专利名称：一种研究厚壳贻贝胚胎和幼虫神经发育的方法
技术领域：
本发明涉及厚壳贻贝的神经发育研究，具体地说，是一种研究厚壳贻贝胚胎和幼虫神经发育的方法。
背景技术：
厚壳贻贝(Jfytilus coruscus )，软体动物门/双壳纲，分布于我国的黄海、渤海和东海沿岸以及台湾等地。贻贝用足丝附着在附养物上生活，利用鳃滤食。选食海水中的微小生物以及有机碎屑等。其繁殖季节一年两次，是海产贝类中生长最快的种类之一。厚壳贻贝的发育阶段包括受精卵、桑葚期、囊胚期、担轮幼虫、D形幼虫、壳顶幼虫、匍匐幼虫等阶段，在变成附着成体之前有一个浮游幼虫阶段。理解和控制厚壳贻贝浮游幼虫的附着变态行为对于水产养殖苗种生产技术的改善和海洋防污技术的发展具有极其重要的理论意义和实践意义，而目前尚无关于厚壳贻贝幼虫发育过程中附着变态机制的报道。中国期刊《安徽农业科学》，2010年第32期，刊出的论文“厚壳贻贝胚胎发育观察”，公开了一种研究厚壳贻贝胚胎发育的方法，其具体方法是选择性腺成熟的厚壳贻贝亲贝，通过催产受精，对厚壳贻贝受精、卵裂、幼体发育等细胞生物学现象用显微镜进行连续观察，经显微摄影，详细记录厚壳贻贝的胚胎发育全过程。但是其并没有对厚壳贻贝的胚胎和幼虫神经发育进行研究，因此无法探究其浮游幼虫的附着变态机制。目前，在对哺乳动物如小鼠的神经发育研究中，有使用5羟色胺抗体、FMRF酰胺类抗体结合α微管蛋白抗体对小鼠神经系统进行标记，但在对贝类的研究中，三种抗体结合标记很少见。在双壳贝类中，有仅采用α微管蛋白抗体来标记其幼虫的神经系统的报道，但是结果显示其难以将幼虫的神经系统完整的描述出来。其主要原因在于:使用抗体对研究对象的神经发育进行标记，需要保证抗体处于合适的浓度，同时要保证其他化学物质的处理浓度和时间均适宜，才能有效的将神经系统标示出来，若使用多种抗体进行标记，为保证每一种抗体都可以有效的与其抗原有效结合同时互不干扰，则进一步增加了其标记的难度。但是鉴于研究厚壳贻贝胚胎和幼虫神经发育可用于揭示其浮游幼虫的附着变态机制，并进一步指导水产养殖苗种生产和海洋防污，因此，亟需一种可用于研究厚壳贻贝胚胎和幼虫神经发育的有效方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种研究厚壳贻贝胚胎和幼虫神经发育的方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:
一种研究厚壳贻贝胚胎和幼虫神经发育的方法，其特征在于，它包括以下步骤:
a)将厚壳贻贝的胚胎和幼虫置入质量浓度为0.1-8%的MgCl2溶液中处理20-30 min,用多聚甲醛将幼虫固定在PBS缓冲液中；
b)取出步骤a)处理后的幼虫，洗涤后用质量浓度0.1-15%的乙二胺四乙酸静置脱钙，然后将胚胎或幼虫样品用PBS缓冲液洗涤后加入封闭液；
c)用浓度1:200-1:1000的5羟色胺抗体或浓度1:200-1:1000的FMRF酰胺类抗体和浓度1:200-1:1000的α微管蛋白抗体结合标记步骤b)的厚壳贻贝胚胎和幼虫，4°C下孵育1-8天，再用PBST洗涤后分别加入含有浓度为1:800-1:1200 二抗的PBS溶液中，4°C下孵育4-12小时。优选的，所述的MgCl2溶液的质量浓度为7.5%，所述的乙二胺四乙酸的质量浓度为
