一种血液中亚硝酸盐的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种血液中亚硝酸盐的快速检测方法。利用多孔板和酶标仪测定亚硝酸盐与Griess形成的有色络合物的吸光度，将不含亚硝酸盐血液作为制作工作曲线基体溶液，消除了血液基体的干扰，提高检测的灵敏度及准确性。方法具有准确度高、检测样本量大、检测样品量少、检测效率高等特点。
【专利说明】一种血液中亚硝酸盐的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于体内药物检测【技术领域】，具体涉及一种血液亚硝酸盐的检测方法。
【背景技术】
[0002]一氧化氮(NO)是一种对心血管、内分泌、神经和免疫系统起调控作用生物信号分子，发展一种血液及体液中NO简单、准确的检测方法对其在临床、药物中的作用是非常重要的。NO具有结构简单、低分子量、高亲脂性及自由基等特点，在体内极不稳定，有很短半衰期，仅有几秒钟，易形成亚硝酸盐和硝酸盐。直接进行NO检测是困难的，作为相对稳定的NO代谢产物，亚硝酸盐(N02_)在最近10年成为世界医学界的热点，通过测定血液及体液中的N<V的含量来反映体内NO含量和作为反应多项身体机能的重要指标或疾病诊断。
[0003]目前亚硝酸盐检测亚硝酸盐的测定方法有离子色谱法、分光光度法、荧光光度法、高效液相色谱法等。食品中亚硝酸盐一是含量相对高，二是基本没有盐的干扰，离子色谱法及光度法都是较适合的检测方法，而体内血液或体液中亚硝酸盐含量低，样品量少，基体干扰严重。目前检测通常用Griess检测试剂盒，由于受到检测灵敏度的限制及基体干扰，通常很难检测出血液或体液中亚硝酸盐，其灵敏度通常只能达到lKg/mg。研究小组之前已利用高效液相色谱(HPLC)对血液尿液及组织中硝酸盐与亚硝酸盐检测进行了研究，取得了不错的效果，申请了发明专利(201310129291.X)，同时还将亚硝酸盐与Griess试剂反应，经浊点萃取(CPE)进行分离、富集，直接目视比色，进行血液尿液中亚硝酸盐简单、快速检测，申请了发明专利(201310274145.6、201310428467.I)。进一步研究发现，临床上更需要一种能定量、准确、方便的检测血液中亚硝酸盐方法，由于临床上血液亚硝酸盐检测具有样品量少、基体干扰大，样本 量大等特点，若用现行的光度法检测需要较多样品量，否则要进一步稀释，降低检测灵敏度。本发明利用酶标仪替代通用的光度计，一是检测波长通用，一般酶标仪都具此波长；二是检测所需量少，只需200微升；三是检测量大，可以同时检测98个样本，检测效率高等特点。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种简单快速、灵敏度高、能大批量、定量检测血液中亚硝酸盐的方法。
[0005]本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
[0006]除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。
[0007]一种血液中亚硝酸盐的检测方法，包括以下步骤:
(I)亚硝酸盐标准工作曲线的制作
①基体空白溶液的制备:取10 mL不含亚硝酸盐的新鲜加抗凝剂血液，放入离心机中离心，取上清液5 mL，加入由0.2mol/L氢氧化钠溶液I mL和硫酸锌I g组成的蛋白沉淀脱色剂，混合均匀lmin，离心分离，取出上清液，得到几乎无色、透明的基体空白溶液。
[0008]②分别取浓度为1.0 Pg/mL的N02_ 20、40、60、80、ΙΟΟμ?标准溶液于微量试管中，用步骤①制备好的基体溶液稀释至500μ?,加入GriessA试剂25μ?,混合均匀；Imin后加入GriessB试剂25μ?，混合均匀。取200μ?混匀显色液于酶标板中，在酶标仪波长490nm处测定吸光度，制作工作曲线，得到亚硝酸盐的检测限和线性回归方程；
(2)样品测定
血液的检测:取5 mL新鲜加抗凝剂血液，放入离心机中离心，取上清液2 mL，加入由0.2mol/L氢氧化钠溶液0.4mL和硫酸锌0.4g组成的蛋白沉淀脱色剂，涡旋混合均匀lmin，离心分离，取500μ?上清液微量试管中，加入GriessA试剂25μ?，混合均匀；lmin后加入GriessB试剂25μ?，混合均匀。取200μ?混匀显色液于酶标板中，在酶标仪波长490nm处测定吸光度，并对照步骤(1)所得的线性回归方程，计算出样品中亚硝酸盐的含量。
[0009]其中，步骤(1) (2)中所述的GriessA试剂为50mg对氨基苯磺酸溶于5mL盐酸(0.5mol/L) ；GriessB 试剂为 4mg 1-萘胺溶于 4mL 甲醇(50%)；
所述的离心条件为离心时间5~IOmin,离心速率3000~6000r / min。
[0010]相对于现有技术，本发明具有以下显著优点:
1、利用酶标仪替代通用的光度计，检测波长定为几乎所有酶标仪都配的490nm处，检测所需量少，只需200微升，可以同时检测98个样本，检测效率高。
