一种动物血浆中氢溴酸槟榔碱含量的测定方法
【专利摘要】本发明涉及一种动物血浆中氢溴酸槟榔碱含量的测定方法。该方法将高效液相色谱-串联质谱联用技术应用于动物血浆中氢溴酸槟榔碱的含量测定，以β-蒎烯为内标，能准确测定动物血浆中氢溴酸槟榔碱的含量。本发明专属性强，用快速、准确、灵敏的高效液相色谱-串联质谱联用法进行动物血浆中氢溴酸槟榔碱的含量测定，分离效果好，方法线性、稳定性、重现性、回收率试验均达较好的技术要求，为该药物在动物体内的药物代谢动力学和生物等效性研究奠定了方法学基础。
【专利说明】一种动物血浆中氢溴酸槟榔碱含量的测定方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于药物分析领域，涉及一种定量测定动物血浆中氢溴酸槟榔碱含量的方法。
[0003]
【背景技术】
[0004][0002]槟榔碱是中药槟榔中的活性成分之一，在兽医临床上主要用于治疗绦虫、牛前胃迟缓，以及马属动物胃扩张、大肠阻塞、肠麻痹等畜禽病。另外，利用槟榔碱的灭钉螺协同作用，可显著降低化学灭螺药的投药量，与此减少了对环境造成的污染。由于槟榔碱应用于动物具有明显的副作用，在重要的经济动物及宠物上的使用受到了限制。槟榔碱其氢溴酸盐有良好的促进胃肠运动作用和驱虫作用，氢溴酸槟榔碱对多种寄生虫有驱除作用，可以代替目前临床上常用的传统产品，尤其对犬绦虫驱虫效果能达到100%，临床效果显著，有广阔的推广应用前景，属高效、安全、污染少、残留小、价廉、使用方便的农业投入品，有利于解决当前畜牧养殖业中寄生虫病的防治问题。由于氢溴酸槟榔碱紫外最大吸收波长215nm，属于末端吸收，紫外吸收很弱，高效阳离子交换色谱法和高效液相色谱_紫外检测法灵敏度不高，且目前无动物血浆中氢溴酸槟榔碱检测方法的报道。为了解决动物血浆中氢溴酸槟榔碱含量测定问题，需在分析检测技术中寻求突破，以提高检测的灵敏度和准确性。
[0005]HPLC — MS/MS (液相色谱-串联质谱)联用技术是当前比较新颖的技术，因其结合了液相色谱的高效分离能力和质谱的准确定性能力，近年来成为最可靠实用的分析手段。该分析技术需样量少、检测限低，尤其适用于药物在机体代谢等因素的作用下所产生的分解物或代谢物的结构研究和量的变化。
【发明内容】
[0006]鉴于上述，本发明的目的在于提供一种检测动物血浆中氢溴酸槟榔碱含量的测定方法。该方法将高效液相色谱-串联质谱联用技术应用于动物血浆中氢溴酸槟榔碱的含量测定，以β -菔烯为内标，能准确测定动物血浆中氢溴酸槟榔碱的含量。
[0007]本发明的目的通过以下技术方案来实现:
一种动物血浆中氢溴酸槟榔碱含量的测定方法，其步骤是:
a、取空腹动物静脉空白血浆，加入氢溴酸槟榔碱标准品溶液、内标溶液，涡旋混合，加0.1M的AgNO3,润旋30-40s,加入NaCl,润旋2_3min,力口石油醚，润旋2_3min,离心30-40min，分离有机层置于另一离心管中，40°C水浴中氮气吹干，加超纯水溶解残渣，得标准血浆溶液，过0.45Mm或0.22Mm微孔滤膜，得标准血浆溶液，待测；
b、取口服给药后的动物血浆，加入内标溶液，涡旋混合，加0.1M的AgNO3,涡旋30-40s，加入NaCl，涡旋2-2.5min,加石油醚，涡旋2-2.5min,离心30_40min，分离有机层置于另一离心管中，40-50°C水浴中氮气吹干，加超纯水溶解残渣，过0.45Mm或0.22Mm微孔滤膜，得供试品溶液，待测；
