专利名称：检测牛乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测酪蛋白磷酸肽含量的方法，尤其涉及一种检测牛乳制品中酪
蛋白磷酸肽含量的方法，属于检测技术领域。
背景技术：
酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphop印tide)是以牛乳制品酪蛋白为原料，通过生物 技术加工制得的具有生物活性的多肽，分子量为2000至4000道尔顿，核心结构为-Ser(P) -Ser (P) -Ser (P) -Glu-Glu-(其中，Ser为丝氨酸，Glu为谷氨酸，P为磷酸基)。酪蛋白磷酸 肽具有结合钙和促进钙吸收的功能，可用于各种营养食品和保健食品种，能有效促进人体 对钙、铁、锌等二价矿物质营养素的吸收和利用。目前，酪蛋白磷酸肽在日本、韩国和欧洲一 些国家已广泛应用于牛乳制品中，比如婴幼儿奶粉、保健品等产品中。在国内，酪蛋白磷酸 肽作为食品添加剂也已经应用于婴幼儿奶粉、保健食品和液态牛奶中。
目前，酪蛋白磷酸肽常用的检测方法包括分光光度计法、HPLC法和凝胶电泳法，这 些方法均存在步骤复杂和检测时间长等缺点。鉴于这三种检测方法存在的问题，本发明提 供了一种使用毛细管电泳法快速检测牛乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的方法。毛细管电泳法 是一类包括电泳、色谱及其交叉内容的液相微分离技术，该方法操作简便、准确，检测产生 结果的持续时间仅为1小时左右。 目前，高压毛细管电泳分析仪检测技术正逐渐应用到牛乳制品领域里，如产品开 发和控制质量问题等领域中，但是毛细管电泳检测技术尚未开发检测牛乳制品中酪蛋白磷 酸肽含量的方法。本发明提供的检测牛乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的方法成功弥补了乳品 领域中的缺陷，能够在短时间内准确测定酪蛋白磷酸肽的含量，从而有利于相关牛乳制品 分析检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测牛乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的方法，该方法检测 所需时间短、精度高，并且使用了毒性和剌激性气味均较低而且灵敏性较高的样品缓冲液。
本发明提供了检测牛乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的方法，该方法使用了高压毛细 管电泳分析仪作为检测设备，所述方法包括如下步骤 (a)将酪蛋白磷酸肽溶于样品缓冲液中，制备得到多种不同浓度的酪蛋白磷酸肽 标准溶液，并利用所述高压毛细管电泳分析仪对所述多种酪蛋白磷酸肽标准溶液分别检测 分析后得到检测结果，根据所述酪蛋白磷酸肽标准溶液的浓度与对应的所述检测结果之间 的关系绘制出标准曲线； (b)对牛乳制品进行检测，并得到检测结果；禾口 (c)利用所述标准曲线根据所述牛乳制品的检测结果计算出检测的所述牛乳制品 中酪蛋白磷酸肽的含量。 在本发明的再一种具体实施方式
中，所述步骤(a)使用了能够使蛋白质分散的样品缓冲液，所述样品缓冲液满足以下条件1体积份的150 170mmol/L三甲基氨基甲烷缓 冲液中加50 70mmol/L乙二胺四乙酸二钠、5 7mol/L尿素，处理样品时添加1 5mg/ ml的二硫基苏糖醇，甲基羟乙基纤维素0. 01% 0. 5% (0. 1 5mg/ml)，所述乙二胺四乙 酸二钠、尿素、二硫基苏糖醇和甲基羟乙基纤维素的量相同，都在1 20体积份之间，pH值 为8. 5±0. 5。 在本发明的另一种具体实施方式
中，所述步骤(a)中标准曲线的制定方法如下
配制五种浓度的酪蛋白磷酸肽标准溶液，分别为16mg/ml 、8mg/ml 、4mg/ml 、2mg/ml 、 lmg/ml ，
将所述标准溶液摇匀后使用高压毛细管电泳分析仪进行检测分析，得到检测结果，并利用
