间质谱仪)在线联用，并用标准样品检验系统的分辨率、灵敏度、稳定性、和重现性。
[0021]5.装配自动进样器，并安装和测试自动控制软件程序及用户图形操作控制界面
[0022]第二个方面，本发明提供了全自动交叉平行四柱恒流毛细管高效液相色谱仪的应用技术，该技术包括以下步骤:
[0023]1.将上述完全搭建的全自动交叉平行四柱毛细管高效液相色谱仪与高分辨、高性能质谱仪(如傅里叶变换离子回旋共振质谱仪、轨道阱质谱仪)及定量质谱仪(如三重四级杆质谱仪)联用，用于一个细胞模型小规模蛋白质样品的分离鉴定；
[0024]2.与临床医院合作，将上述定性、定量色-质联用仪用于一个临床疾病大规模蛋白质样品的差异分离鉴定，致力于疾病标志物的发现与验证；
[0025]3.在其他生物样品(如多肽、代谢产物)高通量、高灵敏度、及高重现性分离鉴定中的推广和应用。
[0026]4.充分发挥自组装系统灵活性高的特点，尝试更小内径(如50微米，30微米，甚至15微米)、更高灵敏度毛细管柱的应用，对极微量珍贵生物或临床样品(如肿瘤组织细胞)实现超高灵敏度分离鉴定。
[0027]本发明高效液相色谱仪通量高、结构简单、重现性好，系统的稳定性与持续性高。具有以下特征:
[0028]I)色谱柱前端(与质谱相连端、即出样端)采用溶胶(甲酰胺/硅酸钾溶液按1:5混合，虹吸至色谱柱前端2-3cm，烘箱100° C烘烤10分钟)封口技术，用于防止意外突然降压情况下填料粒子倒流，从而有效保证固定相填料的紧凑性。
[0029]2)采用50-1000纳升/分钟的恒流(而非恒压)高压洗脱分离模式，流速准确度和精度分别小于I %和0.5 %。
[0030]3)有效地让质谱仪避开进样等待、出峰延迟、及柱平衡，只对每次分离中的蛋白质出峰区域进行采集，实现几乎100%的占空比。
[0031]4)该色谱仪中的多柱平行分离的优越性得以保持。
[0032]5)该色谱仪所需的微流阀由13个减少到5个，高压液相泵从3个减少到2个。
[0033]6)有效的解决了携带污染问题。该色谱仪的其中一柱在作分离时，另一柱则获得一次空白洗脱的机会。该色谱仪中的四根色谱柱两两成对，每一对色谱柱在任何时刻都共
享同一流动相。
[0034]7)最大限度保留色谱柱的分辨度。电喷雾喷嘴直接连接于平行色谱柱选择阀上，而电喷雾所需高压加在色谱柱后端，最大程度减少死体积。
[0035]8)系统全部采用非金属微流阀(聚醚醚酮定子和转子)，加之柱后电喷雾高压的设计(无需用金属二通连接喷嘴和色谱柱前端来加高压)。多肽或蛋白质从进样到进入质谱前，不会与任何金属接触，从而对磷酸化多肽或蛋白质有最大限度的灵敏度。
[0036]9)系统灵活性高。适于更小的内径-15微米，更高灵敏度毛细管柱的应用。可以对极微量珍贵生物或临床样品(如肿瘤组织细胞)实现超高灵敏度分离鉴定。
[0037]本发明有益效果
[0038]1.一种成倍提高高效液相色谱仪分析通量的设计，简化了色谱仪结构，降低了系统成本，进一步提高分离的重现性和稳定性。[0039]2.一种成倍提高高效液相色谱仪分析通量的设计，自主设计开发相应的恒流系统，与相应的恒压系统相比，多柱平行分离的优越性得以保持，有效地让质谱仪避开进样等待、出峰延迟、及柱平衡，只对每次分离中的蛋白质出峰区域进行采集，实现几乎100%的占空比；
[0040]3.一种成倍提高高效液相色谱仪分析通量的设计，该色谱仪中的四根色谱柱两两成对，每一对色谱柱在任何时刻都共享同一流动相，其中一柱在作分离时，另一柱则获得一次空白洗脱的机会，从而有效地解决了携带污染问题。
[0041]4.一种成倍提高高效液相色谱仪分析通量的设计，该设计简化了色谱仪结构、降低了系统成本。
[0042]5.一种成倍提高高效液相色谱仪分析通量的设计，该设计可用于一个细胞模型小规模蛋白质样品的分离鉴定，具有很高的临床应用价值。
[0043]6.一种成倍提高高效液相色谱仪分析通量的设计，该设计推广应用到各类组学研究中，将为我国的各类组学、系统生物学、以及个性化药物的研发作出贡献，同时也为相应的商业化仪器的开发提供模板。
