专利名称：一种高效液相色谱梯度法测定左亚叶酸钙有关物质的方法
技术领域：
本发明涉及左亚叶酸钙及左亚叶酸钙相关制剂的分析方法，具体涉及ー种用高效液相色谱梯度法进行測定的方法，属于药物制剂分析检测领域。
背景技术：
左亚叶酸钙为左亚叶酸的钙盐，其化学名称为(_)-N-[4[[[(6S)-2-氨基-5-甲酰基-1，4，5，6，7，8-六氢-4-氧代-6-蝶啶基]甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸钙盐五水合物。与5-氟尿嘧啶合用，用于治疗胃癌和结直肠癌。左亚叶酸钙的主要杂质有7种，其在左亚叶酸钙的合成过程中生成，在储藏过程中还有可能产生降解产物。左亚叶酸钙与其中一种杂质ニ氢叶酸结构相似，在现有的检测方法中难以完全分离；另外，左亚叶酸酸性较强，在等度分离中需加入相应的离子对试剂，存在所得主峰理论板数低，主峰与相邻杂峰分离差、灵敏度低、色谱柱使用时间短，方法耐用性差等问题。
发明内容
为了克服上述问题，本发明的目的在于提供一种采用高效液相色谱梯度法对左亚叶酸钙、左亚酸钙中间体及含左亚叶酸钙的相关制剂进行检查的测定方法。本发明的高效液相色谱梯度法可对上述制剂中的杂质A:(2S)-2-[(4-氨基苯甲酰)氨基]戊ニ酸；C:(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-I，4-ニ氢-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊ニ酸；D :(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-I，4-ニ氢-6-蝶啶基)甲基]甲酰氨基]苯甲酰基]氨基]戊ニ酸；G :25)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4，7，8-四氢_6_蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊ニ酸和其它杂质进行有效的分离和含量測定。本发明的技术方案为ー种高效液相谱梯度法检测左亚叶酸钙待测样品中有关物质的方法，其特征在干，该检测方法包括以下步骤(I)制备标准品溶液，以所述标准品溶液在下述色谱条件下进行系统适用性试验，校定检测系统；色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶(250X4. Omm, 5 μ m)为填充剂，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以磷酸盐缓冲液-甲醇(40 60)为流动相B，梯度洗脱，柱温为35 40°C,优选40°C,流速为O. 9 I. lml/min,优选I. Oml/min,检测波长为280nm ；标准品溶液制备分别取杂质A、C、D、G及左亚叶酸钙标准品，精密称定，加水制成每Iml溶液中分别含杂质A、C、D、G及左亚叶酸钙各O. 005 O. Olmg的混合溶液；精密量取10 μ I所述混合溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，校定检测系统至左亚叶酸钙主峰与相邻杂质G的峰的分离度应大于I. 5，理论板数按左亚叶酸钙计算应不低于 5000 ；其中，所述A是(2S)-2_[(4-氨基苯甲酰)氨基]戊ニ酸，C是(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-I，4-ニ氢-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊ニ酸，D是(2S)-2-[[4-[ [(2-氨基-4-氧代-I，4-ニ氢-6-蝶啶基)甲基]甲酰氨基]苯甲酰基]氨基]戊ニ酸，G是2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-I，4，7，8-四氢_6_蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊ニ酸。(2)制备供试品溶液和对照溶液取左亚叶酸钙待测样品，加水制成浓度为lmg/ml的溶液，作为供试品溶液；量取所述供试品溶液，加水制成浓度为O. O lmg/ml的溶液，作为对照溶液；(3)通过高效色谱测定待测样品中的左亚叶酸钙及相关物质的含量以对照溶液注入经上述步骤(I)校定后的液相色谱仪，调节检测灵敏度，再将供试品溶液注入液相色谱仪，在步骤(I)所述的色谱条件下进行高效液相色谱，记录色谱图至左亚叶酸钙主峰保留时间的2. 5倍，其中供试品溶液色谱中各杂质峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积的2倍； (4)计算待测样品中各杂质的含量。进ー步地，上述的梯度洗脱中，流动相A比例的变化范围为于O 20分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从90%变化为66%，流动相B的比例从10%变化为34%;于20 42分钟，等度洗脱，流动相A的比例保持66%不变，流动相B的比例保持34%不变；于42 43分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从66%变化为90%，流动相B的比例从34%变化为10% ;于43 50分钟，流动相A和B回到初始比例，色谱柱重新平衡。