专利名称：一种同时测定甲氨蝶呤和亚叶酸钙的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用季铵化多壁碳纳米管修饰电极同时测定甲氨蝶呤及亚叶酸钙的方法，属于电化学分析技术领域。
背景技术：
甲氨蝶呤(methotrexate, MTX),又称氨甲喋呤,是一种蝶唳类抗肿瘤药物，临床上大剂量给药主要用于治疗白血病、淋巴瘤等恶性肿瘤，同时小剂量给药用于类风湿疾病及关节炎等。亚叶酸I丐(calcium folinate, CF )是四氢叶酸I丐甲酰衍生物的I丐盐,系叶酸在体内的活化形式。由于甲氨蝶呤具有一定的毒性，在肿瘤临床治疗中，患者服用大剂量甲氨蝶呤后通常需要再服用亚叶酸钙进行解毒。因此，建立一种简单快速同时测定甲氨蝶呤及亚叶酸钙的方法对疾病的诊断、治疗及预后判断具有重要价值。甲氨蝶呤和亚叶酸钙常见的分析方法为高效液相色谱法、毛细管电泳法等，通常以紫外、荧光及质谱等作为检测器进行分析。紫外灵敏度低且干扰性大；荧光检测通常需要通过衍生化，较为繁琐；而质谱所使用仪器价格昂贵，运行成本高。迄今为止，未见直接以电化学检测法同时测定甲氨蝶呤和亚叶酸钙的报道。碳纳米管由于具有巨大的比表面积，良好的导电性、吸附性及促进电子传递，被广泛应用于修饰电极的研究，碳纳米管修饰电极能使氧化过电位降低，电化学信号大大增强。碳纳米管由于在大多数溶剂中团聚，极大地限制了碳纳米管在电化学领域的应用。目前主要通过对碳纳米管进行非共价修饰和简单的共价修饰(羧基化)来改善其分散性，用于制备碳纳米管修饰电极。
发明内容
本发明正是针对现有技术的改进，提供一种功能化碳纳米管修饰电极，并将该制备电极应用于甲氨蝶呤和亚叶酸钙的同时检测，本发明的具体技术方案如下:本发明是一种功能化碳纳米管修饰电极电化学分析系统，利用碳纳米管，将碳纳米管共价修饰成新型季铵化碳纳米管并带正电荷，与阳极化预处理的带负电荷的玻碳电极表面静电作用，制得更稳定的碳纳米管薄膜修饰电极，所述的碳纳米管粒径小，比表面积大，易修饰，导电性良好，能促进电子传递，碳纳米管修饰电极能使反应过电位大大降低，电化学信号增强，所述的碳纳米管带正电，易吸附呈阴离子形态的甲氨蝶呤和亚叶酸钙。本发明所述的功能化碳纳米管修饰电极电化学分析系统的碳纳米管修饰电极与裸玻碳电极相比，活性大大增加，促进甲氨蝶呤及亚叶酸钙的电催化氧化，极大地提高了灵敏度。本发明所述的功能化碳纳米管修饰电极电化学分析系统的修饰电极应用于电分析系统能快速实现甲氨蝶呤及亚叶酸钙电化学分离，并同时对其进行定量检测。本发明所述的功能化碳纳米管修饰电极电化学分析系统可以用于检测复杂基体生物样品中低浓度的甲氨蝶呤及亚叶酸钙。本发明具有如下优点和效果:
1.本发明利用碳纳米管粒径小，比表面积大，易修饰，导电性良好，能促进电子传递，碳纳米管修饰电极能使反应过电位大大降低，电化学信号增强等优点，将碳纳米管共价修饰成新型季铵化碳纳米管并带正电荷，与阳极化预处理的带负电荷的玻碳电极表面静电作用，制得更稳定的碳纳米管薄膜修饰电极，由于碳纳米管带正电，更易吸附呈阴离子形态的甲氨蝶呤和亚叶酸钙。与裸玻碳电极相比，该碳纳米管修饰电极活性大大增加，促进甲氨蝶呤及亚叶酸钙的电催化氧化，极大地提高了灵敏度。2.本发明将该修饰电极应用于电分析系统能快速实现甲氨蝶呤及亚叶酸钙电化学分离，并同时对其进行定量检测。该方法不需预分离，快速简单，分析时间短。灵敏度高，可以用于检测复杂基体生物样品中低浓度的甲氨蝶呤及亚叶酸钙。
图1为功能化碳纳米管修饰电极组装示意图；图2为分别以裸玻碳电极和功能化碳纳米管修饰电极作为工作电极在pH=7.0缓冲溶液中对甲氨蝶呤催化氧化的循环伏安图；图3为分别以裸玻碳电极和功能化碳纳米管修饰电极作为工作电极在pH=7.0缓冲溶液中对亚叶酸钙催化氧化的循环伏安对比图；图4为以功能化碳纳米管修饰电极作为工作电极，利用差示脉冲伏安法对甲氨蝶呤进行测定的差示脉冲伏安图及峰电流与浓度的线性图；图5为以功能化碳纳米管修饰电极作为工作电极，利用差示脉冲伏安法对亚叶酸钙进行测定的差示脉冲伏安图及峰电流与浓度的线性图；图6为以功能化碳纳米管修饰电极作为工作电极，利用差示脉冲伏安法对尿液中甲氨蝶呤及亚叶酸钙进行测定的差示脉冲伏安图。图1中标记为:1-功能化碳纳米管；2_阳极化玻碳电极图2中标记为:1-裸玻碳电极对空白磷酸缓冲溶液的响应；2_裸玻碳电极对甲氨蝶呤的响应；3-功能化碳纳米管修饰电极对空白磷酸缓冲溶液的响应；4_功能化碳纳米管修饰电极对甲氨蝶呤的响应；5_甲氨蝶呤氧化峰(20 μΜ)图3中标记为:1-裸玻碳电极对空白磷酸缓冲溶液的响应；2_裸玻碳电极对亚叶酸钙的响应；3-功能化碳纳米管修饰电极对空白磷酸缓冲溶液的响应；4_功能化碳纳米管修饰电极对亚叶酸钙的响应；5-亚叶酸钙氧化峰(20 μ Μ)图4中标记为:1-甲氨蝶呤(0.1-8 μΜ) ;2-亚叶酸钙(8 μ Μ)图5中标记为:1-甲氨蝶呤(8 μΜ) ;2-亚叶酸钙(0.1-6.5 μ Μ)图6中标记为:1-空白尿液样品；2_加标尿液样品；3_亚叶酸钙(加标0.5 μ Μ);4_甲氨蝶呤(力口标 0.5 μ Μ)具体实施方案本发明是一种碳纳米管修饰电极电化学分析系统，碳纳米管通过共价修饰得到季铵化碳纳米管，该功能化碳纳米管分散性好并且带正电荷，通过静电作用牢固地吸附在阳极化预处理的裸玻碳电极表面，形成新型碳纳米管薄膜修饰电极，以该修饰电极作为工作电极，更易吸附呈阴离子态的甲氨蝶呤及亚叶酸钙。以功能化碳纳米管修饰电极作为工作电极，通过循环伏安法(cyclicvoltammetry, CV)在磷酸缓冲溶液(PBS)中对甲氨蝶呤和亚叶酸I丐进行测定,通过与裸玻碳电极对比，功能化碳纳米管修饰电极极大促进甲氨蝶呤和亚叶酸钙的电催化氧化，两者氧化电位相差310 mV,可完全实现电化学分离。通过对pH及扫速等条件进行优化后，利用差示脉冲伏安法(differential pulse voltammetry, DPV)对甲氨蝶呤和亚叶酸|丐进行同时测定，并成功应用于尿液样品中甲氨蝶呤和亚叶酸钙的检测。