【专利附图】
【附图说明】
[0044]图1为全自动交叉平行四柱恒流毛细管高效液相色谱仪结构示意图；样品依次在柱1、2、4和3上进行分离时各色谱柱的状态，包括进样、分离、平衡和空白。
[0045]⑷柱I分离，柱2平衡/进样，柱3平衡，柱4空白；
[0046](B)柱I平衡，柱2分离，柱3空白，柱4平衡/进样；
[0047](C)柱I空白，柱2平衡，柱3平衡/进样，柱4分离；
[0048](D)柱I平衡/进样，柱2空白，柱3分离，柱4平衡；
[0049]分离/平衡/空白/平衡/进样先后在柱(A)、( B )、( C )、( D )上进行，每根色谱柱在分离及平衡后获得一次走空白的机会，有效地避免了携带污染的问题；
[0050]1:六通阀,2:四通阀一,3:四通阀二,4:四通阀三,5:柱选择阀,6:质谱,7:电喷雾，8:自动进样器，9:进样管，10:泵一，11:泵二，12:钼针(加高压)，13:柱1，；14:柱2，；15:柱3，；16:柱4，；17:低温样品储存柜；
[0051]图2为单柱高效液相色谱系统先后分离时序与四柱高效液相色谱系统交错平行分离时序的比较图；
[0052](A)单柱高效液相色谱系统先后分离时序图；
[0053](B)四柱高效液相色谱系统交错平行分离时序图；
[0054]在同一时间窗口内，四柱系统有效地让质谱避开了进样、出峰延迟、及平衡的等待时间，能比单柱系统多做两次分离。
[0055]图3四个样品先后在柱1、2、3和柱4上进行在分离后质谱采集的色谱图。
【具体实施方式】
[0056]1.高压液相泵、自动进样器(含样品低温储存柜)、微流阀(带微型电驱动器)、石英毛细管、色谱柱填料(固定相)、及其他辅助化学试剂和小型设备的购置；装载用小推车的设计和加工；高压色谱柱灌装装置的设计、加工、装配、及毛细管色谱柱(内径75微米)的自行填充；
[0057]2.除自动进样器外，全套交叉平行恒流四柱毛细管高效液相色谱仪的组装；用标准样品和复杂生物样品调试、检验整套系统的分辨率、灵敏度、重现性、以及携带污染问题；
[0058]3.自动进样器的装配及仪器的自动控制和友好用户操作界面的设计、建立和调试；
[0059]4.自动进样器和微流阀的转换均通过计算机控制，将上述完全搭建的全自动交叉平行四柱毛细管高效液相色谱仪与质谱联用，用于一个疾病细胞模型及临床样品的蛋白质分离、分析、和鉴定；
[0060]5.在常规75微米毛细管色谱柱的基础上，研发更小内径毛细管色谱柱(50、30，甚至15微米)分离的色谱条件，实现对超微量样品(纳克级)超高灵敏度分离分析；
[0061]6.全自动交叉平行四柱毛细管高效液相色谱仪在其他生物样品(如多肽、代谢产物)高通量、高灵敏度、及高重现性分离鉴定中的推广和应用。
[0062]实施例
[0063]一种成倍提高高效液相色谱仪分析通量的结构，包括四根色谱柱、一个六通阀、三个四通阀、一个柱选择阀、二个进样泵；
[0064]六通阀的第一个接口与一自动进样器的出口相连，六通阀的第二个接口与第五个接口分别与一进样管的二端相连，六通阀的第三个接口与第一四通阀的第一个接口相连，六通阀的第四个接口与第一四通阀的第三个接口相连，于六通阀第三个接口与第一四通阀的第一个接口的连接管路上设有一流体入口，流体入口与第一进样泵的出口相连；六通阀的第六个接口放空或与一废液收集容器相连；
[0065]第一四通阀的第二个接口和第四个接口分别与第二四通阀和第三四通阀的第一个接口相连，第二四通阀和第三四通阀的第二个接口及第四个接口分别与四根色谱柱的进样端口相连；第二四通阀和第三四通阀的第三个接口相连通，且在它们的连通管路上设有一四通，四通的二个接头分别与第二四通阀和第三四通阀的第三个接口相连，四通的第三个接头与第二进样泵的出口相连，四通的第四一个接头接一根钼针；