进ー步地，上述磷酸盐选自磷酸氢ニ钠、磷酸氢ニ钾、磷酸氢ニ铵的ー种或多种。进ー步地，上述磷酸盐缓冲液包括O. 01mol/L磷酸氢ニ钠、O. 08%四丁基氢氧化铵，pH值为7. 8 8.0。进ー步地，上述左亚叶酸钙待测样品包括左亚叶酸钙原料、左亚叶酸钙中间体、注射用左亚叶酸钙和左亚叶酸钙注射液。本发明通过使用高效液相色谱梯度法測定左亚叶酸钙及相关物质，通过对色谱条件的探索，确定了可以有效分离左亚叶酸钙及相关物质的色谱条件，克服了以往方法主峰理论板数低、主峰与相邻杂峰分离度差、灵敏度低、色谱柱不耐用的缺点。传统方法常用高效液相色谱等度法测定本品的有关物质，但由于色谱柱不耐用及灵敏度低的缺点，难以在合成左亚叶酸钙及制剂生产过程中有效控制有关物质，本发明方法有效提高了灵敏度、相邻杂峰与主峰之间的分离度，大大延长了色谱柱的使用寿命，从原来只能进样几十针提升至几千针。本发明方法适用于左亚叶酸钙中间体、左亚叶酸钙原料及含左亚叶酸钙的相关制齐U，如冻干粉针以及注射液。本发明检测方法准确，操作简单，灵敏度高，精密度好，可以充分满足有关物质检查与分解产物測定的要求，较好地控制样品中的特定杂质与非特定杂质，保证产品质量，在实际工作中实用性强。
图I是左亚叶酸钙以及杂质A、C、D、G标准品的色谱图；其中，I为杂质A，2为左亚叶酸钙主峰，3为杂质G，4为杂质D，5为杂质C。图2是左亚叶酸钙原料供试品溶液的色谱图(批号20120301)。
具体实施例方式仪器Agilent 1100系列高效液相色谱仪，试剂磷酸氢ニ钠(分析纯)，10%四丁基氢氧化铵(分析纯)，甲醇(色谱纯，Merk公司)色谱柱ThermoODS 柱(250 X 4. Omm, 5 μ m)标准品的来源左亚叶酸钙自制，纯度99. 6%，批号20120101 ;其制备方法取左亚叶酸钙原料经こ醇-水重结晶，干燥，即得。杂质A:
化学名(2S) -2- [ (4-氨基苯甲酰)氨基]戊ニ酸来源sigma，批号BCBD6281杂质C 化学名(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-I，4-ニ氢-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊ニ酸来源sigma，批号107K0741V杂质D 化学名(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-I，4-ニ氢-6-蝶啶基)甲基]甲酰氨基]苯甲酰基]氨基]戊ニ酸来源EP，批号00AZJ3杂质G 化学名(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-I，4，7，8-四氢-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊ニ酸来源sigma，批号028K5007V左亚叶酸钙原料及中间体參照公开号为CN 1401647A、名称为《高比旋度的左旋亚叶酸钙及拆分方法》中的方法制得。注射用左亚叶酸钙參照公开号为CN 1456162A、名称为《左亚叶酸钙的注射药剂及制备方法》中的方法制得。左亚叶酸钙注射液參照美国专利号US2006/0058312A1，名称为《Stabilizedaqueous preparation for injection))中的方法制得。实施例I高效液相色谱梯度法的条件筛选I、色谱条件与系统适用性试验I. I流动相的选择參照相关文献并结合试验具体情況，先后选用甲醇-水、甲醇-磷酸盐缓冲液(0. 01mol/L磷酸氢ニ钠，0. 08 %四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH值为7. 8)、こ腈-水、乙腈-磷酸盐缓冲液(0. 01mol/L磷酸氢ニ钠，0. 08 %四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH值为
7.8)，甲醇-水-冰醋酸，こ腈-水-冰醋酸，甲醇-水-三氟醋酸，こ腈-水-三氟醋酸等作为流动相的组成，以左亚叶酸钙主峰与最难分离杂质G的分离度与左亚叶酸钙主峰的理论板数和对称度作为评价指标，最后确定以磷酸盐缓冲液(0. Olmol/L磷酸氢ニ钠，0. 08%四丁基氢氧化铵，用磷酸调PH值为7.0 8. 0)为流动相A，以磷酸盐缓冲液(O.Olmol/L磷酸氢ニ钠，O. 08%四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH值为7. O 8. O)-甲醇(40 60)为流动相B，磷酸盐缓冲液(O. Olmol/L磷酸氢ニ钠，O. 08%四丁基氢氧化铵)的最佳pH值为7.8左右，照下表I进行梯度洗脱。流动相选择结果见下表2。表I.流动相与洗脱时间
权利要求