5% ο优选的，所述的二抗的浓度为1:1000。所述的二抗是山羊抗兔和山羊抗鼠二抗。所述的封闭液是含质量浓度0.25%牛血清蛋白、质量浓度1% triton-100和质量浓度0.03%叠氮化钠的PBS溶液。本发明优点在于:1、本发明采用5羟色胺抗体和FMRF酰胺类抗体分别与α微管蛋白抗体结合，对厚壳贻贝的神经系统进行了免疫标记，并通过免疫细胞化学技术和荧光染色技术检验了厚壳贻贝的胚胎至早期幼虫阶段的不同类型神经细胞的时空分布，结果可获得清晰的荧光信号图谱，清楚地观测到厚壳贻贝胚胎及幼虫阶段的神经发育过程，并根据所得荧光信号图谱，绘制了完整的厚壳贻贝早期幼虫神经发育示意图。2、本发明对厚壳贻贝胚胎及幼虫阶段的神经发育过程的标记可用于阐明其神经发育机制，观测足区细胞形成过程，可进一步揭示厚壳贻贝浮游幼虫的附着变态机制，指导水产养殖苗种生产和海洋防污等。
附图1是厚壳贻贝胚胎以及幼虫体内FMRF酰胺类免疫阳性信号(红色)和α微管蛋白(绿色)的定位图。1.受精卵，出现第一极叶；2.桑葚期(6 h)，开始出现α微管蛋白；
3.囊胚期(12 h)，无FMRF酰胺类阳性信号出现；4.早期担轮幼虫(18 h)，第一个FMRF酰胺类免疫活性细胞(al)出现在幼虫体的顶端区域，mo (口)；5.担轮幼虫后期(24h)，FMRF酰胺类免疫阳性信号数量增加至2个；6.早期D形幼虫(30 h)，顶神经节(包含3个阳性信号)以及少量纤维；7.早期D形幼虫(36 h)，免疫信号数量继续增加，且伸出前后两个纤维，并向体前后延伸，向后伸入到未来发育的足区域；8.D形面盘幼虫(48 h)的腹面观，足左右两侧的阳性信号出现，由之前的神经细胞发出的神经纤维延伸至足细胞，并与之连接；
9.D形面盘幼虫(48h)的侧面观。附图2是厚壳贻贝胚胎及幼虫体内5-羟色胺免疫阳性信号(红色)和α微管蛋白(绿色)的定位图。1.受精卵，出现第一极体；2.桑葚期(6 h)，开始出现α微管蛋白；3.囊胚期(12 h)，无5-羟色胺阳性信号出现；4.早期担轮幼虫(18 h)，第一个5-羟色胺免疫阳性信号出现；5.担轮幼虫后期(24h)，5-羟色胺免疫阳性信号数量增加至2个，分布在幼虫体的顶端；6.30 h D形面盘幼虫，顶部阳性信号伸出细小的顶端纤毛簇；7.早期D形幼虫(36 h)，没有观察到阳性信号数量增加，免疫阳性信号伸出两条纤维向前延伸；8.D形幼虫(42 h)，5-羟色胺免疫阳性信号数量增加至2-3个，位置保持不变，分布于脑神经节区域，而且由它们发出的纤维延伸在脑神经节周围；9.D形幼虫(48 h)，5-羟色胺免疫阳性信号数量增加至4个，位置仍然没有变化。附图3是厚壳贻贝早期幼虫神经发育示意图。1.担轮幼虫早期FMRF酰胺类活性侧面观，顶部第一个FMRF酰胺类免疫阳性信号(al)出现在顶端区；2.担轮幼虫晚期阶段FMRF酰胺类免疫活性侧面观，有顶部I个阳性信号(al)和侧部一个阳性信号(rll);3.在D形幼虫阶段FMRF酰胺类免疫活性侧面观，足右侧的阳性信号(rpl)出现，由rll发出的神经纤维延伸至足细胞，并与之连接；4.担轮幼虫早期FMRF酰胺类免疫活性的腹面观，第一个FMRF酰胺类顶部免疫阳性信号(al)出现在顶端区；5.