专利名称：钠/钾离子比检测方法、系统和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体而言涉及ー种钠/钾离子比检测方法、系统和试剂盒。
背景技术：
人体内的钠、钾离子是维持细胞生理活动的主要阳离子，是保持机体的正常滲透压及酸碱平衡，參与糖及蛋白质代谢，保证神经肌肉的正常功能所必需，其含量是人体生理活动的重要指标。尿液、血清中钠 、钾离子的含量水平在临床上可用了诊断ー些肾脏、心脏等方面的疾病。人体内的钠钾离子水平处于ー个平衡状态，其比的改变对人体健康有着重要影响。对健康而言，监测钠/钾离子的比例可能比二者単独的绝对数值更重要。在临床上，通过检测唾液钠/钾离子比，可诊断醛固酮增多症。此外，美国学者近日研究证实24小时尿钠/钾离子比对心血管疾病风险的预测价值显著优于单纯的尿钠或尿钾检測。由此可见，钠/钾离子比的监测对预防心血管疾病具重要意义。现有技术中测定钠、钾离子浓度的方法主要有中子活化法、同位素稀释质谱法、化学測定法、火焰光度法、离子选择电极法、酶动力学法、原子分光光度法等。目前，临床上经常使用的方法是火焰光度法和离子选择电极法。(I)火焰光度法火焰光度法是ー种发射光谱分析法，利用火焰中激发态原子回降至基态时发射的光谱强度进行含量分析，可检测血清、尿液、脑脊液及胸腹水的Na+和K+，该方法属于经典的标准參考法，优点是结果准确可靠，广为临床采用。通常采用的定量方法有外标准法和内标准法。外标准法一般操作误差较大，不常采用。内标法是标本及标准液采用加进相同浓度的内部标准元素进行測定，一般是加入锂内标，測定的是锂/钠或钾电流的比值，而不是単独钠或钾的电流，这样，可减小燃气和火焰温度波动等因素引起的误差，因而有较好的准确性。(2)离子选择电极法(ISE法):在专用仪器上进行血清和尿液的钾、钠离子測定。因其具有标本用量少，快速准确，操作简便等优点，是目前所有方法中最为简便准确的方法，几乎有取代其他方法的趋势。其原理是离子选择电极是ー种电化学传感器，其结构中有一个对特定离子具有选择性响应的敏感膜电极，将离子活度转换成电位信号，在一定范围内，其电位与溶液中特定离子活度的对数呈线性关系，通过与已知离子浓度的溶液比较可求得未知溶液的离子活度，按其测定过程又分为直接測定法和间接测定法，目前大部分采用间接測定法，由于间接測定法将待测样本稀释后測定，所测离子活度更接近离子浓度。目前主要的电极种类有玻璃膜电极，感应材料为玻璃膜；固相电极，由难溶金属物质加压成型；液态膜电极，将环氧树脂或内装聚氯こ烯作为感应膜；缬氨霉素膜制成的K+电极。这些电极都具有一定寿命，使用一段时间后，电极会老化，且价格昂贵。(3)化学測定法目前Na+、K+的化学測定主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦称为冠醚，均为离子载体进行測定，由于大环结构内有空穴，分子内部氧原子有未共用电子对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结合不同直径的金属离子，从而可达到测出离子浓度的目的。(4)酶法酶法测定钾的原理是利用钠依赖的P -半乳糖苷酶催化人工底物ONPG(邻硝基酚3 -D-吡喃半乳糖苷);分解释放出有色产物邻硝基酚，在波长420nm处测吸光度变化。酶法测钾的原理是利用对丙酮酸激酶的激活作用，后者催化磷酸烯醇式丙酮酸变为乳酸同时伴有还原型辅酶I的消耗，在波长340nm处测NADH的吸光度下降。酶法的优点是不需特殊仪器，缺点是价格较贵。(5)原子分光光度法也可用于检测血清中钾、钠离子，但操作复杂，误差较大，不及火焰光度法简便。现有的这些方法都是分别测定钠、钾离子浓度，再在测出的数值基础上计算钠/钾比。到目前为止，尚没有直接测定钠/钾比的方法。
发明内容
本发明的目的提供ー种利用鸟嘌呤四链体(G-四链体)荧光能量转移体系检测钠/钾离子比的新方法，以及应用该方法配制而成的钠/钾离子比检测试剂盒。利用该试剂盒中的试剂，可利用荧光光谱仪器定量分析液体中钠/钾离子比，测定过程不受其他元素的影响，精确度高。本发明的总体技术路线为 通过加入带有荧光标记基团的能够形成鸟嘌呤-四链体(下文称G-四链体)结构的DNA分子，该DNA分子因溶液中的钠/钾离子水平不同而产生不同构像，随之影响DNA分子的荧光标记基团的能量转移强度，从而反映出钠/钾离子的比水平。本发明的第一方面提供一种检测液体样品中钠/钾离子比的方法，所述方法包括以下步骤(I)用pH6. 2 8. 2的缓冲溶液和水溶性钠盐和钾盐配制钠/钾离子比不同的多个溶液样本，其中每个所述溶液样本中含有相同浓度的带荧光标记基团的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的的DNA分子；(2)将所述多个溶液样本置于荧光光谱仪下，采用410nm至540nm的激发波长，检测波长在第一、ニ波长处的突光强度值，其中所述第一波长在480nm至550nm范围,所述第ニ波长在55 Inm至700nm范围；(3)以各个所述溶液样本的钠/钾离子比作为横坐标或纵坐标，以步骤(2)中测得的第一波长处的荧光强度值与第二波长处的荧光强度值的比值为纵坐标或横坐标作图，从而获得钠/钾离子比的标准曲线；(4)将待测液体样品中加入所述带有荧光标记基团的能够形成G-四链体的DNA分子并调节PH值，以使待测液体样品中的带有荧光标记基团的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子的浓度以及pH值与步骤(I)中的溶液样本一致，从而得到测试溶液；(5)将步骤(4)中获得的测试溶液置于荧光光谱仪下，采用410nm至540nm的激发波长，检测波长在第一、ニ波长处的荧光强度值；(6)利用步骤(5)中测得的中测得的第一波长处的荧光强度值与第二波长处的荧光强度值的比值在步骤(3)中获得的钠/钾离子比标准曲线中找到对应的测试溶液的钠/钾离子比。