高压毛细管电泳分析仪所带的分析软件对检测结果的图谱积分计算出峰面积，并根据所述
酪蛋白磷酸肽标准溶液浓度与对应的所述峰面积之间的关系生成标准曲线。 在本发明的另一种具体实施方式
中，所述步骤(a)中标准曲线的制定方法如下
配制五种浓度的酪蛋白磷酸肽标准溶液，分别为16mg/ml、8mg/ml、4mg/ml、2mg/ml、0. lmg/
ml，将所述标准溶液摇匀后使用高压毛细管电泳分析仪进行检测分析，得到检测结果，并利
用高压毛细管电泳分析仪所带的分析软件对检测结果的图谱积分计算出峰面积，并根据所
述酪蛋白磷酸肽标准溶液浓度与对应的所述峰面积之间的关系生成标准曲线。 在本发明的又一种具体实施方式
中，所述步骤(a)中利用所述高压毛细管电泳分
析仪对所述多种酪蛋白磷酸肽标准溶液分别检测的步骤包括将所述酪蛋白磷酸肽标准溶
液置于离心管中，摇匀之后加入样品管中，超声波清洗，然后使用高压毛细管电泳分析仪测定。 在本发明的还一种具体实施方式
中，所述步骤(b)中使用高压毛细管电泳分析 仪对牛乳制品进行检测的方法包括将牛乳制品装入10ml 50ml离心管中，在1500 6000r/min离心条件下离心2 15min，离心温度控制在4 25°C ;将所述牛乳制品与样品 缓冲液按l : 1 20的比例加入离心管中，摇匀之后精确提取10 200ul加入样品管中， 超声波清洗1 15min，然后使用高压毛细管电泳分析仪测定。 在本发明的又一种具体实施方式
中，所述高压毛细管电泳分析仪的检测参数如 下检测温度控制在15 45。C之间，毛细管柱直径20 80iim、长度为150 700mm，紫外 光检测器，压力进样，压力为0. 5 2psi，时间为0. 5s 25s，分离温度为15 45"，工作 电压为7 35kV，所述毛细管柱包括涂层和未涂层。 在本发明的再一种具体实施方式
中，所述步骤(a)和(b)中利用所述高压毛细管 电泳分析仪进行检测时所使用的电泳缓冲液pH值为2. 0 3. O，主要成分为柠檬酸。
在本发明的还一种具体实施方式
中，所述步骤(c)计算所述牛乳制品中酪蛋白磷 酸肽含量的方法如下运用高压毛细管电泳分析仪所带的分析软件对检测结果中牛乳制 品分离的图谱进行积分计算出峰面积，将所述牛乳制品的该峰面积与所述步骤(a)中的标 准曲线进行比对，得出高压毛细管电泳分析仪所检测的所述牛乳制品中的酪蛋白磷酸肽含 牛乳制品中添加酪蛋白磷酸肽的允许量为1. 6g 3g/Kg(GB2760-1998)，而高压 毛细管电泳分析仪检测最低浓度能达到10—5 10—8mol/L。因此，利用高压毛细管电泳分析 仪能检测出牛乳制品中的酪蛋白磷酸肽的含量。使用毛细管电泳法检测牛乳制品中酪蛋白 磷酸肽含量的方法包括样品性质的了解、分离模式、建立缓冲体系、优化缓冲体系和换分离模式等步骤，这些步骤都能良好地应用于本发明的检测牛乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的方 法中。 本发明所使用的高压毛细管电泳分析仪的检测参数是在传统的电泳和色谱的原 理的基础上，根据牛乳制品中酪蛋白磷酸肽的含量，通过试验，最终确定检测而成的。
本发明的检测牛乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的方法中生成的标准曲线的线性回 归方程相关系数> 0. 98，其线性范围在0. lmg/ml 16mg/ml，最低检出限为0. Olug，最低检 出浓度为0.09mg/ml。精确度达90%以上，样品回收率达70%以上。能有效检测出样品中 的酪蛋白磷酸肽的含量。 另外，本发明的检测方法中所采用的样品缓冲液中使用了二硫基苏糖醇，与现有 技术中使用的P-巯基乙醇相比，其剌激性气味和毒性均低，而且二硫基苏糖醇比P-巯基 乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近，由此可见二硫基苏糖醇的灵敏性也相对较高，其检出 率高。因此，采用二硫基苏糖醇能进一步加强检测操作的安全性，并且也提高了样品的回收 率，也提供了检测的检出率。