担轮幼虫晚期FMRF酰胺类免疫活性的腹面观，有I个顶阳性信号(al)和两个侧阳性信号(rll和111);6.D形幼虫阶段FMRF酰胺类免疫活性的腹面观，左右两侧的足阳性信号(Ipl和rpl)出现，由rll和111发出的神经纤维延伸至足细胞，并与之连接；7.担轮幼虫早期5-羟色胺活性侧面观，第一个5-羟色胺免疫阳性信号出现；8.担轮幼虫晚期5-羟色胺活性侧面观，5-羟色胺免疫阳性信号增加至2个；9.D形幼虫阶段5-羟色胺活性侧面观，5-羟色胺免疫阳性信号增加至3-4个，且位置保持不变，分布于脑神经节部位。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例1 I实验材料
厚壳贻贝成贝采自于浙江嵊泗县枸杞海域；5羟色胺抗体(来源于兔子)、FMRF酰胺类抗体(来源于兔子)、α微管蛋白抗体(来源于小鼠，在PBS溶液中按照1:500(体积比)稀释+1.0%(质量浓度)正常牛血清+1.0%(体积比)tritonX-100)均购于Sigma公司；山羊抗兔 Alexa568、山羊抗鼠 Alexa 488 均购于 Molecular Probes。2实验方法
2.1厚壳贻贝浮游幼虫的预处理
按照常规方法孵化厚壳贻贝受精卵，具体孵化方法是将盛有厚壳贻贝密封袋和冰块先放置于保温箱，12h后将亲贝从保温箱中取出，放置于20-22°C海水中。催产过程中，微量充气。将正在排放精子和卵子的亲贝分别单独隔离放于2L烧杯中，在倒置显微镜下观察精子活力和卵子形状，选择游速很快的精子和浑圆饱满的卵子进行混合孵化培育。从孵化开始至48 h，每6 h取样I次。取样前，搅动水体，使样品分布均匀。通过筛絹网将胚胎和幼虫收集，使用过滤海水洗涤，后置入质量浓度为7.5%的MgCl2溶液中大约20-30 min，直到幼虫完全麻痹。用新鲜的质量浓度为4%的多聚甲醛将幼虫固定在pH值7.4的PBS缓冲液中。室温下固定2 h后，PBS缓冲液洗涤后转移至体积浓度70%的乙醇中，存储在_20°C条件备用。2.2厚壳贻贝浮游幼虫的抗体结合标记
取出备用的幼虫，洗涤后加入质量浓度为5%的乙二胺四乙酸，稍加混合后室温下静置脱钙30 min。然后，将胚胎或幼虫样品在PBS缓冲液中洗涤3次，每次15 min，后加入封闭液(0.25%牛血清蛋白，1% triton-100，0.03%叠氮化钠，PBS)，4°C过夜。分别用浓度1:1000的5羟色胺抗体(来源于兔子)或浓度1:1000的FMRF酰胺类抗体(来源于兔子)和浓度1:500的α微管蛋白抗体(来源于小鼠，在PBS溶液中1:500稀释+1.0%正常牛血清+1.0% tritonX-100)结合标记，置于4°C下孵育2天，然后在PBST中洗涤I h/3次，并分别加入含有浓度为1:1000山羊抗兔Alexa568 (稀释至1:1000 (体积比))和浓度为1:1000山羊抗鼠Alexa 488 (稀释至1:1000 (体积比))的PBS中，4°C 12h。在二抗中孵育之后，所有胚胎及幼虫在PBS中洗涤若干次，然后用80%的甘油/PBS封片。2.3厚壳贻贝浮游幼虫抗体结合标记的荧光检测
将上述经抗体结合标记后的所有样品在荧光显微镜Nikon ECLIPSE 90i下检测。实验中，所检测的每个阶段每个抗体对应的胚胎或幼虫个数均大于100个。用Photoshop CS(Adobe System)调整图片的对比度和明亮度并聚焦为图片。3实验结果