[0066]四根色谱柱的出样端口分别与柱选择阀的第一个接口、第三个接口、第五个接口、第七个接口相连，柱选择阀的第二个接口、第四个接口、第六个接口、第八个接口分别放空或与一废液收集容器相连；柱选择阀的阀芯处接口设有毛细管喷嘴，毛细管喷嘴出口端置于质谱进样口前端，毛细管喷嘴面向质谱进样口。
[0067]四根色谱柱前端采用溶胶封口，所述前端为与质谱相连端、即出样端；第一进样泵和第二进样泵均为高压液相泵，其中第二进样泵为恒流泵，又称之为等容泵；电喷雾高压由四通接头处的钼针引入到流动相液流之中。所有六通阀、四通阀、及柱选择阀均为流量为50-1000纳升/分钟的微流阀，其材质都是非金属，采用聚醚醚酮定子和转子。
[0068]下面以希瓦氏菌多肽的分离为例说明该液相色谱系统的工作过程，假定每个阀(柱选择阀除外)的实线连接为“I”号位置，虚线连接为“2”号位置(对应于表I中的数值)。
[0069]多肽样品依次在分离柱1、2、4和3上的分离。当其中一根色谱柱在分离状态时，其他的色谱柱的状态如下(附图1):
[0070]⑷柱I分离，柱2平衡/进样，柱3平衡，柱4空白；[0071](B)柱I平衡，柱2分离，柱3空白，柱4平衡/进样；
[0072](C)柱I空白，柱2平衡，柱3平衡/进样，柱4分离；
[0073](D)柱I平衡/进样，柱2空白，柱3分离，柱4平衡；
[0074]分离/平衡/空白/平衡/进样先后在柱1、2、4和柱3上进行，每根色谱柱在分离及平衡后获得一次走空白的机会，有效地避免了携带污染的问题；在同一时间窗口内，四柱系统有效地让质谱避开了进样、出峰延迟、及平衡的等待时间，能比单柱系统多做两次分离(附图2)。
[0075]下面以样品在柱I上的分离为例说明系统的自动控制过程，所有阀的位置变化如表1所示。四个样品依次进样先后在柱1、2、4和柱3上进行在分离后质谱采集的色谱图。
[0076]表1样品I在柱I上分离过程中阀位置的控制
[0077]
【权利要求】
1.一种成倍提高高效液相色谱仪分析通量的结构，其特征在于: 包括四根色谱柱、一个六通阀、三个四通阀、一个柱选择阀、二个进样泵； 六通阀的第一个接口与一自动进样器的出口相连，六通阀的第二个接口与第五个接口分别与一进样管的二端相连，六通阀的第三个接口与第一四通阀的第一个接口相连，六通阀的第四个接口与第一四通阀的第三个接口相连，于六通阀第三个接口与第一四通阀的第一个接口的连接管路上设有一流体入口，流体入口与第一进样泵的出口相连；六通阀的第六个接口放空或与一废液收集容器相连； 第一四通阀的第二个接口和第四个接口分别与第二四通阀和第三四通阀的第一个接口相连，第二四通阀和第三四通阀的第二个接口及第四个接口分别与四根色谱柱的进样端口相连；第二四通阀和第三四通阀的第三个接口相连通，且在它们的连通管路上设有一四通，四通的二个接头分别与第二四通阀和第三四通阀的第三个接口相连，四通的第三个接头与第二进样泵的出口相连，四通的第四一个接头接一根钼针； 四根色谱柱的出样端口分别与柱选择阀的第一个接口、第三个接口、第五个接口、第七个接口相连，柱选择阀的第二个接口、第四个接口、第六个接口、第八个接口分别放空或与一废液收集容器相连；柱选择阀的阀芯处接口设有毛细管喷嘴，毛细管喷嘴出口端置于质谱进样口前端，毛细管喷嘴面向质谱进样口。
2.根据权利要求1所述的结构，其特征在于: 四根色谱柱前端采用溶胶封口，所述前端为与质谱相连端、即出样端。
3.根据权利要求1所述的结构，其特征在于: 第一进样泵和第二进样泵均为高压液相泵，其中第二进样泵为恒流泵，又称之为等容栗; 电喷雾高压由四通接头处的钼针引入到流动相液流之中。
4.根据权利要求1所述的结构，其特征在于: 所有六通阀、四通阀、及柱选择阀均为流量为50-1000纳升/分钟的微流阀，其材质都是非金属，采用聚醚醚酮定子和转子。
【文档编号】G01N30/02GK103808817SQ201210454003
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月12日 优先权日:2012年11月12日
【发明者】田志新 申请人:中国科学院大连化学物理研究所