本发明的方法可以方便地用于检测各种溶液样品中的钠/钾离子比，例如，可以检测人或动物血液、尿液、唾液或其他体液中的钠/钾离子比。根据本发明的方法，其中所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三こ醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、ニ(2—羟こ基)亚氨基三(羟甲基)甲烷-盐酸缓冲液。根据本发明的方法，其中所述带有荧光标记基团的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子中含有下式I的结构GGYGGZGGMGG式I其中Y、Z和M分别代表ー个或多个任意碱基；G代表鸟嘌呤碱基；所述荧光标记基团连接在所述DNA分子的两端，并且连接在所述DNA分子两端的荧光标记基团不同；连接在所述DNA分子两端的荧光标记基团的组合选自以下荧光标记基团组合6_羧基荧光素(FAM)和6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、异硫氰酸荧光素(FITC)和罗丹明(Rhodamine)、3H-吲哚菁染料(Cy3)和3H-吲哚菁染料(Cy5)或者Alexa488和3H-吲哚菁染料(Cy3)。根据本发明所述的方法，其中所述带有荧光标记基团的在钠、钾离子条件下能够形成不同G-四链体结构的DNA分子的碱基序列中优选具有“GG”结构。这类DNA分子中的碱基序列的非限定性实例包括，如 TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、TGAGGGTGGGGAGG GTGGGGAA、AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG、GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG、GGTTGGTGTGGTTGG、 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG、 GGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGG 或GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG等碱基序列，但本发明中的带有荧光标记基团的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子的碱基序列不受这些列举所限制。另外，对于本发明中所使用的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子的长度并没有特殊限制，但是优选6 300个碱基的长度，更优选1(T100个碱基的长度，最优选10^30个碱基的长度。在本发明的方法中所使用的带有荧光标记基团的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子可以从供应商处直接购买现有的产品，也可以采用本领域常用的方法来用荧光标记基团来对DNA分子进性标记。本领域技术人员可以根据需要选择不同的荧光标记基团组合以及不同的DNA序列。根据本发明所述的方法，其中可以通过使用可溶性钠、钾盐如氯化钾、溴化钾、碘化钾、硫酸钾、硝酸钾、氯化钠、溴化钠、碘化钠、硫酸钠或硝酸钠等来配制所述多个溶液样本，各溶液样本中钠/钾离子的比优选在0至20的范围，进ー步优选在0至10的范围，更进ー步优选在I至8的范围，最优选在2至6的范围。根据本发明的方法，其中所述带有荧光标记基团的在钠、钾离子条件下能够形成不同G-四链体结构的DNA分子在溶液样本中的浓度在0至30 ii mo I/L的范围，优选在0. 05至 10 ii mol/L,进一步优选在 0.1 至 2 ii mol/Lo本发明的方法在于，直接给出溶液中钠/钾离子的摩尔比，而与溶液中钠离子和钾离子的实际浓度值没有直接关系。