1.一种高效液相谱梯度法检测左亚叶酸钙待测样品中有关物质的方法，其特征在干，该检测方法包括以下步骤 (1)制备标准品溶液，以所述标准品溶液在下述色谱条件下进行系统适用性试验，校定检测系统； 色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶(250X4. Omm, 5 μ m)为填充剂，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以磷酸盐缓冲液-甲醇(40 60)为流动相B，梯度洗脱，柱温为35 40°C，流速为O. 9 I. lml/min,检测波长为280nm ； 标准品溶液制备分别取杂质A、C、D、G及左亚叶酸钙标准品，精密称定，加水制成每Iml溶液中分别含杂质A、C、D、G及左亚叶酸钙各O. 005 O. Olmg的混合溶液，精密量取10μ I所述混合溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，校定检测系统至左亚叶酸钙主峰与相邻杂质G的峰的分离度应大于I. 5，理论板数按左亚叶酸钙峰计算应不低于5000 ； 其中，所述A是(2S)-2-[(4-氨基苯甲酰)氨基]戊ニ酸，C是(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4_氧代-1，4-ニ氢-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊ニ酸，D是(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-I，4-ニ氢-6-蝶啶基)甲基]甲酰氨基]苯甲酰基]氨基]戊ニ酸，G是(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4，7，8-四氢-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊ニ酸。
(2)制备供试品溶液和对照溶液 取左亚叶酸钙待测样品，加水制成浓度为lmg/ml的溶液，作为供试品溶液； 量取所述供试品溶液，加水制成浓度为O. O lmg/ml的溶液，作为对照溶液； (3)通过高效液相色谱测定待测样品中的相关物质的含量 以对照溶液注入经上述步骤(I)校定后的液相色谱仪，调节检测灵敏度，再将供试品溶液注入液相色谱仪，在步骤(I)所述的色谱条件下进行高效液相色谱测定，记录色谱图至左亚叶酸钙主峰保留时间的2. 5倍，其中供试品溶液色谱中各杂质峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积的2倍； (4)计算待测样品中各杂质的含量。
2.权利要求I所述的方法，其中所述的梯度洗脱中，流动相A比例的变化范围为于O 20分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从90%变化为66%，流动相B的比例从10%变化为34% ;于20 42分钟，等度洗脱，流动相A的比例保持66%不变，流动相B的比例保持34 %不变；于42 43分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从66 %变化为90 %，流动相B的比例从34%变化为10% ;于43 50分钟，流动相A和B回到初始比例，色谱柱重新平衡。
3.如权利要求I所述的方法，其中所述磷酸盐选自磷酸氢ニ钠、磷酸氢ニ钾、磷酸氢ニ铵的ー种或多种。
4.如权利要求I所述的方法，其中所述磷酸盐缓冲液包括O.01mol/L磷酸氢ニ钠、O.08%四丁基氢氧化铵，pH值为7.8 8. O。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在干，所述色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶(250 X 4. 0mm，5 μ m)为填充剂，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以磷酸盐缓冲液-甲醇(40 60)为流动相B，梯度洗脱，柱温为40°C，流速为l.Oml/min，检测波长为280nm。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述左亚叶酸钙待测样品包括左亚叶酸钙原料、左亚叶酸钙中间体、注射用左亚叶酸钙和左亚叶酸钙注射液。
全文摘要
本发明公开了一种左亚叶酸钙的高效液相色谱分析法，具体是以十八烷基硅烷键合硅胶(250×4.0mm，5μm)为填充剂，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以磷酸盐缓冲液-甲醇(40∶60)为流动相B，梯度洗脱；取左亚叶酸钙或左亚叶酸钙制剂，加水制成含左亚叶酸钙1mg/ml的溶液，作为供试品溶液，并用水稀释制成每1ml中约含0.01mg的溶液，作为对照溶液。分别进样，供试品溶液的色谱图中各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2倍。本发明的方法克服了以往方法主峰理论板数低、主峰与相邻杂峰的分离度差、灵敏度低、色谱柱不耐用的缺点。可快速准确的检测出左亚叶酸钙的杂质及降解产物，操作简单，重现性好，灵敏度高，可较好地控制左亚叶酸钙产品质量。
文档编号G01N30/36GK102841169SQ20121029442
公开日2012年12月26日 申请日期2012年8月17日 优先权日2012年8月17日
发明者刘小柔, 高媛, 李勇, 严启新, 马春铭, 王丽丽, 湛常娟, 冯汉林 申请人:深圳海王药业有限公司