乳制品中β-环糊精的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种乳制品中β-环糊精的检测方法，包括以下步骤：（1）将待测样品经蛋白沉淀处理，分离得液体，过滤，得待测样品溶液；（2）进行高效液相色谱-示差折光检测；示差折光检测的温度30-50℃；高效液相色谱法的流动相：流动相A：甲醇，流动相B：水，二者体积比（3：97）-（10：90）。本发明的检测方法操作简单，检测结果精准，检测限低，针对β-环糊精包合胆固醇而制得的低（零）胆固醇乳制品，检测效果更佳。
【专利说明】乳制品中β-环糊精的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及乳制品中β -环糊精的检测方法。
【背景技术】
[0002]乳制品中含有丰富的乳钙、维生素以及必须氨基酸，营养成分全面。《居民膳食指南》(2007年修订)建议每人每天应吃相当300g的牛奶等乳制品。牛奶中的胆固醇含量约为15mg/100g, —般而言,健康人体每日胆固醇的摄入量最好不超过300mg,长期摄入大量的胆固醇会给人体带来健康隐患，血清中胆固醇含量偏高容易引起高血压、动脉粥样硬化等疾病。对于高胆固醇人群，每日摄入的胆固醇含量最好不超过200mg。以每日饮用300g牛奶计算，胆固醇的摄入水平已超过建议量的20%。
[0003]由于“三高”患者日益增多，越来越多的消费者开始关注饮食健康，加入控制使用胆固醇和脂肪摄入的行列中，研究开发低胆固醇食品或零胆固醇食品已成为食品加工产业的热点之一。
[0004]牛奶中的胆固醇多集中于乳脂肪中，除去脂肪后，牛乳中的胆固醇可减少约75%，但是脂肪作为牛乳中的重要成分，富有营养价值，并且在各种膳食脂肪和油类中具有较好的消化率，容易被人体消化吸收，对机体造成的负担很少。同时乳脂肪还起到提供牛奶香浓风味的作用。去除脂肪的脱脂乳在胆固醇含量降低的同时，营养成分以及口感风味均有损失。
[0005]环糊精是一种环状寡糖，由7个葡糖单元以α-4糖苷键结合而成。β -环糊精作为增稠剂和稳定剂，已经广泛应用于乳制品领域。但是，X射线衍射及核磁共振研究证明:环糊精的立体结构为中空圆筒形，内腔呈疏水性，这种特殊的筒状结构使得β-环糊精可以与胆固醇结合，形成稳定的胆固醇-β-环糊精包合物，利用β-环糊精的这种特性可以将牛奶中的胆固醇脱除，得到低胆固醇或零胆固醇牛奶。
[0006]利用β -环糊精包合法去除胆固醇的乳制品，不会造成原有营养成分的损失或是风味口感的改变，但是其中的加工助剂β_环糊精残留量的检测方法在国内未见报道。
[0007]另一方面，QB1613-1992《食品添加剂环状糊精》中记载了纯品β -环糊精的检测方法:利用分光光度计，通过苯酚硫酸法测定出β_环糊精中的葡萄糖含量，从而计算出样本中β_环糊精的含量(纯度)。但该方法仅限于纯品β_环糊精的检测，无法适用于溶解于乳品中的β_环糊精定量检测。
[0008]GB2760中记载了 α -环状糊精和Y -环状糊精含量(纯度)的检测方法，但是并未涉及乳品中β-环糊精含量应如何检测。
[0009]综上所述，现在有技术中没有检测乳品中β_环糊精的方法。针对一些特殊的待测样品，即如前所述的用β_环糊精包合胆固醇而得到的低(零)胆固醇乳制品而言，产品中β-环糊精的残留量的检测更是尤为重要。
【发明内容】
[0010]本发明克服了现有技术中尚没有针对乳品中β-环糊精的检测方法的缺陷，提供一种乳制品中β -环糊精的检测方法。本发明的检测方法操作简单，检测结果精准，可进行乳制品中β-环糊精的定性和定量检测，检测限低；特别是针对β-环糊精包合胆固醇而制得的低(零)胆固醇乳制品，检测效果更佳。
[0011]本发明通过以下技术方案解决上述技术问题:
[0012]一种乳制品中β -环糊精的检测方法，所述的检测方法包括以下步骤:
[0013](I)将待测样品经蛋白沉淀处理，分离得液体，过滤，得待测样品溶液；
[0014](2)将待测样品溶液进行高效液相色谱-示差折光检测，即可；
[0015]所述的示差折光检测的温度为30-50°C ；
[0016]所述的高效液相色谱法的检测条件包括:
[0017]流动相:流动相A:甲醇，流动相B:水，所述的流动相A和流动相B的体积比为(3:97)- (10:90)。
[0018]以下针对上述技术方案的优选的方案作进一步的说明:
[0019]步骤(I)中，所述的蛋白沉淀处理的方法和条件为本领域常规的方法和条件，所述的蛋白沉淀处理的方法较佳地包括以下步骤:将所述的待测样品置于35-55°C温度条件下提取Ι-lOmin，再与蛋白沉淀剂混合均匀，即可；