下面结合说明书附图对本发明的技术方案作进一步具体的说明:裸玻碳电极依次用0.3 μ m,0.05 μ m的a-Al2O3抛光,并先后在无水乙醇和去离子水中超声清洗5 min，Ag/AgCl (饱和KCl溶液)为参比电极，钼丝电极为对电极。在0.1M HClO4溶液中对裸玻碳电极在+1.8 V电位下阳极化预处理360 S。MWNTs首先在浓HNO3溶液中加热回流8小时，然后将所得黑色悬浮液过滤，并用去离子水充分洗涤，最后在红外灯下干燥得羧基化碳纳米管。准确称取50 mg羧基化碳纳米管，加入到5.00 mL氯化亚砜，氮气保护在45°C下加热回流24 h,用四氢呋喃洗涤并真空干燥，得到酰氯化的碳纳米管。40 mg酰氯化碳纳米管与3 ml乙二胺混合在60°C加热回流24 h，用甲醇洗涤残余的乙二胺，干燥后得到胺基化的碳纳米管，最后胺基化碳纳米管与碘甲烷反应，再用KBr将碘离子置换，得到带正电荷的季铵化碳纳米管。取10 mg季铵化碳纳米管到10 ml去离子水中超声波振荡20 min，使其分散成黑色溶液，取5 μ L该溶液滴注到玻碳电极上自然展开铺平，在红外灯下干燥，即得到修饰好的碳纳米管修饰的玻碳电极。图1为功能化碳纳米管修饰电极组装示意图。图2为分别以裸玻碳电极和功能化碳纳米管修饰电极作为工作电极在ρΗ=7.0缓冲溶液中对甲氨蝶呤催化氧化的循环伏安图，采用循环伏安法，分别用裸玻碳电极和功能化碳纳米管修饰电极作为工作电极，Ag/AgCl (饱和KCl溶液)为参比电极，钼丝电极为对电极，扫速为0.05 V s—1，电位扫描范围为-1.0 V +1.0 V，在pH=7.0的磷酸缓冲溶液中对甲氨蝶呤的电催化氧化循环伏安对比图(其中甲氨蝶呤浓度为20 μΜ)，由对比图可看出，功能化碳纳米管修饰电极对甲氨蝶呤有极好的电催化氧化效果。图3为分别以裸玻碳电极和功能化碳纳米管修饰电极作为工作电极在ρΗ=7.0缓冲溶液中对亚叶酸钙催化氧化的循环伏安对比图，采用循环伏安法，分别用裸玻碳电极和功能化碳纳米管修饰电极作为工作电极，Ag/AgCl (饱和KCl溶液)为参比电极，钼丝电极为对电极，扫速为0.05 V s—1，电位扫描范围为-1.0 V +1.0 V，在pH=7.0的磷酸缓冲溶液中对亚叶酸钙的电催化氧化循环伏安对比图(其中亚叶酸钙浓度为20 μ Μ),由对比图可看出，碳纳米管修饰电极对亚叶酸钙有极好的电催化氧化效果，且相同条件下甲氨蝶呤与亚叶酸钙的的氧化电位相差310 mV，可实现电化学分离。图4为以功能化碳纳米管修饰电极作为工作电极，利用差示脉冲伏安法对甲氨蝶呤进行测定的差示脉冲伏安图及峰电流与浓度的线性图，采用差示脉冲伏安法，功能化碳纳米管修饰电极作为工作电极，Ag/AgCl (饱和KCl溶液)为参比电极，钼丝电极为对电极，扫速为0.0l V s—1，电位扫描范围为O V +1.0 V，脉冲振幅为0.05 V,脉冲周期为0.02s，脉冲宽度为0.05 S，在含有8 μ M亚叶酸钙的ρΗ=7.0的磷酸缓冲溶液中对不同浓度(0.1-8 μΜ)的甲氨蝶呤进行测定的差示脉冲伏安图及峰电流与浓度的线性关系图。