本发明的另一方面提供一种实施本发明方法的系统和试剂盒，所述系统包括所述试剂盒和荧光光谱仪；所述试剂盒包括pH6. 2^8. 2的缓冲液、可溶性钠盐、钾盐、带有荧光标记基团的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子。根据本发明的系统和试剂盒，其中所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三こ醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液。根据本发明的系统和试剂盒，其中所述带有荧光标记基团的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子中含有下式I的结构GGYGGZGGMGG式I其中Y、Z和M分别代表ー个或多个任意碱基；G代表鸟嘌呤碱基；所述荧光标记基团连接在所述DNA分子的两端，并且连接在所述DNA分子两端的荧光标记基团不同；连接在所述DNA分子两端的荧光标记基团的组合选自以下荧光标记基团组合6_羧基荧光素(FAM)和6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、异硫氰酸荧光素(FITC)和罗丹明(Rhodamine)、3H-吲哚菁染料(Cy3)和3H-吲哚菁染料(Cy5)或者Alexa488和3H-吲哚菁染料(Cy3)。根据本发明的系统和试剂盒，其中所述带有荧光标记基团的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子的碱基序列中优选具有“ GG”结构。这类DNA分子中的碱基序列的非限定性实例包括，如TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA、AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG、GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG、 GGTTGGTGTGGTTGG、 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG、GGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGG 或 GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG 等碱基序列，但本发明中的带有荧光标记基团的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子的碱基序列不受这些列举所限制。另外，对于本发明中所使用的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子的长度并没有特殊限制，但是优选6 300个碱基的长度，更优选1(T100个碱基的长度，最优选1(T30个碱基的长度。在本发明的系统和试剂盒中所使用的带有荧光标记基团的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子可以从供应商处直接购买现有的产品，也可以采用本领域常用的方法来用荧光标记基团来对DNA分子进性标记。本领域技术人员可以根据需要选择不同的荧光标记基团组合以及不同的DNA序列。根据本发明的系统和试剂盒，其中所述可溶性钠盐选自氯化钾、溴化钾、碘化钾、硫酸钾或硝酸钾；可溶性钾盐选自氯化钠、溴化钠、碘化钠、硫酸钠或硝酸钠。本文所述的钠/钾离子比为摩尔比。本发明中所述的荧光标记基团的分子式如下6-羧基荧光素(FAM)，分子式
权利要求
1.一种检测液体样品中钠/钾离子比的方法，所述方法包括以下步骤 (1)用PH6.2 8. 2的缓冲溶液和水溶性钠盐和钾盐配制钠/钾比不同的多个溶液样本，其中每个所述溶液样本中含有相同浓度的带有荧光标记基团的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子； (2)将所述多个溶液样本置于荧光光谱仪下，采用410nm至540nm的激发波长，检测波长在第一、二波长处的突光强度值，其中所述第一波长在480nm至550nm范围,所述第二波长在551nm至700nm范围； (3)以所述溶液样本的钠/钾比作为横坐标或纵坐标，以步骤(2)中测得的第一波长处的荧光强度值与第二波长处的荧光强度值的比值为纵坐标或横坐标作图，从而获得钠/钾离子比的标准曲线； (4)将待测液体样品中加入所述带有荧光标记基团的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子，并调节样品的pH值以使待测液体样品中的带有荧光标记基团的能够形成G-四链体的DNA分子的浓度以及pH值与步骤(I)中的溶液样本一致，从而得到测试溶液； (5)将步骤(4)中获得的测试溶液置于荧光光谱仪下，采用与步骤(2)相同的激发波长，检测波长在所述第一、二波长处的荧光强度值； (6)利用步骤(5)中测得的中测得的第一波长处的荧光强度值与第二波长处的荧光强度值的比值在步骤(3)中获得的钠/钾离子比标准曲线中找到对应的测试溶液的钠/钾离子浓度比。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述带有荧光标记基团的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子中含有下式I的结构GGYGGZGGMGG 式I 其中式I中的X、Y、Z、和M、N分别代表一个或多个任意碱基而代表鸟嘌呤碱基；所述荧光标记基团连接在所述DNA分子的两端，并且所述DNA分子两端的荧光标记基团不同；连接在所述DNA分子两端的荧光标记基团的组合选自以下荧光标记基团的组合6_羧基荧光素和6-羧基四甲基罗丹明、异硫氰酸荧光素和罗丹明、Cy3和Cy5或者Alexa488和Cy3。