一种血液及尿液中硫化氢的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种血液及尿液中硫化氢的检测方法。利用硫化氢与对氨基二甲基苯胺及三氯化铁作用，形成疏水性的亚甲基蓝，通过分散液液微萃取，既分离了尿液、血液基体对显色反应的干扰，又进行富集，提高了检测的灵敏度。所加入乙腈消除基体干扰，同时起到分散液液微萃取中分散剂的作用，萃取效果好，富集倍数大，检测限可达到0.02μg/mL。方法具有准确度高、检测样本量大、检测样品量少、检测效率高等特点。
【专利说明】一种血液及尿液中硫化氢的检测方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于体内药物检测【技术领域】，具体涉及一种血液及尿液中硫化氢的检测方法。 【背景技术】
[0002]内源性硫化氢(H2S)是一种新近发现的气体信号分子，对神经、心血管、消化、呼吸、代谢以及生殖系统的生理功能具有重要的调节意义，而且参与这些系统的许多疾病的病理生理调节，尤其与心血管系统紧密相连，拓展了 H2S在心血管系统的药理学领域，以H2S为靶点的治疗具有潜在的临床应用前景。越来越多的证据表明内源性H2S与多种疾病有着密切的关系，在临床多种疾病中，内源性H2S的生成和代谢发生了改变，并进一步影响了疾病的发展过程。一种可靠、准确的血液、尿液中内源性H2S的测定方法对监测体内H2S含量及相关疾病的预测及诊断有重要意义。
[0003]H2S检测方法主要包括亚甲基兰分光光度法、硫离子选择电极法、荧光衍生法、气相色谱法、荧光探针及免疫分析法等。目前现有H2S检测技术主要集中在大气、水等环境样品中。其检测灵敏度在lmg/kg，而体内内源性硫化氢(H2S)含量在Mmol级，且基体干扰大及样品量少等影响，目前没有成熟检测技术及方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种稳定性好、干扰小、准确、灵敏测定血液及尿液中硫化氢含量的方法。
[0005]本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
[0006]除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。
[0007]一种血液及尿液中硫化氢的检测方法，包括以下步骤:
(1)硫化氢标准工作曲线的制作:分别取S2-浓度为Wg/mL的Na2S标准溶液0.20、
0.50、1.00,2.00,5.0OmL，加入0.2%对氨基二甲基苯胺200μ?，立即加盖缓慢倒转均匀，加入50%三氯化铁溶液I滴，用蒸懼水稀释至5mL,摇匀,放置20min。于波长665nm处,测定吸光度，制作工作曲线，得到硫化氢的线性回归方程、相关系数、相对标准偏差、回收率；
(2)样品检测:
尿液的检测:取5mL尿液，加入0.2%对氨基二甲基苯胺200μ?，立即加盖缓慢倒转均匀，再加入50%三氯化铁溶液I滴，用蒸馏水稀释至5mL，摇匀，放置20min。加入有机溶剂萃取剂300μ?，加入乙腈0.5~2mL，涡旋混合lmin，离心，分相，将有机溶剂萃取剂取出，于波长665nm处，测定吸光度，代入回归方程，计算出样品中硫化氢的含量；
血液的检测:取5mL新鲜血液，放入离心机中离心，取上清液，加入pH2酸性乙腈lmL，离心分离，取上清液2mL，加入0.2%对氨基二甲基苯胺200μ?，立即加盖缓慢倒转均匀，再加入50%三氯化铁溶液I滴，用蒸馏水稀释至5mL，摇匀，放置20min。加入有机溶剂萃取剂300μ?,润旋混合lmin,离心,分相,将有机溶剂萃取剂取出，于波长665nm处,测定吸光度，代入回归方程，计算出样品中硫化氢的含量；
其中，步骤(1) (2)中所述的0.2%对氨基二甲基苯胺为0.1g对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶于50mL 6mol/L盐酸；三氯化铁溶液为25g三氯化铁溶于50mL蒸馏水中；有机萃取剂包括四氯化碳、三氯甲烷、二氯甲烷中之一种；分散剂包括甲醇、乙腈、丙酮中之一种；离心时间 10-25min，离心速率 3000-8000r / min。
[0008]相对于现有技术，本发明具有以下显著优点:
1、通过硫化氢与三氯化铁及对氨基二甲基苯胺作用，形成疏水性的亚甲基蓝，利用分散液液微萃取技术萃取亚甲基蓝，既分离了三价铁离子、尿液、血液基体对显色反应的干扰，又进行富集，提高了检测的灵敏度，检测限可达到0.02Pg/mL。
[0009]2、通过加入乙腈消除基体干扰，同时起到分散液液微萃取中分散剂的作用，萃取效果好，富集倍数大。
【具体实施方式】
[0010]下面结合实施例对本发明作进一步地说明，但本发明的保护范围并不限于此。
[0011]实施例1
利用本发明检测人 体尿液中硫化氢的含量。
[0012]1、硫化氢标准工作曲线的制作:分别取S2I农度为lPg/mL的Na2S标准溶液0.20、