[0020]其中，所述的蛋白沉淀剂为本领域常规的蛋白沉淀剂，较佳地为亚铁氰化钾、乙酸锌、乙酸铅、草酸锰-磷酸氢二钠，硫酸铜、乙腈和乙醇中的一种或多种，更佳地为亚铁氰化钾溶液和/或乙酸锌溶液。
[0021]所述的待测样品与所述的蛋白沉淀剂的质量比较佳地为(1-5):(0.01-0.04)，更佳地为(1-5):(0.015-0.03)。
[0022]所述的蛋白沉淀剂较佳地为以其水溶液的形式加入。当所述的蛋白沉淀剂为溶液时，乙酸锌溶液的浓度较佳地为15-30g/L，更佳地为21.9g/L ;亚铁氰化钾的浓度较佳地为5-20g/L，更佳地为 10.9g/L。
[0023]其中，所述的提取前，先按照本领域常规将所述的待测样品进行稀释。当所述的待测样品为固态时，按照本领域常规先将所述的待测样品溶解后再稀释。所述的稀释较佳地为用水稀释，所述的待测样品与所述的水的质量比较佳地为(1-5):(10-50)。
[0024]其中，所述的提取的温度较佳地为40°C。
[0025]其中，所述的提取较佳地为震荡提取，更佳地为水浴振荡提取。所述的提取的时间较佳地为l_5min，更佳地为2min。步骤(I)中，所述的震荡提取较佳地在容量瓶中进行。
[0026]步骤(I)中，所述的分离的方法为本领域常规分离方法，较佳地为离心分离。所述的离心分离的离心速度较佳地为3000-5000r/min,更佳地为4000r/min ;所述的离心分离的时间较佳地为5-10min,更佳的为5min。
[0027]步骤(I)中，所述的过滤的滤膜的孔径为0.45 μ m。
[0028]步骤(I)的一个优选的技术方案为:将5g的待测样品在40°C条件下震荡提取l-5min，加入21.9%的乙酸锌溶液ImL和10.6%的亚铁氰化钾溶液lmL，混合均匀，在4000r/min速度下离心5min,过滤,得待测样品溶液。
[0029]步骤(2)中，所述的示差折光检测的温度较佳地为40°C。
[0030]步骤(2)中，所述的检测条件还包括色谱柱；所述的色谱柱较佳地为C18反相液相色谱柱，更佳地为Waters Atlantis T3色谱柱、Agilent Eclipse Plus C18色谱柱或Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱,进一步更佳地为Agilent Eclipse Plus C18色谱柱。所述的 Agilent Eclipse Plus C18 色谱柱的规格较佳地为 4.6 X 100mm, 3.5 μ m。所述的 WatersAtlantis T3色谱柱的规格较佳地为2.1 X 150mm, 5 μ m
[0031]步骤(2)中，所述的检测条件还包括柱温；所述的柱温较佳地为30_50°C，更佳地为 40。。。
[0032]步骤(2)中，所述的检测条件还包括流速；所述的流速较佳地为0.6-1.2mL/min,更佳地为1.0mL/min。
[0033]步骤(2)中，所述的检测条件还包括进样体积；所述的进样体积较佳地为10-20 μ L，更佳地为 10 μ Lo
[0034]本发明的一个优选的高效液相色谱法检测的检测条件为:
[0035]色谱柱:AgilentEclipse Plus C18 色谱柱；
[0036]流动相:流动相A:甲醇；流动相B:7jC ;所述的流动相A和流动相B的体积比为3:97 ；
[0037]柱温:40°C;
[0038]流速:1.2mL/min ;
[0039]进样体积:10 μ L。
[0040]步骤(I)中，所述的待测样品为本领域常规的乳制品，较佳地为低(零)胆固醇牛奶、低(零)胆固醇稀奶油和低(零)胆固醇乳饮料中的一种或多种，更佳地为用环糊精包合胆固醇处理得到的低(零)胆固醇牛奶、低(零)胆固醇稀奶油和低(零)胆固醇乳饮料中的一种或多种。
[0041]其中，所述的低(零)胆固醇牛奶较佳地为CN103238667A的
【发明内容】
及【具体实施方式】中公开的制备方法制得的低(零)胆固醇牛奶。
[0042]所述的低(零)胆固醇牛奶更佳地为按照以下两种方法之一制得的低(零)胆固醇牛奶:
[0043]方法一:所述的方法一包括以下步骤:
[0044]S (I):在40°C _70°C温度条件下，原料奶与β -环糊精混合均匀；β _环糊精的用量为1%_4%;所述的百分比为β-环糊精占原料奶与环糊精总量的质量百分比；
[0045]S (2):冷却至0-35°C，离心、排渣；所述的离心的速率为6000_12000rpm ；