具体实施例方式
为了对发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现参照具体实施例对本
发明的检测牛乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的方法进行具体描述。
实施例1 本发明的检测牛乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的方法包括如下步骤
(a)将酪蛋白磷酸肽标准品溶于样品缓冲液中配制浓度分别为16mg/ml、8mg/ml、 4mg/ml、2mg/ml、lmg/ml的标准溶液，将所述酪蛋白磷酸肽标准溶液置于离心管中，摇匀之 后加入样品管中，超声波清洗，摇匀后使用高压毛细管电泳分析仪进行检测分析，检测所得 的图谱进行积分后的峰面积分别为7501 、3986、 1823、884、414，根据上述标准溶液的浓度以 及对应的峰面积之间的关系利用软件得出标准曲线，所得出的标准曲线的线性回归相关系 数为0. 9993，最低检出限为0. Olug，最低检出含量为0. 09mg/ml，标准样品回收率达90% ;
(b)将待测牛乳制品加入15ml的离心管中，在5000r/min离心条件下离心10min， 离心温度为4t:，准确提取经处理的上述待测牛乳制品100ul置2ml离心管中(或其他类似 容器)，在该2ml离心管中再加入300ul样品缓冲液进行稀释(稀释比例l : 3)，使用漩涡 混合器混匀，精确提取40ul处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机3min，之后使用 高压毛细管电泳分析仪测定； (c)根据步骤(b)中高压毛细管电泳分析仪测得的待测牛乳制品稀释后的溶液的 分离图谱，运用高压毛细管电泳分析仪所带的分析软件积分酪蛋白磷酸肽的峰面积为910， 利用分析软件自动套入步骤(a)得到的标准曲线方程内计算出溶液中酪蛋白磷酸肽浓度 为1. 83mg/ml，再乘稀释倍数4，即得实际浓度为7. 31mg/ml，所以该样品含有的酪蛋白磷酸 肽浓度为7. 31g/L。 上述步骤(a)和(b)并无先后之分，其具体操作顺序依照实验者的习惯以及通常 的实验要求而定。 其中，样品缓冲液的配置方法如下1体积份的150mmol/L三甲基氨基甲烷缓冲液 中加1体积份的60mmol/L乙二胺四乙酸二钠，1体积份的6mol/L尿素，处理样品时添加1体积份的2. 5mg/ml的二硫基苏糖醇，1体积份的甲基羟乙基纤维素0. 04%，使用氢氧化钠 溶液把PH值调至8. 5。另外，主要利用柠檬酸缓冲液配备高压毛细管电泳分析仪进行检测 时所使用的电泳缓冲液，该电泳缓冲液的PH值为3. 0。 本发明的检测方法所使用的高压毛细管电泳分析仪的工作参数如下温度控制在 37°C ，使用直径为50 i！ m、长度为400mm的涂层石英毛细管柱，紫外线检测器，压力进样，压 力为O. 6psi，时间为8s，分离温度为15"，工作电压为18kV。
实施例2 本发明的检测牛乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的方法包括如下步骤
(a)将酪蛋白磷酸肽标准品溶于样品缓冲液中配制浓度分别为16mg/ml、8mg/ml、 4mg/ml、2mg/m1、0. lmg/ml的标准溶液，将所述酪蛋白磷酸肽标准溶液置于离心管中，摇匀 之后加入样品管中，超声波清洗，摇匀后使用高压毛细管电泳分析仪进行检测分析，检测所 得的图谱进行积分后的峰面积分别为6587、3356、 1598、801 、37，根据上述标准溶液的浓度 以及对应的峰面积之间的关系利用软件得出标准曲线，所得出的标准曲线的线性回归相关 系数为0. 9918，最低检出限为0. 05ug，最低检出含量为0. lmg/ml，标准样品回收率达93%;
