一种食品中莱克多巴胺含量的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种食物中莱克多巴胺含量的检测方法，其特征在于包括下述步骤：制备捕获探针、制备信号探针、对待测样品进行处理、使用血糖仪进行检测。与现有技术相比较，本发明通过酶的催化作用将信号转化为血糖仪可以检测的葡萄糖信号，实现了非糖物质的血糖仪现场检测，具有高稳定性、较低的检测限和较宽的检测范围，且检测成本低，检测程序简单，检测效果好，尤其是一般人员即可在现场进行检测，避免了现有技术中必须专业人员在实验室操作的严苛要求。
【专利说明】—种食品中莱克多巴胺含量的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及到物质的检测分析方法，具体指一种食品中莱克多巴胺含量的检测方法。
【背景技术】
[0002]莱克多巴胺属于β -兴奋剂，能使动物体内的营养成分由脂肪向肌肉转移，表现出营养再分配效应，进而调控动物体的物质代谢，增强脂肪分解，促进蛋白质合成，显著提高胴体瘦肉率和饲料报酬。但是，它们的滥用及在动物性食物中的残留严重危害着人们的健康和生命安全，并严重影响了我国畜禽产品的出口贸易。世界上大多数国家都明文禁止莱克多巴胺用作饲料添加剂。
[0003]对于莱克多巴胺的检测，目前应用比较成熟的方法和技术，例如质谱分析、色谱法、光谱和酶联免疫吸附法(ELISA)，能够达到高准确度、灵敏的定量检测，但它们大都非常昂贵，需要复杂的仪器和精细的操作，需要专业人员在实验室中进行，不适合应用于日常的现场检测中。从实用角度来说，尽量降低成本、简化程序、能够进行定量分析对于现场检测非常重要。尤其是对于现代分析系统而言，侧重的焦点渐渐转向家庭或现场的便携式快速食物检测。现有的莱克多巴胺已经不适合这种检测方向的转变。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种检测成本低、检测程序简单且可现场进行的食品中莱克多巴胺含量的检测方法。
[0005]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种食品中莱克多巴胺含量的检测方法，其特征在于包括下述步骤:
[0006]⑴制备捕获探针:
[0007]取0.08-0.12g平均粒径为I μ m的Fe3O4磁珠分散在60_100mL乙醇和15_25mL水的混合液中，在35-53HZ下超声8-12min，加入0.8-1.2mL浓度为26_30wt%的氨水；随后，逐滴加入1.5-2.5ml正硅酸乙酯，180-220rpm机械搅拌，室温下反应10_14h ；
[0008]通过磁性分离得到的纳米粒子用水和乙醇依次清洗3-5次，清洗干净溶液中不能被磁铁吸附的悬浮微粒，然后在50-70°C下真空干燥，得到包裹有二氧化硅层的Fe3O4磁珠Fe3O4QSiO2 ；
[0009]向180-220mL 无水甲苯中加入 0.4-0.6g Fe3O4OSiO2 和 1.8-2.2mL3_ 氨丙基三乙氧基硅烷，在100-140°C下搅拌10-14h，得到氨基化的Fe3O4OSiO2 ；
[0010]向40-60ml ρΗ7_7.5的PBS磷酸盐缓冲溶液中加入0.4-0.6g羧甲基化的β -环糊精、0.15-0.25gl-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.15-0.25g N-羟基琥珀酰亚胺和上述得到的氨基化的Fe3O4OSiO2，搅拌10-14h进行活化，得到Fe3O4OSiO2-CD捕获探针；
[0011]⑵制备信号探针:[0012]将0.8-1.2ml浓度为0.08-0.12mg/ml的莱克多巴胺抗体Ab加入到0.8-1.2mlEnvision试剂(该名词在网络上查询不到，在教科书上有类似的名词吗)中，3_5°C下250-350rpm搅拌0.5_lh，得到复合物溶液；
[0013]取0.08-0.12ml上述复合物溶液加入到2_3ml胶体金溶液(浓度？)中，3_5°C下搅拌4.5-5.5h，11000-13000rpm离心10_15min后，弃去上清液，将沉淀分散在0.8-1.2mlPH7-7.5的PBS缓冲液中，得到Envision试剂(上述上溶液，这里是试剂，是否可统一为试齐[J)-抗体-胶体金复合物；