C、高效液相色谱-串联质谱联用分别测定a、b步骤得到的标准血浆溶液和供试品溶液，测定的条件是用碳十八烷基键合硅胶固定相色谱柱，流动相乙腈与PH为4的甲酸铵水溶液比值为8: 92 ;流速0.4mL.mirT1 ;电喷雾ESI源；喷雾电压Is为4kv ;雾化温度:3500C ;雾化气流量:11 L/min ;碰撞气流量:10 L.mirT1 ;毛细管出口端电压:50v ;碰撞能量:20v;deta EMV+:180v ;检测方式为正离子多反应监测(MRM)，用于定量分析的槟榔碱母/子离子对为m/z 156.2一 53.0 ；
d.将a、b步骤得到的标准血浆溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测，得到总离子流图和质谱图，测定峰面积，以槟榔碱和内标的峰面积比(Y)对血浆中槟榔碱浓度(X)进行线性回归，得线性关系和回归方程，计算待测物浓度。
[0008]上述氢溴酸槟榔碱标准品溶液、内标溶液分别为精密称取氢溴酸槟榔碱标准品适量，用水溶解并定容得到氢溴酸槟榔碱标准品溶液；精密称取菔烯适量，用无水乙醇溶解并定容得到内标溶液。
[0009]上述所述动物可为犬等肉食兽和禽类等。
[0010]本发明的优点:
1、本发明样品处理方法简便易操作，方法回收率在95%左右，RSD(%)小于3%，满足分析检测要求。
[0011]2、采用本发明将HPLC-MS/MS技术应用于动物血浆中氢溴酸槟榔碱的检测，被测组分检测灵敏度提高，检测限低(I ng.mL—1)，青蒿琥酯、青蒿素及二氢青蒿素峰分离度好，分析时间短，在3分钟内即可完成待测物的检测，需样量少(仅需I μ I )，溶剂用量少，成本低，含量测定结果准确，重复性、稳定性好。
[0012]3、氢溴酸槟榔碱是有效防治人畜共患绦虫病和动物吸虫病的高效抗寄生虫兽用药物，用本发明的方法，能方便快捷、准确的检测动物血浆中槟榔碱的含量，为氢溴酸槟榔碱在动物体内的药代动力学和生物等效性研究奠定了方法学基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为空白血浆样品总离子流图(TIC图)。
[0014]图2为槟榔碱和内标物β -菔烯总离子流图(TIC图)。
[0015]图3为槟榔碱一级质谱图。
[0016]图4为槟榔碱二级质谱图。
【具体实施方式】
[0017]下面列举实施例对本发明作进一步的说明，该实施例仅用于说明本发明而对本发明并没有限制。
[0018]实施例:
本发明使用的氢溴酸槟榔碱片剂(主要成分为氢溴酸槟榔碱，辅料为预胶化淀粉、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁。生产地:兰州)是兰州畜牧与兽药研究所自主研制的新型抗动物绦虫病兽药，在兽医临床上主要用于治疗犬绦虫病，驱虫效果能到达100%，疗效显著，β-菔烯为内标物质。
[0019]I材料与方法
1.1仪器
Aglient 1200-6410型快速液相色谱一三重四极杆质谱联用仪，(美国Aglient公司)，电喷雾离子源(ESI);离心机；AEL-1600型电子天平(日本岛津)；ΖΗ_ΙΙ型自动漩涡混合器，(天津药典标准仪器厂)。
[0020]1.2药品与试剂
氢溴酸槟榔碱标准品(中国药品生物制品检定所)；氢溴酸槟榔碱片剂((兰州畜牧与兽药研究所自主研制)；β菔烯(日本TCI公司购得)；甲醇为色谱纯，乙酸为分析纯，水为超纯水。
[0021]1.3色谱条件
色谱柱为Aglient C18柱(2.1 X 30mm, 3.5um);流动相为乙腈:水(甲酸铵调pH至4)=8: 92 ;流速0.4mL.mirT1 ;柱温室温；进样体积为luL。