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述带有荧光标记基团的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子中的碱基序列为TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、T GAGGGTGGGGAGGGT GGGGAA、AGGGAGGGC GC T GGGAGGAGGG、GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG、 GGTTGGTGTGGTTGG、 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG、GGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGG 或 GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液；所述可溶性钠盐选自氯化钾、溴化钾、碘化钾、硫酸钾或硝酸钾；可溶性钾盐选自氯化钠、溴化钠、碘化钠、硫酸钠或硝酸钠。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述溶液样本中钠/钾离子比的范围优选在O至15的范围；所述带有荧光标记基团的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子在溶液样本中的浓度在O. 5至30 μ mo I/L的范围。
6.一种检测液体样品中钠/钾离子比的试剂盒和系统，所述试剂盒包括pH6. 2^8. 2的缓冲液、可溶性钠盐、钾盐、带有荧光标记基团的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子；所述系统包括所述试剂盒和荧光光谱仪。
7.如权利要求6所述的试剂盒和系统，其中所述带有荧光标记基团的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子中含有下式I的结构GGYGGZGGMGG 式I 其中Y、Z、M分别代表一个或多个任意碱基；G代表鸟嘌呤碱基；所述荧光标记基团连接在所述DNA分子的两端，并且所述DNA分子两端的荧光标记基团不同；连接在所述DNA分子两端的荧光标记基团的组合选自以下荧光标记基团的组合6_羧基荧光素和6-羧基四甲基罗丹明、异硫氰酸荧光素和罗丹明、Cy3和Cy5或者Alexa488和Cy3。
8.如权利要求6或7所述的系统和试剂盒，其中所述带有荧光标记基团的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子中的碱基序列为TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA、AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG、 GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG、 GGTTGGTGTGGTTGG、TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG、GGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGG 或 GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG。
9.如权利要求6或7所述的系统和试剂盒，其中所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液。
10.如权利要求6或7所述的系统和试剂盒，其中所述可溶性钠盐选自氯化钾、溴化钾、碘化钾、硫酸钾或硝酸钾；可溶性钾盐选自氯化钠、溴化钠、碘化钠、硫酸钠或硝酸钠。
全文摘要
本发明涉及钠/钾离子比检测方法、系统和试剂盒。本发明涉及检测钠/钾离子比浓度的方法，包括(1)配制钠/钾比不同的多个溶液样本，(2)将该多个溶液样本置于荧光光谱仪下，检测波长在第一、二波长处的荧光强度值，(3)获得钠/钾离子比的标准曲线；(4)将待测液体样品中加入带有荧光标记基团的在钠、钾离子存在下能够分别形成不同G-四链体结构的DNA分子，并调节样品pH值，从而得到测试溶液；(5)将测试溶液置于荧光光谱仪下，检测波长在所述第一、二波长处的荧光强度值；(6)利用步骤(5)中测得的中测得的第一波长处的荧光强度值与第二波长处的荧光强度值的比值钠/钾离子比标准曲线中找到对应的测试溶液的钠/钾离子浓度比。
文档编号G01N21/64GK103048301SQ20121055378
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月18日 优先权日2012年12月18日
发明者孙红霞, 唐亚林, 向俊锋, 杨千帆, 管爱娇, 刘岩 申请人:中国科学院化学研究所