0.50、1.00,2.00,5.0OmL，加入0.2%对氨基二甲基苯胺200μ?，立即加盖缓慢倒转均匀，再加入50%三氯化铁溶液I滴，用蒸馏水稀释至5mL，摇匀，放置20min。加入有机溶剂萃取剂30(^L，乙腈0.5mL，于波长665nm处，测定吸光度，得到线性回归方程y=0.5805x+0.0015，相关系数R2=0.9980，6次平行测定，相对标准偏差RSD=L 21、回收率=94.5% ；
2、尿液的检测:取5mL尿液，加入0.2%对氨基二甲基苯胺200μ?，立即加盖缓慢倒转均匀，再加入50%三氯化铁溶液I滴，用蒸馏水稀释至5mL，摇匀，放置20min。加入三氯甲烷300μ?,乙腈0.5mL,润旋混合lmin,4000r / min离心IOmin,分相,取出管底三氯甲烧,于波长665nm处，测定吸光度为0.031，代入步骤(1)所得的线性回归方程，计算出尿液中硫化氢的含量为0.053Pg/mL。
[0013]实施例2
利用本发明检测人体血液中硫化氢的含量。
[0014]1.按实施例1制作硫化氢标准工作曲线。
[0015]2.血液的检测:取5mL新鲜血液,放入离心机中，离心6000r / min离心20min,取上清液，加入pH2酸性乙腈lmL, 5000r / min离心IOmin,取上清液2mL,加入0.2%对氨基二甲基苯胺200μ?，立即加盖缓慢倒转均匀，再加入50%三氯化铁溶液I滴，用蒸馏水稀释至5mL,摇匀，放置20min。加入四氯化碳300μ?,润旋混合lmin, 3500r / min离心12min,分相，取出管底四氯化碳，于波长665nm处，测定吸光度为0.028，代入步骤(1)所得的线性回归方程，计算出血液中硫化氢的含量为0.(MOPg/mL。
[0016]实施例3
利用本发明检测人体血液中硫化氢的含量。
[0017]1.按实施例1制作硫化氢标准工作曲线。
[0018]2.血液的检测:取5mL新鲜血液,放入离心机中，离心8000r / min离心IOmin,取上清液，加入pH2酸性乙腈lmL, 6000r / min离心5min,取上清液2mL,加入0.2%对氨基二甲基苯胺200μL，立即加盖缓慢倒转均匀，再加入50%三氯化铁溶液I滴，用蒸馏水稀释至5mL,摇匀，放置20min。加入二氯化碳300μ?,润旋混合lmin,5000r / min离心5min,分相，取出管底二氯化碳，于波长665nm处，测定吸光度为0.026，代入步骤(1)所得的线性回归方程,计算出血液中硫化氢 的含量 为0.043Pg/mL。
【权利要求】
1.一种血液及尿液中硫化氢的检测方法，包括以下步骤: (1)硫化氢标准工作曲线的制作:分别取S2-浓度为Wg/mL的Na2S标准溶液0.20、0.50、1.00,2.00,5.0OmL，加入0.2%对氨基二甲基苯胺200μ?，立即加盖缓慢倒转均匀，再加入50%三氯化铁溶液I滴，用蒸馏水稀释至5mL，摇匀，放置20min，于波长665nm处，测定吸光度，制作工作曲线，得到硫化氢的线性回归方程、相关系数、相对标准偏差、回收率； (2)样品检测: 尿液的检测:取5mL尿液，加入0.2%对氨基二甲基苯胺200μ?，立即加盖缓慢倒转均匀，再加入50%三氯化铁溶液I滴，用蒸馏水稀释至5mL，摇匀，放置20min，加入有机溶剂萃取剂300μ?，乙腈0.5 mL,涡旋混合lmin，离心，分相，将有机溶剂萃取剂取出，于波长665nm处，测定吸光度，代入回归方程，计算出样品中硫化氢的含量； 血液的检测:取5mL新鲜血液，放入离心机中离心，取上清液，加入pH2酸性乙腈lmL，离心分离，取上清液2mL，加入0.2%对氨基二甲基苯胺200μ?，立即加盖缓慢倒转均匀，再加入50%三氯化铁溶液I滴，用蒸馏水稀释至5mL，摇匀，放置20min，加入有机溶剂萃取剂300μ?,润旋混合lmin,离心,分相,将有机溶剂萃取剂取出，于波长665nm处,测定吸光度，代入回归方程，计算出样 品中硫化氢的含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:所述的0.2%对氨基二甲基苯胺为0.1g对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶于50mL 6mol/L盐酸。
3.权利要求1所述的检测方法，其特征在于:所述的50%三氯化铁溶液为25g三氯化铁溶于50mL蒸馏水中。
4.权利要求1所述的检测方法，其特征在于:分散剂包括甲醇、乙腈、丙酮中之一种。
5.权利要求1所述的检测方法，其特征在于:所述的有机萃取剂包括四氯化碳、三氯甲烷、二氯甲烷中之一种。
6.权利要求1所述的检测方法，其特征在于:所述的离心时间10-25min，离心速率3000-8000r / min0
【文档编号】G01N21/31GK103776786SQ201410062197
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年2月22日 优先权日:2014年2月22日
【发明者】杨亚玲, 赵娇, 宁金艳, 王军, 吕云辉 申请人:云南健牛生物科技有限公司