[0022]1.4质谱条件 电喷雾ESI源；喷雾电压Is为4kv ;雾化温度:350°C ;雾化气流量:11 L/min ;碰撞气流量:10 L.mirT1 ;毛细管出口端电压:50v ;碰撞能量:20v ；deta EMV+:180v ;检测方式为正离子多反应监测(MRM)，用于定量分析的槟榔碱母/子离子对为m/z 156.2— 53.0。
[0023]1.5标准品溶液及内标液的配制
精密称取氢溴酸槟榔碱标准品0.lmg，用水溶解并定容得到1.(^g ?mL—1氢溴酸槟榔碱溶液；精密称取β -菔烯50μL，用无水乙醇溶解并定容得到10μ1.mL—1的内标溶液。
[0024]1.6血样采集及处理 1.6.1动物给药
取健康比格犬4只，分别在给药前限食12h，称重，编号。给药前先喂给稀释的碘酊5~10mL防止呕吐,经过l(T20min,按3mg/kg体重剂量,分别口服给予氢溴酸槟榔碱片剂。
[0025]1.6.1空白血浆的采集
给药前使用一次性EDTA真空采血管静脉采集血液，采血量为5 ml，离心10 min，分离血浆，吸取上清液，得空白血浆，放于离心管中保存在-20 1:待分析。
[0026]1.6.2血浆样品的采集
给药后40min使用一次性EDTA真空采血管静脉采集血液，采血量为5 ml，离心10 min,分离血浆，吸取上清液，得血浆样品，放于另一离心管中保存在-20 1:待分析。
[0027]1.7标准血浆溶液的处理
取“1.6.1”空白血浆Iml于IOmL离心管中，加入标准品溶液和内标溶液各ΙΟμL，充分混匀后加0.1M的AgNO3100μL,涡旋30s，加入0.4g NaCl，涡旋2min，加石油醚3mL，涡旋2min，离心30min，分离有机层置于另一 5mL离心管中，40°C水浴中氮气吹干，加200μL超纯水溶解残渣，得标准血浆溶液，备用。
[0028]1.8供试品溶液的处理
取“1.6.2”血浆样品Iml于IOmL离心管中，加入内标溶液ΙΟμL，充分混匀后加0.1M的AgNO3100μL,润旋30s,加入0.4g NaCl,润旋2min,加石油醚3mL,润旋2min,离心30min,分离有机层置于另一 5mL离心管中，40°C水浴中氮气吹干，加200μL超纯水溶解残渣，得供试品溶液，备用。
[0029]1.9 测定
分别吸取标准血浆溶液和供试品溶液各5 μ 1，用0.22 μ m微孔滤膜过滤后进HPLC-MS/MS分析。
[0030]2 结果
2.1方法专属性
取犬空白血浆I mL，除不加内标外，其他按“1.7”项进行操作，进样5PL，得总离子流图，见图1 ;将一定浓度的标准品溶液和内标溶液加入空白血浆中，依“1.7”项下进行操作，从图中可以看出:空白血浆中的内源性物质不干扰槟榔碱和β_菔烯的测定。总离子流图及质谱图见图2-4。图2为槟榔碱和内标物菔烯总离子流图(TIC图)。从图中可以看出两化合物峰形好，峰 分离度好，分析时间短仅需3min ;图3为槟榔碱一级质谱图。得到的槟榔碱母离子为[M+H] + ；
图4为槟榔碱二级质谱图，用于定量的子离子为m/z 53.0，辅助定量子离子m/z 81.0
2.2线性关系考察
取犬空白血浆ImL,共6份，分别配置5.0、20、80、320ng.mL'l.3μ g.mL'
5.2 μ g.mL-1的标准血浆溶液，按步骤“ 1.V’操作下进行处理，按“ 1.3、1.4”项下色谱质谱条件进样，测定峰面积。以槟榔碱和内标的峰面积比(Y)对血浆中槟榔碱浓度(X)进行线性回归，得回归方程为y = 0.0075x + 0.0584，R2=0.9994，线性范围为5-200 ng.mL'
[0031]取标准血浆溶液，分别配置成浓度分别为10、5、2.5、2、1 ng -mm-1的溶液，按“1.3、1.4”项下色谱质谱条件进样，测定槟榔碱的最低检测限(S/N=10)和最低定量限(S/N=3)。测得检测限为I ng.mL—1，定量限为2ng.mL'