[0046]S (3):升温至60_75°C，均质，杀菌，冷却，灌装。
[0047]其中，S (I)中，所述的原料奶与β_环糊精使用搅拌的方法混合均匀，所述的搅拌的速度较佳的为100-250rpm，所述的搅拌的时间较佳的为45_120min ;所述的离心的速率为8000-12000rpm。S (3)中所述的离心、排渣的次数均为3次。所述的均质的温度为60-75°C，所述的均质的压力为18-25Mpa ;所述的杀菌是巴氏杀菌或高温灭菌；较佳地，所述的巴氏杀菌的温度为75-85°C，所述的巴氏杀菌的时间为15-30s，所述的高温灭菌的温度为121-137°C，所述的高温灭菌的时间为2-15s ;更佳地，所述的巴氏杀菌的温度为85°C，所述的巴氏杀菌的时间为15s，所述的高温灭菌的温度为137°C，所述的高温灭菌的时间为4s。S (3)中所述的冷却的温度为2-6°C。
[0048]方法二:所述的方法二包括以下步骤:[0049]S1:原料乳升温至55_65°C，离心分离得到无脂肪牛奶和稀奶油；
[0050]S2:将稀奶油均质、杀菌处理，冷却至30_50°C后与β -环糊精混合均匀；β -环糊精添加量为5-20%，所述的百分比为β-环糊精占原料奶与环糊精总量的质量百分比；
[0051]S3:冷却至0-35 °C,离心、排渣后得混合物A ;所述的离心的速率为6000-12000rpm ；
[0052]S4:将混合物A与无脂肪牛奶混合，标准化后，升温至60_75°C，均质，杀菌，冷却，灌装。
[0053]其中，所述的步骤S2中混合均匀为使用搅拌的方法进行混合均匀，所述的搅拌的时间较佳地为30-60min,所述的搅拌的速度较佳地为100_250rpm ;所述的离心、排洛均在离心机中进行,所述的离心的速率为8000-12000rpm。步骤S3中所述的离心、排渣的次数均为3次。步骤S3中所述的冷却的温度为4-20°C。步骤S4中，所述的均质的温度较佳地为60-75 °C，所述的均质的压力较佳地为18-25Mpa ;所述的杀菌较佳地为巴氏杀菌处理或高温灭菌处理；较佳地，所述的巴氏杀菌的温度为75-85°C，所述的巴氏杀菌的时间为15-30s，所述的高温灭菌的温度为121-137°C，所述的高温灭菌的时间为2_15s ;更佳地，所述的巴氏杀菌的温度为85°C，所述的巴氏杀菌的时间为15s，所述的高温灭菌的温度为137°C，所述的高温灭菌的时间为4s。步骤S4中所述的冷却的温度为2-6°C。
[0054]其中，所述的低(零)胆固醇稀奶油为按照一定方法制得的低(零)胆固醇稀奶油，所述的方法包括以下步骤:
[0055](I)原料乳升温至65°C，离心分离稀奶油，分离出稀奶油脂肪含量为40% ；
[0056](2)稀奶油冷却至40°C,加入20% (w/w)的β -环糊精,在40°C下搅拌60min,搅拌速度IOOrpm ；
[0057](3)冷却至(TC，离心排渣，离心速率为8000rpm，重复操作3次；
[0058](4)升温至 60°C，均质(20Mpa)—杀菌(85°C，15s)—冷却至 6°C —灌装。
[0059]其中，所述的低(零)胆固醇乳饮料为按照一定方法制得的低(零)胆固醇乳饮料，所述的低(零)胆固醇乳饮料包括以下重量份的各原料:零胆固醇牛奶700重量份，水228重量份，白砂糖60重量份，苹果汁10重量份，结冷胶0.2重量份，单硬脂酸甘油酯0.5重量份，蔗糖酯0.4重量份，柠檬酸钠0.4重量份，柠檬酸0.3重量份，食用香精0.2重量份；所述的零胆固醇牛奶为按照如上所述的方法制得的零胆固醇牛奶；
[0060]所述的制备方法包括以下步骤:
[0061](I)部分零胆固醇牛奶升温至80°C —添加白砂糖，结冷胶，单硬脂酸甘油酯，蔗糖酯，朽1檬酸钠，朽1檬酸一保温搅拌15min ；
[0062](2)冷却至40°C，加入剩余零胆固醇牛奶，水，苹果汁以及香精一保温搅拌IOmin ；
[0063](3)均质(20±2MPa)—杀菌(138± 1°C，4s)—灌装。
[0064]本发明中，所述的检测的仪器一般为配有示差折光检测器的高效液相色谱仪。该仪器中，所述的高效液相色谱仪作为进样系统，进行样品的各成分的分离。
[0065]本发明中，较佳地，所述的检测后，可按照本领域常规的标准曲线法计算待测样品中β_环糊精的含量。
[0066]所述的标准曲线法的操作步骤为:用环糊精溶解于水中制成标准储备液，用水逐级稀释配制成系列浓度的标准样品溶液，在与待测样品溶液相同的色谱条件下分别进样；测量各标准样品溶液的峰面积，用峰面积对标准样品溶液的浓度绘制标准曲线。再根据测得的待测样品的峰面积，计算待测样品溶液的浓度。