[0014]向0.8-1.2ml上述合成的Envision试剂-抗体-胶体金溶液中加入450-550 μ L浓度为8_12mg/ml的鹿糖酶溶液,于3_5°C下搅拌5_7h, 11000-13000rpm离心10_15min后，弃去上清液，所得沉淀分散到0.8-1.2ml含有0.8-1.2wt%牛血清蛋白的pH为7-7.5的PBS缓冲液中，得到Envision试剂-抗体-胶体金-酶复合物，即为信号探针；
[0015]⑶莱克多巴胺的检测:
[0016]按常规方法处理待测样品，氮气吹干后用0.8-1.2mL pH7_7.5的PBS缓冲液重分散得到待测样品溶液；
[0017]将捕获探针Fe3O4OSiO2-CD分散在含有浓度为0.8-1.2wt%的牛血清蛋白、pH7_7.5的PBS缓冲液，制备成浓度为0.8-1.2mg/mL的捕获探针分散液；
[0018]吸取0.8-1.2mL所述分散液加入到所述的混合溶液中，室温下振摇1.5-2.5h进行吸附，磁性分离后用PBS缓冲液冲洗2-5次；之后加入80-120 μ LEnvision试剂-抗体-胶体金-酶复合物，室温下振荡反应25-35min，磁性分离后所得沉淀物用缓冲液清洗后，加入45-55 μ L蔗糖溶液，室温下反应1.5-2.5h后，磁性分离出沉淀后吸取上层清液用血糖仪检测，记录血糖仪的读数；
[0019](4)将得到的读数与标准曲线比对，即可得知所检测物质中莱克多巴胺的浓度。
[0020]与现有技术相比较，本发明选用环糊精制备捕获探针，环糊精是七个葡萄糖单位组成的低聚糖，环形结构具有疏水内腔和亲水表面，能够选择性的吸附各种客体分子，在疏水空腔内形成稳定的主客体络合物。此外，β_环糊精是环保的，具有水溶性，能够提高功能性材料的溶解度和稳定性，对目标分子的强识别性和富集功能，价格低廉，仅为抗体价格的万分之一。而制备信号探针所使用的Envision试剂是一种枝桠样的链状复合物，本身结合有第二抗体和HRP酶；EnviSion试剂的链状结构使得它的负载量增加，从而达到信号放大的效果。本发明结合β_环糊精主客体反应，对样品中的待测物莱克多巴胺进行富集；用Envision试剂偶联吸附了鹿糖酶的金纳米粒子作为信号探针,利用Envision的链状结构增加蔗糖酶的负载量，达到信号放大的效果，之后通过Envision试剂上的第二抗体结合莱克多巴胺抗体，经抗原抗体反应将信号探针与待测物抗原结合；利用信号探针上的蔗糖酶将蔗糖溶液水解成葡萄糖进行血糖仪检测，测得的葡萄糖浓度与待测物浓度成正比。
[0021]本发明采用β_环糊精的主客体反应来捕获和富集样品中的莱克多巴胺，经过抗原抗体反应将信号探针和待测物结合，利用信号探针上的蔗糖酶将蔗糖水解成葡萄糖来进行血糖仪定量检测；从而提供了一种莱克多巴胺含量的现场检测方法，利用主客体反应对莱克多巴胺进行富集，可快速简单地实现待测物的富集；通过酶的催化作用将信号转化为血糖仪可以检测的葡萄糖信号，实现了非糖物质的血糖仪现场检测，具有高稳定性、较低的检测限和较宽的检测范围，且检测成本低，检测程序简单，检测效果好，尤其是一般人员即可在现场进行检测，避免了现有技术中必须专业人员在实验室操作的严苛要求。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为本发明实施例中标准曲线关系图。
【具体实施方式】
[0023]以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0024]准备工作:制备标准曲线。
[0025]将莱克多巴胺加入到PBS缓冲液中，制备成不同重量浓度的莱克多巴胺的、pH为
7.4的混合溶液；同时，还配置一个不含莱克多巴胺的空白样品。
[0026]⑴制备捕获探针:
[0027]取0.1g Fe3O4磁珠(平均粒径I μ m)分散在80mL乙醇和20mL水的混合液中，35Hz超声IOmin,加入ImL浓度为28wt%的氨水；随后,逐滴加入2ml正娃酸乙酯,200rpm机械搅拌，室温下反应12h ；
[0028]通过磁性分离得到的纳米粒子用水和乙醇依次清洗3次，直至溶液中不能被磁铁吸附的悬浮微粒被清洗干净后，60°C真空干燥，得到包裹有二氧化硅层的Fe3O4磁珠Fe3O4OSiO2 ；