厚壳贻贝胚胎以及幼虫体内FMRF酰胺类免疫阳性信号(红色)和α微管蛋白(绿色)的定位如图1所示。在厚壳贻贝从受精卵开始至囊胚期的整个胚胎发育的过程中，均无发现FMRF酰胺类(FMRFamide-1ike)免疫阳性信号。在早期担轮幼虫发育阶段(18 h)，第I个FMRF酰胺类免疫活性细胞在身体的最前部出现，即第I个顶细胞(al)，这个细胞在纤毛的顶端末尾处。当首次被检测到的时候，被特异性染色的细胞分布于细胞质中。24 h后，担轮幼虫的FMRF酰胺类免疫活性细胞增加至2个。30 h后，明显观察到FMRF酰胺类免疫活性侧细胞(左边和右边的侧细胞，分别是rll和111)数量增加至2个，且这些免疫活性侧细胞均分布在顶端区al顶细胞的背侧并贯穿在纤毛中。36 h后，更多的FMRF酰胺类免疫活性侧细胞出现在幼虫顶部区域的左右两侧。这些侧细胞伸出的阳性纤维延伸后形成基底神经纤维，并延伸至正在发育中足所在区域。在顶端区所有细胞中，al顶细胞始终处于腹部，位置没有发生变化。在D形面盘幼虫阶段(48 h)，FMRF酰胺类免疫活性细胞的基底神经纤维形成了一个紧凑的神经纤维网。这个神经纤维网以及其周围紧密连接的体细胞形成了顶器官，顶器官与之后的发育阶段保持一致。侧细胞rll和111仍然与顶端器官的细胞相分离，每个细胞延伸出两条纤维:相对较短的那条从前部伸出，而较长的那条纤维伸入后腹部进入足区(足区有I对细胞出现——左足细胞和右足细胞，rpl和Ipl )。幼虫进入D形阶段(48h)神经系统的FMRF酰胺类免疫活性细胞分别是:顶器官的3个顶细胞、2个侧细胞(rll和111)，以及足区形成的2个足细胞(rpl和lpl)。由顶细胞和侧细胞延伸出的免疫活性纤维形成基底神经纤维。厚壳贻贝胚胎及幼虫体内5-羟色胺免疫阳性信号(红色)和α微管蛋白(绿色)的定位如图2所示。在厚壳贻贝从受精开始至囊胚期的整个胚胎发育的过程中，均无发现5-羟色胺(serotonin-like)免疫阳性信号。在早期担轮幼虫发育阶段(18 h)，第I个5-羟色胺免疫活性细胞在顶端出现，即顶器官前端。这个细胞生出一个顶端簇纤毛。24 h后，5-羟色胺免疫活性细胞增加至2个。随后，在早期D形幼虫阶段，观察到免疫活性细胞伸出一个短小的基底神经纤维，延伸至后来发育成的顶器官神经纤维网部位。42 h时，更多5-羟色胺免疫活性细胞出现在顶区域，其数量已经增加至2-3个。所有这些细胞均具有顶纤毛，且这些基底纤维形成紧密的神经纤维网。幼虫发育至D形阶段(48 h)，5-羟色胺免疫活性细胞的数量增加至4个。这些细胞发出的基底纤维延伸至紧密的顶神经纤维网。上述使用5羟色胺抗体或FMRF酰胺类抗体和α微管蛋白抗体结合标记获得的厚壳贻贝胚胎以及幼虫体内抗体荧光信号图谱清晰，可清楚的观测到厚壳贻贝胚胎及幼虫节段的神经发育过程。根据上述荧光信号图谱，我们绘制了完整的厚壳贻贝早期幼虫神经发育示意图，如图3所示。综上所述，使用本发明的方法对厚壳贻贝胚胎和幼虫阶段进行标记，完整地揭示了厚壳贻贝早期幼虫神经发育过程中各个时期的细胞变化，阐明了其神经发育机制，观测到其足区细胞形成过程，这为揭示厚壳贻贝浮游幼虫的附着变态机制奠定了基础。实施例2
实施例2的操作同实施例1，不同之处仅在于步骤2.1使用的MgCl2溶液的质量浓度为