[0011]2、利 用处理过的空白血浆作为工作曲线制作的基体空白，克服了用蒸馏水作基体空白所带来的检测误差。
[0012]3、经过脱血浆蛋白处理的同时达到脱色的效果，基体空白溶液几乎无色，减少测定空白值，提闻了检测灵敏度。
【具体实施方式】
[0013]下面结合实施例对本发明作进一步地说明，但本发明的保护范围并不限于此。
[0014]实施例1
1、亚硝酸盐标准工作曲线的制作
①基体空白溶液的制备:取10 mL不含亚硝酸盐的新鲜加抗凝剂血液，放入离心机中，6000r/min离心8min,取上清液5 mL至干净离心管中，加入由0.2mol/L氢氧化钠溶液I mL和硫酸锌I g组成的蛋白沉淀脱色剂，混合均匀，5000r/min离心IOmin分离,取出上清液，得到几乎无色、透明的基体空白溶液。
[0015]②分别取浓度为1.0Pg/mL的N02_ 20、40、60、80、ΙΟΟμ?标准溶液于微量试管中，用步骤①制备好的基体空白溶液稀释至500μ?，加入GriessA试剂25μ?，混合均匀；Imin后加入GriessB试剂25μ?，混合均匀。取200μ?混匀显色液于酶标板中，在酶标仪波长490nm处测定吸光度，得到线性回归方程y=0.1875x-0.0007，相关系数R2=0.9960 ；
(2)样品测定
血液的检测:取5 mL新鲜加抗凝剂血液,放入离心机中，6000r/min离心8min,取上清液，加入由0.2mol/L氢氧化钠溶液0.4mL和硫酸锌0.4g组成的蛋白沉淀剂，混合均匀，5000r/min离心IOmin分离,取出上清液,取上清液500μ?至微量试管中，加入GriessA试剂25μ?，混合均匀；lmin后加入GriessB试剂25μ?，混合均匀。取200μ?混匀显色液于酶标板中，在酶标仪波长490nm处测定吸光度为0.008，并对照步骤(1)所得的线性回归方程，计算出样品中亚硝酸盐的含量为0.046Pg/mL。[0016]实施例2
1.按实施例1制作亚硝酸盐标准工作曲线。
[0017]2.样品处理及测定结果
血液的检测:取5 mL新鲜加抗凝剂血液,放入离心机中8000r/min离心5min分离,取上清液2 mL，加入由0.2mol/L氢氧化钠溶液0.4mL和硫酸锌0.4g组成的蛋白沉淀脱色剂，混合均匀，6000r/min离心6min分离，，取出上清液，加入乙腈ImL,6000r/min离心5min分离，取上清液500μ?微量试管中，加入GriessA试剂25μ?,混合均匀；Imin后加入GriessB试剂25μ?，混合均匀。取200μ?混匀显色液于酶标板中，在酶标仪波长490nm处测定吸光度为0.011，并对照步骤(1)所得的线性回归方程，计算出样品中亚硝酸盐的含量为0.062μδ/mL。`
【权利要求】
1.一种血液中亚硝酸盐的检测方法，包括以下步骤: (1)亚硝酸盐标准工作曲线的制作 ①基体空白溶液的制备:取10HiL不含亚硝酸盐的新鲜加抗凝剂血液，放入离心机中离心，取上清液5 mL，加入由0.2mol/L氢氧化钠溶液ImL和硫酸锌1.0 g组成的蛋白沉淀脱色剂，混合均匀，离心分离，取出上清液，得到几乎无色、透明的基体空白溶液； ②分别取浓度为1.0 Kg/mL的Ν02_20、40、60、80、100μ?标准溶液于微量试管中，用步骤①制备好的基体空白溶液稀释至500μ?,加入GriessA试剂25μ?,混合均匀；Imin后加入GriessB试剂25μ?，混合均匀，取200μ?混匀显色液于酶标板中，在酶标仪波长490nm处测定吸光度，制作工作曲线，得到亚硝酸盐的检测限和线性回归方程； (2)样品测定 血液的检测:取5 mL新鲜加抗凝剂血液，放入离心机中离心，取上清液2 mL，加入由0.2mol/L氢氧化钠溶液0.4mL和硫酸锌0.4g组成的蛋白沉淀脱色剂，涡旋混合均匀lmin，离心分离，取出上清液500μ?微量试管中，加入GriessA试剂25μ?，混合均匀；lmin后加入GriessB试剂25μ?，混合均匀，取200μ?混匀显色液于酶标板中，在酶标仪波长490nm处测定吸光度，并对照步骤(1)所得的线性回归方程，计算出样品中亚硝酸盐的含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:所述的GriessA试剂为50mg对氨基苯磺酸溶于5mL盐酸(0.5mol/L) ；GriessB试剂为4mg 1-萘胺溶于4mL甲醇(50%)。
3.权利要求1所述的检测方法，其特征在于:样品检测中所述的离心条件为离心时间`5 ~IOmin,离心速率 3000 ~6000r` / min。
【文档编号】G01N21/31GK103760121SQ201410054811
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年2月18日 优先权日:2014年2月18日
【发明者】杨亚玲, 赵娇, 宁金艳, 王军, 吕云辉 申请人:云南健牛生物科技有限公司