[0029]向200mL无水甲苯中加入0.5g Fe3O4OSiO2和2mL3_氨丙基三乙氧基娃烧，在120°C下搅拌12h，得到氨基化的Fe3O4OSiO2 ；
[0030]向50ml pH7.2的PBS磷酸盐缓冲溶液中加入0.5g羧甲基化的β-环糊精(CM-0-CD)、0.2gl-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、0.2g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和上述得到的氨基化的Fe3O4OSiO2，混合物搅拌12h进行活化，得到Fe3O4OSiO2-⑶捕获探针；
[0031]⑵制备信号探针:
[0032]将Iml0.lmg/ml莱克多巴胺抗体Ab加入到Iml Envision溶液中，4°C下300rpm搅拌lh，得到复合物溶液；
[0033]0.01wt%氯金酸(IOOmL) 200rpm搅拌下加热煮沸后，快速加入2.5mLlwt%的朽1檬酸钠，继续煮沸lOmin，待溶液变为酒红色，得到胶体金溶液；
[0034]取0.1ml上述复合物溶液加入到2.5ml胶体金溶液中，4°C下搅拌5h，12000rpm离心IOmin后,弃去上清液,将沉淀分散在Iml pH7.4的PBS缓冲液中，得到Envision试剂-抗体-胶体金复合物；
[0035]Iml上述合成的Envision试剂-抗体-胶体金溶液中加入500 μ L10mg/ml鹿糖酶溶液，于4°C下搅拌6h，12000rpm离心IOmin后，弃去上清液，所得沉淀分散到Iml含有1%牛血清蛋白的pH为7.4的PBS缓冲液中，得到Envision试剂-抗体-胶体金-酶复合物(Au-Envision-Ab-酶)，即为信号探针；
[0036]⑶标准曲线的绘制:
[0037]将上述捕获探针Fe3O4OSiO2-⑶分散在含有浓度为lwt%的牛血清蛋白、pH7.4的PBS缓冲液，制备成浓度为lmg/mL的捕获探针分散液；[0038]向每个不同浓度的莱克多巴胺混合溶液中分别加入ImL分散液，室温下振摇2h进行吸附，磁性分离后得到的沉淀物用缓冲液冲洗3次；之后加入IOOyLAu-Envision-Ab-酶复合物,室温下振荡反应30min,磁性分离后所得沉淀物用缓冲液清洗后，加入50 μ L蔗糖溶液，室温下反应2h后，磁性分离沉淀后吸取上层溶液用血糖仪检测，记录血糖仪的读数；
[0039]以莱克多巴胺的量为横坐标，血糖仪的读数为纵坐标，制备莱克多巴胺-血糖仪读数标准曲线。该标准曲线如图1所示。
[0040]实施例1
[0041]检测猪肉中莱克多巴胺的含量
[0042]从当地超市购买不同的猪肉和肝脏样本，按常规方法分别进行处理。处理方法简述如下:
[0043]将样品绞碎后，取1.0克均匀分散在2mL的3%三氯乙酸中，用涡旋仪涡动至均匀后再加入ImL乙腈并充分摇匀。随后，以4000rpm离心10分钟，收集上层清液。之后，将收集的上清液用10wt%碳酸钠调节pH值为9.8±0.2，然后加入0.8克氯化钠。随后，用2mL乙酸乙酯充分振荡混匀萃取两次，4000rpm离心10分钟。取上层液体于50?60°C下氮气流吹干，加入Iml PBS缓冲液充分振荡摇匀，用于检测。
[0044]本实施例中的猪肉样品共制备了十份，猪肝样品制备了十份。
[0045]取五份猪肉样品进行如下处理:猪肉样品I不做任何处理，按下述方法处理后直接进行检测；向猪肉样品2至5中分别加入一定量的莱克多巴胺，具体加入浓度详见表I所示，然后按下述方法处理后进行检测。检测结果如表I所示。
[0046]取五份猪肝样品进行如下处理:对猪肝样品I和样品2不做任何处理，按下述方法处理后进行检测，向猪肝样品3至5中分别加入一定量的莱克多巴胺，具体加入浓度详见表
2所示。然后按下述方法处理后进行检测。
[0047]样品的处理方法为:
[0048]免疫复合物的夹心反应:将Fe3O4OSiO2-CD分散在含有1%BSA的pH7.4PBS中，制备成lmg/mL的分散液。向ImL上述样品溶液中分别加入ImL上述分散液,室温下振摇2h进行吸附，磁性分离后用缓冲液冲洗3次；之后加入100 μ L Au-Envision-Ab-酶复合物，振荡混匀室温下反应30min，磁性分离后用缓冲液清洗去未结合的复合物，得到夹心免疫复合物。