[0032]检测限和定量限是用标准血浆溶液测定得到的，测定方法是先测定标准血浆溶液，得到标准曲线及回归方程；然后测定供试品溶液，将得到的峰面积代入回归方程计算得到最终浓度。
[0033]2.3精密度与准确度
配制高、中、低三种 浓度的标准血浆溶液，分别加入10 μ I的内标溶液，配制方法同“ 1.7”，血浆样品处理后，得到浓度分别为5、40、100 ng -ml-1的标准血浆样品溶液，按“ 1.3、
1.4”项下色谱质谱条件进样，三种浓度样品在I天内连续进样5次，连续5天进样，进行浓度测定，计算日内变异系数、日间变异系数。结果表明，在本试验条件下该方法准确、可靠、重现性好。结果见表1。
[0034]表1氢溴酸槟榔碱在血浆样品中检测的精密度
【权利要求】
1.一种动物血浆中氢溴酸槟榔碱含量的测定方法，其步骤是: a、取动物空腹静脉空白血浆，加入氢溴酸槟榔碱标准品溶液、内标溶液，涡旋混合，加0.1M的AgNO3,润旋30-40s,加入NaCl,润旋2_3min,力口石油醚，润旋2_3min,离心30-40min，分离有机层置于另一离心管中，40°C水浴中氮气吹干，加超纯水溶解残渣，得标准血浆溶液，过0.45Mm或0.22Mm微孔滤膜，得标准血浆溶液，待测； b、取动物口服给予氢溴酸槟榔碱后的血浆，加入内标溶液，涡旋混合，加0.1M的AgNO3,润旋30-40s,加入NaCl,润旋2-2.5min,加石油醚,润旋2-2.5min,离心30_40min,分离有机层置于另一离心管中，40-50°C水浴中氮气吹干，加超纯水溶解残渣，过0.45Mfli或0.22Mm微孔滤膜，得供试品溶液，待测； C、高效液相色谱-串联质谱联用分别测定a、b步骤得到的标准血浆溶液和供试品溶液，测定的条件是用碳十八烷基键合硅胶固定相色谱柱，流动相乙腈与PH为4的甲酸铵水溶液比值为8: 92;流速0.4mL.miiT1;电喷雾ESI源；喷雾电压Is为4kv;雾化温度:350°C ;雾化气流量:11 L/min ;碰撞气流量:10 L.mirT1 ;毛细管出口端电压:50v ;碰撞能量:20v;deta EMV+:180v ;检测方式为正离子多反应监测(MRM)，用于定量分析的槟榔碱母/子离子对为m/z 156.2一 53.0 ； d.将a、b步骤得到的标准血浆溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测，得到总离子流图和质谱图，测定峰面积，以槟榔碱和内标的峰面积比(Y)对血浆中槟榔碱浓度(X)进行线性回归，得线性关系和回归方程，计算待测物浓度。
2.根据权利要求1所述的一种动物血浆中氢溴酸槟榔碱含量的测定方法，其特征在于，所述氢溴酸槟榔碱标准品溶液、内标溶液分别为精密称取氢溴酸槟榔碱标准品适量，用水溶解并定容得到氢溴酸槟榔碱标准品溶液；精密称取菔烯适量，用无水乙醇溶解并定容得到内标溶液。
3.根据权利要求1所述的一种动物血浆中氢溴酸槟榔碱含量的测定方法，其特征在于，所述动物可为犬、牛，猪。
【文档编号】G01N30/88GK103940935SQ201310023215
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2013年1月23日 优先权日:2013年1月23日
【发明者】李冰, 张继瑜, 周绪正, 牛建荣, 魏小娟, 李金善, 李剑勇, 杨亚军, 刘希望 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所