[0067]所述的待测样品溶液的含量的计算方法为:
【权利要求】
1.一种乳制品中β-环糊精的检测方法，其特征在于:所述的检测方法包括以下步骤: (1)将待测样品经蛋白沉淀处理，分离得液体，过滤，得待测样品溶液； (2)将待测样品溶液进行高效液相色谱-示差折光检测，即可； 所述的示差折光检测的温度为30-50°C ； 所述的高效液相色谱法的检测条件包括: 流动相:流动相A:甲醇，流动相B:水，所述的流动相A和流动相B的体积比为(3:97) - (10:90)。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于:步骤(2)中，所述的示差折光检测的温度为40°C。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于:步骤(1)中，所述的蛋白沉淀处理的方法包括以下步骤:将所述的待测样品置于35-55°C温度条件下提取Ι-lOmin，再与蛋白沉淀剂混合均匀，即可。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于:其中，所述的蛋白沉淀剂为亚铁氰化钾、乙酸锌、乙酸铅、草酸锰-磷酸氢二钠，硫酸铜、乙腈和乙醇中的一种或多种；所述的待测样品与所述的蛋白沉淀剂的质量比较佳地为(1-5):(0.01-0.04)，更佳地为(1-5):(0.015-0.03);所述的提取的温度较佳地为40°C ;所述的提取较佳地为震荡提取，更佳地为水浴振荡提取；所述的提取的时间较佳地为l_5min，更佳地为2min。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于:步骤(1)中，所述的分离为离心分离；所述的离心分离的离心速度较佳地为3000-5000r/min,更佳地为4000r/min ;所述的离心分离的时间较佳地为5-10min,更佳的为5min ;所述的过滤的滤膜的孔径为0.45 μ m。
6.如权利要求1-5中任一项所述的检测方法，其特征在于:步骤(1)为:将5g的待测样品在40°C条件下震荡提取l-5min，加入21.9%的乙酸锌溶液ImL和10.6%的亚铁氰化钾溶液ImL,混合均匀,在4000r/min速度下离心5min,过滤,得待测样品溶液。
7.如权利要求1-5中任一项所述的检测方法，其特征在于:步骤(2)中，所述的检测条件还包括色谱柱、柱温、流速或进样体积； 所述的色谱柱较佳地为C18反相液相色谱柱,更佳地为Waters Atlantis T3色谱柱、Agilent Eclipse Plus C18 色谱柱或 Agilent Zorbax SB-Aq 色谱柱；所述的 AgilentEclipse Plus C18 色谱柱的规格较佳地为 4.6 X 100mm, 3.5 μ m ;所述的 Waters AtlantisT3色谱柱的规格较佳地为2.1 X 150mm, 5 μ m ; 所述的柱温较佳地为30-50°C，更佳地为40°C ； 所述的流速较佳地为0.6-1.2mL/min,更佳地为1.0mL/min ； 所述的进样体积较佳地为10-20 μ I,更佳地为10 μ L。
8.如权利要求1-5中任一项所述的检测方法，其特征在于:所述的高效液相色谱法检测的检测条件为: 色谱柱:Agilent Eclipse Plus C18 色谱柱； 流动相:流动相A:甲醇；流动相B:7jC ;所述的流动相A和流动相B的体积比为3:97 ； 柱温:40°C ；
流速:1.2mL/min ；进样体积:10μ L0
9.如权利要求1-5中任一项所述的检测方法，其特征在于:步骤(1)中，所述的待测样品为乳制品，较佳地为低胆固醇牛奶、低胆固醇稀奶油、低胆固醇乳饮料、零胆固醇牛奶、零胆固醇稀奶油和零胆固醇乳饮料中的一种或多种。
10.如权利要求1-5中任一项所述的检测方法，其特征在于:所述的检测后，按标准曲线法计算待测样品中β_环糊精 的含量。
【文档编号】G01N30/02GK103884799SQ201410153308
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月16日 优先权日:2014年4月16日
【发明者】姜雪, 郭本恒, 苗君莅, 于鹏, 刘振民, 任璐, 肖杨, 蔡涛, 王辉 申请人:光明乳业股份有限公司