[0049]使用血糖仪对莱克多巴胺的检测:向上述夹心免疫复合物中加入50 μ L蔗糖溶液，室温下反应2h后，吸取上层溶液用血糖仪检测，记录相应的读数。
[0050]将该读数比对标准曲线，即可得到莱克多巴胺浓度。根据该浓度计算猪肉和肝脏中莱克多巴胺的含量。每个浓度做三个平行。检测结果相对标准偏差RSD都小于6%，检测
重复率良好。
[0051]表I为猪肉样品及莱克多巴胺加标猪肉样品的检测试验。
[0052]表I
[0053]
【权利要求】
1.一种食物中莱克多巴胺含量的检测方法，其特征在于包括下述步骤: ⑴制备捕获探针: 取0.08-0.12g平均粒径为I μ m的Fe3O4磁珠分散在60_100mL乙醇和15_25mL水的混合液中，在35-53HZ下超声8-12min，加入0.8-1.2mL浓度为26_30wt%的氨水；随后，逐滴加入1.5-2.5ml正硅酸乙酯，180-220rpm机械搅拌，室温下反应10_14h ； 通过磁性分离得到的纳米粒子用水和乙醇依次清洗3-5次，清洗干净溶液中不能被磁铁吸附的悬浮微粒，然后在50-70°C下真空干燥，得到包裹有二氧化硅层的Fe3O4磁珠Fe3O4OSiO2 ； 向180-220mL无水甲苯中加入0.4-0.6g Fe3O4OSiO2和1.8-2.2mL3_氨丙基三乙氧基硅烧，在100-140°C下搅拌10-14h，得到氨基化的Fe3O4OSiO2 ； 向40-60ml pH7-7.5的PBS磷酸盐缓冲溶液中加入0.4-0.6g羧甲基化的β -环糊精、.0.15-0.25gl-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.15-0.25g N-羟基琥珀酰亚胺和上述得到的氨基化的Fe3O4OSiO2，搅拌10-14h进行活化，得到Fe3O4OSiO2-CD捕获探针；⑵制备信号探针: 将0.8-1.2ml浓度为0.08-0.12mg/ml的莱克多巴胺抗体Ab加入到0.8-1.2mlEnvision试剂(该名词在网络上查询不到，在教科书上有类似的名词吗)中，3-5°C下250-350rpm搅拌0.5_lh，得到复合物溶液； 取0.08-0.12ml上述复合物溶液加入到2_3ml胶体金溶液(浓度？)中，3_5°C下搅拌4.5-5.5h，11000-13000rpm离心10_15min后，弃去上清液，将沉淀分散在0.8-1.2mlPH7-7.5的PBS缓冲液中，得到Envision试剂(上述上溶液，这里是试剂，是否可统一为试齐[J)-抗体-胶体金复合物； 向0.8-1.2ml上述合成的Envision试剂-抗体-胶体金溶液中加入450-550 μ L浓度为8-12mg/ml的鹿糖酶溶液,于3-5°C下搅拌5-7h, 11000-13000rpm离心10_15min后,弃去上清液，所得沉淀分散到0.8-1.2ml含有0.8-1.2wt%牛血清蛋白的pH为7-7.5的PBS缓冲液中，得到Envision试剂-抗体-胶体金-酶复合物，即为信号探针； ⑶莱克多巴胺的检测: 按常规方法处理待测样品，氮气吹干后用0.8-1.2mL pH7-7.5的PBS缓冲液重分散得到待测样品溶液； 将捕获探针Fe3O4OSiO2-CD分散在含有浓度为0.8-1.2wt%的牛血清蛋白、pH7_7.5的PBS缓冲液，制备成浓度为0.8-1.2mg/mL的捕获探针分散液； 吸取0.8-1.2mL所述分散液加入到所述的混合溶液中，室温下振摇1.5-2.5h进行吸附，磁性分离后用PBS缓冲液冲洗2-5次；之后加入80-120 μ LEnvision试剂-抗体-胶体金-酶复合物，室温下振荡反应25-35min，磁性分离后所得沉淀物用缓冲液清洗后，加入.45-55 μL蔗糖溶液，室温下反应1.5-2.5h后，磁性分离出沉淀后吸取上层清液用血糖仪检测，记录血糖仪的读数； (4)将得到的读数与标准曲线比对，即可得知所检测物质中莱克多巴胺的浓度。
【文档编号】G01N33/02GK103792328SQ201410015040
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月13日 优先权日:2014年1月13日
【发明者】干宁, 陈思, 曹玉廷, 胡富陶, 李天华, 崔焕 , 张佳斌, 王德, 熊萍 申请人:宁波大学