(b)将待测牛乳制品加入15ml的离心管中，在6000r/min离心条件下离心10min， 离心温度为25t:，准确提取经处理的上述待测牛乳制品100ul置2ml离心管中(或其他类 似容器)，在该2ml离心管中再加入400ul样品缓冲液进行稀释(稀释比例l : 4)，使用漩 涡混合器混匀，精确提取40ul处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机5min，之后使 用高压毛细管电泳分析仪测定； (c)根据步骤(b)中高压毛细管电泳分析仪测得的待测牛乳制品稀释后的溶液的 分离图谱，运用高压毛细管电泳分析仪所带的分析软件积分酪蛋白磷酸肽的峰面积为204， 利用分析软件自动套入步骤(a)得到的标准曲线方程内计算出溶液中酪蛋白磷酸肽浓度 为0. 5mg/ml，再乘稀释倍数5，即得实际浓度为2. 5mg/ml，所以该样品含有的酪蛋白磷酸肽 浓度为2. 5g/L。 上述步骤(a)和(b)并无先后之分，其具体操作顺序依照实验者的习惯以及通常 的实验要求而定。 其中，样品缓冲液的配置方法如下1体积份的160mmol/L三甲基氨基甲烷缓冲液 中加6体积份的60mmol/L乙二胺四乙酸二钠，6体积份的7mol/L尿素，处理样品时添加6 体积份的3. lmg/ml的二硫基苏糖醇，6体积份的甲基羟乙基纤维素0. 06%，使用氢氧化钠 溶液把PH值调至8. 5。另外，主要利用柠檬酸缓冲液配备高压毛细管电泳分析仪进行检测 时所使用的电泳缓冲液，该电泳缓冲液的PH值为3. 0。 本发明的检测方法所使用的高压毛细管电泳分析仪的工作参数如下温度控制在 38°C ，使用直径为75 i！ m、长度为600mm的涂层石英毛细管柱，紫外线检测器，压力进样，压 力为0. 7psi，时间为4s，分离温度为45"，工作电压为25kV。
实施例3 本发明的检测牛乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的方法包括如下步骤
(a)将酪蛋白磷酸肽标准品溶于样品缓冲液中配制浓度分别为16mg/ml、8mg/ml、 4mg/ml、2mg/ml、0. lmg/ml的标准溶液，将所述酪蛋白磷酸肽标准溶液置于离心管中，摇匀 之后加入样品管中，超声波清洗，摇匀后使用高压毛细管电泳分析仪进行检测分析，检测所得的图谱进行积分后的峰面积分别为6721 、 3021 、 1526、 751 、 35，根据上述标准溶液的浓度 以及对应的峰面积之间的关系利用软件得出标准曲线，所得出的标准曲线的线性回归相关 系数为0. 9975，最低检出限为0. 06ug，最低检出含量为0. 2mg/ml，标准样品回收率达91%;
(b)将待测牛乳制品加入10ml的离心管中，在1500r/min离心条件下离心15min， 离心温度为l(TC，准确提取经处理的上述待测牛乳制品100ul置2ml离心管中(或其他类 似容器)，在该2ml离心管中再加入100ul样品缓冲液进行稀释(稀释比例l : l)，使用漩 涡混合器混匀，精确提取10ul处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机lmin，之后使 用高压毛细管电泳分析仪测定； (c)根据步骤(b)中高压毛细管电泳分析仪测得的待测牛乳制品稀释后的溶液的 分离图谱，运用高压毛细管电泳分析仪所带的分析软件积分酪蛋白磷酸肽的峰面积为317， 利用分析软件自动套入步骤(a)得到的标准曲线方程内计算出溶液中酪蛋白磷酸肽浓度 为0. 9mg/ml，再乘稀释倍数2，即得实际浓度为1. 8mg/ml，所以该样品含有的酪蛋白磷酸肽 浓度为1. 8g/L。 上述步骤(a)和(b)并无先后之分，其具体操作顺序依照实验者的习惯以及通常 的实验要求而定。 其中，样品缓冲液的配置方法如下1体积份的170mmol/L三甲基氨基甲烷缓冲液 中加10体积份的50mmol/L乙二胺四乙酸二钠，10体积份的5mol/L尿素，处理样品时添加 IO体积份的lmg/ml的二硫基苏糖醇，IO体积份的甲基羟乙基纤维素O. 01%，使用氢氧化钠 溶液把PH值调至8. 0。另外，主要利用柠檬酸缓冲液配备高压毛细管电泳分析仪进行检测 时所使用的电泳缓冲液，该电泳缓冲液的PH值为2. 0。 本发明的检测方法所使用的高压毛细管电泳分析仪的工作参数如下温度控制在 15°C ，使用直径为20 i！ m、长度为150mm的未涂层石英毛细管柱，紫外线检测器，压力进样， 压力为0. 5psi，时间为25s，分离温度为25"，工作电压为7kV。