图5为以功能化碳纳米管修饰电极作为工作电极，利用差示脉冲伏安法对亚叶酸钙进行测定的差示脉冲伏安图及峰电流与浓度的线性图，采用差示脉冲伏安法，功能化碳纳米管修饰电极作为工作电极，Ag/AgCl (饱和KCl溶液)为参比电极，钼丝电极为对电极，扫速为0.01 V s_S电位扫描范围为O V +1.0 V，脉冲振幅为0.05 V,脉冲周期为0.02s，脉冲宽度为0.05 S，在含有8 μΜ甲氨蝶呤的ρΗ=7.0的磷酸缓冲溶液中对不同浓度(0.1-6.5 μ Μ)的亚叶酸钙进行测定的差示脉冲伏安图及峰电流与浓度的线性关系图。该方法甲氨蝶呤和亚叶酸 丐的检测限分别为0.015 μ M和0.020 μ Mo图6为采用差示 脉冲伏安法及以上电极和条件对尿液中甲氨蝶呤及亚叶酸钙测定的差示脉冲伏安图。以上列举的仅是本发明的具体实施例，显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种功能化碳纳米管修饰电极电化学分析系统，其特征在于，利用碳纳米管，将碳纳米管共价修饰成新型季铵化碳纳米管并带正电荷，与阳极化预处理的带负电荷的玻碳电极表面静电作用，制得更稳定的碳纳米管薄膜修饰电极，所述的碳纳米管粒径小，比表面积大，易修饰，导电性良好，能促进电子传递，碳纳米管修饰电极能使反应过电位大大降低，电化学信号增强，所述的碳纳米管带正电，易吸附呈阴离子形态的甲氨蝶呤和亚叶酸钙。
2.根据权利要求1所述的功能化碳纳米管修饰电极电化学分析系统的用途，其特征在于，所述的碳纳米管修饰电极与裸玻碳电极相比，活性大大增加，促进甲氨蝶呤及亚叶酸钙的电催化氧化，极大地提高了灵敏度。
3.根据权利要求1所述的功能化碳纳米管修饰电极电化学分析系统的用途，其特征在于，所述的功能化碳纳米管修饰电极电化学分析系统的修饰电极应用于电分析系统能快速实现甲氨蝶呤及亚叶酸钙电化学分离，并同时对其进行定量检测。
4.根据权利要求1所述的功能化碳纳米管修饰电极电化学分析系统的用途，其特征在于，所述的功能化碳纳米管修饰电极电化学分析系统可以用于检测复杂基体生物样品中低浓度的甲氨蝶呤及亚叶酸钙。
全文摘要
本发明涉及一种利用季铵化多壁碳纳米管修饰电极同时测定甲氨蝶呤及亚叶酸钙的方法，属于电化学分析技术领域。利用碳纳米管，将碳纳米管共价修饰成新型季铵化碳纳米管并带正电荷，与阳极化预处理的带负电荷的玻碳电极表面静电作用，制得更稳定的碳纳米管薄膜修饰电极，所述的碳纳米管粒径小，比表面积大，易修饰，导电性良好，能促进电子传递，碳纳米管修饰电极能使反应过电位大大降低，电化学信号增强，所述的碳纳米管带正电，易吸附呈阴离子形态的甲氨蝶呤和亚叶酸钙。本发明将该修饰电极应用于电分析系统能快速实现甲氨蝶呤及亚叶酸钙电化学分离，并同时对其进行定量检测。该方法不需预分离，快速简单，分析时间短。灵敏度高，可以用于检测复杂基体生物样品中低浓度的甲氨蝶呤及亚叶酸钙。
文档编号G01N27/48GK103196983SQ20131005963
公开日2013年7月10日 申请日期2013年2月26日 优先权日2013年2月26日
发明者朱作艺, 习玲玲 申请人:浙江大学