0.1% ;步骤2.2中使用的乙二胺四乙酸的质量浓度为15% ;步骤2.2中一抗5羟色胺抗体或FMRF酰胺类抗体和α微管蛋白抗体的浓度分别为1:500、1:200和1:1000，一抗孵育时间为8天；步骤2.2中二抗山羊抗兔Alexa568和山羊抗鼠Alexa 488的浓度分别为1:800、1:1200，二抗孵育时间为4 h。实施例3
实施例3的操作同实施例1，不同之处仅在于步骤2.1使用的MgCl2溶液的质量浓度为8% ;步骤2.2中使用的乙二胺四乙酸的质量浓度为0.1% ;步骤2.2中一抗5羟色胺抗体或FMRF酰胺类抗体和α微管蛋白抗体的浓度分别为1:200、1:1000和1:800，一抗孵育时间为I天;步骤2.2中二抗山羊抗兔Alexa568和山羊抗鼠Alexa 488的浓度分别为1:1000、1:1000，二抗孵育时间为8 h。实施例4
实施例4的操作同实施例1，不同之处仅在于步骤2.1使用的MgCl2溶液的质量浓度为
0.1% ;步骤2.2中使用的乙二胺四乙酸的质量浓度为0.1% ;步骤2.2中一抗5羟色胺抗体或FMRF酰胺类抗体和α微管蛋白抗体的浓度分别为1:1000、1:700和1:1000，一抗孵育时间为8天；步骤2.2中二抗山羊抗兔Alexa568和山羊抗鼠Alexa 488的浓度分别为1:800、1:1000，二抗孵育时间为10 h。实施例5
实施例5的操作同实施例1，不同之处仅在于步骤2.1使用的MgCl2溶液的质量浓度为4.5% ;步骤2.2中使用的乙二胺四乙酸的质量浓度为8% ;步骤2.2中一抗5羟色胺抗体或FMRF酰胺类抗体和α微管蛋白抗体的浓度分别为1:500、1:500和1:200，一抗孵育时间为I天;步骤2.2中二抗山羊抗兔Alexa568和山羊抗鼠Alexa 488的浓度分别为1:1200、1:800，二抗孵育时间为4 h。实施例6
实施例6的操作同实施例1，不同之处仅在于步骤2.1使用的MgCl2溶液的质量浓度为8% ;步骤2.2中使用的乙二胺四乙酸的质量浓度为0.1% ;步骤2.2中一抗5羟色胺抗体或FMRF酰胺类抗体和α微管蛋白抗体的浓度分别为1:500、1:1000和1:1000，一抗孵育时间为8天；步骤2.2中二抗山羊抗兔Alexa568和山羊抗鼠Alexa 488的浓度分别为1:1000、1:1000，二抗孵育时间为12 h。对比例I
对比例I的操作同实施例1，不同之处仅在于步骤2.1使用的MgCl2溶液的质量浓度为8.5%。
对比例2
对比例2的操作同实施例1，不同之处仅在于步骤2.2中使用的乙二胺四乙酸的质量浓度为16%。对比例3
对比例3的操作同实施例1，不同之处仅在于步骤2.2中一抗5羟色胺抗体或FMRF酰胺类抗体和α微管蛋白抗体的浓度分别为1:1200、1:1200和1:1200。对比例4
对比例4的操作同实施例1,不同之处仅在于步骤2.2中二抗山羊抗兔Alexa568和山羊抗鼠Alexa 488的孵育时间为13 h。对上述实施例2-6及对比例1-4进行厚壳贻贝浮游幼虫抗体结合标记的荧光检测，结果显示实施例4-6使用5羟色胺抗体或FMRF酰胺类抗体和α微管蛋白抗体结合标记获得的厚壳贻贝胚胎以及幼虫体内抗体荧光信号图谱清晰，可清楚的观测到厚壳贻贝胚胎及幼虫阶段的神经发育过程，对比例1-4使用5羟色胺抗体或FMRF酰胺类抗体和α微管蛋白抗体结合标记获得的厚壳贻贝胚胎以及幼虫体内抗体荧光信号显示较弱，不能清楚而连续地观测厚壳贻贝胚胎及幼虫阶段每个时期的神经发育情况。