实施例4 本发明的检测牛乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的方法包括如下步骤
(a)将酪蛋白磷酸肽标准品溶于样品缓冲液中配制浓度分别为16mg/ml、8mg/ml、 4mg/ml、2mg/ml、0. lmg/ml的标准溶液，将所述酪蛋白磷酸肽标准溶液置于离心管中，摇匀 之后加入样品管中，超声波清洗，摇匀后使用高压毛细管电泳分析仪进行检测分析，检测所 得的图谱进行积分后的峰面积分别为6621 、3251 、 1253、628、29，根据上述标准溶液的浓度 以及对应的峰面积之间的关系利用软件得出标准曲线，所得出的标准曲线的线性回归相关 系数为0. 9965，最低检出限为0. 08ug，最低检出含量为0. lmg/ml，标准样品回收率达92%;
(b)将待测牛乳制品加入50ml的离心管中，在6000r/min离心条件下离心2min， 离心温度为15t:，准确提取经处理的上述待测牛乳制品10ul置2ml离心管中(或其他类似 容器)，在该2ml离心管中再加入200ul样品缓冲液进行稀释(稀释比例l : 20)，使用漩 涡混合器混匀，精确提取200ul处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机15min，之后 使用高压毛细管电泳分析仪测定； (c)根据步骤(b)中高压毛细管电泳分析仪测得的待测牛乳制品稀释后的溶液的 分离图谱，运用高压毛细管电泳分析仪所带的分析软件积分酪蛋白磷酸肽的峰面积为78， 利用分析软件自动套入步骤(a)得到的标准曲线方程内计算出溶液中酪蛋白磷酸肽浓度为0. 27mg/ml，再乘稀释倍数21，即得实际浓度为5. 67mg/ml，所以该样品含有的酪蛋白磷 酸肽浓度为5. 67g/L。 上述步骤(a)和(b)并无先后之分，其具体操作顺序依照实验者的习惯以及通常 的实验要求而定。 其中，样品缓冲液的配置方法如下1体积份的160mmol/L三甲基氨基甲烷缓冲液 中加20体积份的70mmol/L乙二胺四乙酸二钠，20体积份的7mol/L尿素，处理样品时添加 20体积份的5mg/ml的二硫基苏糖醇，20体积份的甲基羟乙基纤维素0. 5%，使用氢氧化钠 溶液把PH值调至9。另外，主要利用柠檬酸缓冲液配备高压毛细管电泳分析仪进行检测时 所使用的电泳缓冲液，该电泳缓冲液的PH值为3. 0。 本发明的检测方法所使用的高压毛细管电泳分析仪的工作参数如下温度控制在 45°C ，使用直径为80 i！ m、长度为700mm的涂层石英毛细管柱，紫外线检测器，压力进样，压 力为2psi，时间为0. 5s，分离温度为45"，工作电压为35kV。
实施例5 下面提供了一个本发明实施例2的一个比较实施例，实施例5与实施例2的不同 之处仅在于实施例5的样品缓冲液与实施例2的样品缓冲液存在差别，尤其是实施例5中 使用P-巯基乙醇取代了二硫基苏糖醇，根据实施例5的检测牛乳制品中酪蛋白磷酸肽含 量的方法包括如下步骤 (a)将酪蛋白磷酸肽标准品溶于样品缓冲液中配制浓度分别为16mg/ml、8mg/ml、 4mg/ml、2mg/m1、0. lmg/ml的标准溶液，将所述酪蛋白磷酸肽标准溶液置于离心管中，摇匀 之后加入样品管中，超声波清洗，摇匀后使用高压毛细管电泳分析仪进行检测分析，检测所 得的图谱进行积分后的峰面积分别为6521 、3114、 1732、518、30，根据上述标准溶液的浓度 以及对应的峰面积之间的关系利用软件得出标准曲线，所得出的标准曲线的线性回归相关 系数为0. 9966，最低检出限为0. 09ug，最低检出含量为0. lmg/ml，标准样品回收率达90%;