综合分析可知，MgCl2溶液的浓度、乙二胺四乙酸溶液的浓度、一抗的浓度及孵育时间、二抗的浓度及孵育时间影响到对厚壳贻贝胚胎及幼虫的抗体标记效果，其中，MgCl2溶液主用于贝类幼虫张壳，从而使抗体能够有效进入其体内；乙二胺四乙酸主用于贝类幼虫贝壳脱钙，从而使贝类贝壳变薄或透明化；而一抗、二抗的浓度及孵育时间决定抗体和目标物的结合数量及结合强度，只有在合适的参数条件下才能对样品有效标记，达到能观测到荧光且各种荧光信号清晰可辨的程度。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种研究厚壳贻贝胚胎和幼虫神经发育的方法，其特征在于，它包括以下步骤: a)将厚壳贻贝的胚胎和幼虫置入质量浓度为0.1-8%的MgCl2溶液中处理20-30 min,用多聚甲醛将幼虫固定在PBS缓冲液中； b)取出步骤a)处理后的幼虫，洗涤后用质量浓度0.1-15%的乙二胺四乙酸静置脱钙，然后将胚胎或幼虫样品用PBS缓冲液洗涤后加入封闭液； c)用浓度1:200-1:1000的5羟色胺抗体或浓度1:200-1:1000的FMRF酰胺类抗体和浓度1:200-1:1000的α微管蛋白抗体结合标记步骤b)的厚壳贻贝胚胎和幼虫，4°C下孵育1-8天，再用PBST洗涤后分别加入含有浓度为1:800-1:1200 二抗的PBS溶液中，4°C下孵育4-12小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的MgCl2溶液的质量浓度为7.5%，所述的乙二胺四乙酸的质量浓度为5%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的二抗的浓度为1:1000。
4.据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的二抗是山羊抗兔和山羊抗鼠二抗。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的封闭液是含质量浓度0.25%牛血清蛋白、质量浓度1% triton-100和质量浓度0.03%叠氮化钠的PBS溶液。
全文摘要
本发明提供一种研究厚壳贻贝胚胎和幼虫神经发育的方法a)将胚胎和幼虫置入质量浓度为0.1-8%的MgCl2溶液中处理，用多聚甲醛固定幼虫；b)取出处理后的幼虫，洗涤后用质量浓度0.1-15%乙二胺四乙酸静置脱钙，然后用PBS洗涤后加入封闭液；c)用浓度1:200-1:1000的5羟色胺抗体或FMRF酰胺类抗体和α微管蛋白抗体结合标记厚壳贻贝胚胎和幼虫，4℃孵育1-8天，再用PBST洗涤后分别加入含有浓度为1:800-1:1200二抗的PBS中，4℃孵育4-12小时。使用该方法可获得清晰的荧光信号图谱，清楚观测到胚胎及幼虫阶段的神经发育过程，为揭示厚壳贻贝浮游幼虫的附着变态机制奠定了基础。
文档编号G01N33/68GK103076457SQ201310008239
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月10日 优先权日2013年1月10日
发明者杨金龙, 李树恒, 梁箫, 李家乐 申请人:上海海洋大学