(b)将待测牛乳制品加入15ml的离心管中，在6000r/min离心条件下离心10min， 离心温度为25t:，准确提取经处理的上述待测牛乳制品100ul置2ml离心管中(或其他类 似容器)，在该2ml离心管中再加入400ul样品缓冲液进行稀释(稀释比例l : 4)，使用漩 涡混合器混匀，精确提取40ul处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机5min，之后使 用高压毛细管电泳分析仪测定； (c)根据步骤(b)中高压毛细管电泳分析仪测得的待测牛乳制品稀释后的溶液的 分离图谱，运用高压毛细管电泳分析仪所带的分析软件积分酪蛋白磷酸肽的峰面积为126， 利用分析软件自动套入步骤(a)得到的标准曲线方程内计算出溶液中酪蛋白磷酸肽浓度 为0. 42mg/ml，再乘稀释倍数5，即得实际浓度为2. lmg/ml，所以该样品含有的酪蛋白磷酸 肽浓度为2. lg/L。 上述步骤(a)和(b)并无先后之分，其具体操作顺序依照实验者的习惯以及通常 的实验要求而定。 其中，所使用的待测牛乳制品与实施例2 —致。处理样品缓冲液配置方法如下1 体积份的160mmol/L三甲基氨基甲烷缓冲液中加6体积份的60mmol/L乙二胺四乙酸二钠， 6体积份的7mol/L尿素，处理样品时添加6体积份的5ul/ml P -巯基乙醇，6体积份的甲基 羟乙基纤维素O. 06X，使用氢氧化钠溶液把pH值调至8.5。另外，主要利用柠檬酸缓冲液配
9备高压毛细管电泳分析仪进行检测时所使用的电泳缓冲液，该电泳缓冲液的PH值为3. 0。
本发明的检测方法所使用的高压毛细管电泳分析仪的工作参数如下温度控制在 38°C ，使用直径为75 m、长度为600mm的涂层石英毛细管柱，紫外线检测器，压力进样，压 力为0. 7psi，时间为4s，分离温度为45"，工作电压为25kV。 针对同一份待测牛乳制品中，本发明实施例2中采用的方法能检测出2. 5mg/ml 酪蛋白磷酸肽，而这个实施例中的方法仅能检测出2. lmg/ml酪蛋白磷酸肽，检出率降低了 16%，因此可知本发明实施例2中采用的方法更加准确。根据实验的条件对比看，这种准确 性是由于实施例2采用了二硫基苏糖醇来调配样品缓冲液而导致的，由此可见，本发明所 使用的样品缓冲液的检出率更高，而且二硫基苏糖醇的剌激性气味和毒性更低，因此也更 安全。 上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明， 它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更 均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种检测牛乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的方法，其特征在于，所述方法使用了高压毛细管电泳分析仪作为检测设备，所述方法包括如下步骤(a)将酪蛋白磷酸肽溶于样品缓冲液中，制备得到多种不同浓度的酪蛋白磷酸肽标准溶液，并利用所述高压毛细管电泳分析仪对所述多种酪蛋白磷酸肽标准溶液分别检测分析后得到检测结果，根据所述酪蛋白磷酸肽标准溶液的浓度与对应的所述检测结果之间的关系绘制出标准曲线；(b)对牛乳制品进行检测，并得到检测结果；和(c)利用所述标准曲线根据所述牛乳制品的检测结果计算出检测的所述牛乳制品中酪蛋白磷酸肽的含量。
2. 根据权利要求l所述的方法，其中，所述步骤(a)使用了能够使蛋白质分散的样品缓 冲液，所述样品缓冲液满足以下条件1体积份的150 170mmol/L三甲基氨基甲烷缓冲液 中加50 70mmol/L乙二胺四乙酸二钠、5 7mol/L尿素，处理样品时添加1 5mg/ml的 二硫基苏糖醇，甲基羟乙基纤维素0.01% 0.5%，所述乙二胺四乙酸二钠、尿素、二硫基 苏糖醇和甲基羟乙基纤维素的量相同，都在1 20体积份之间，pH值为8. 5±0. 5。
3. 根据权利要求l所述的方法，其中，所述步骤(a)中标准曲线的制定方法如下配制 五种浓度的酪蛋白磷酸肽标准溶液，分别为16mg/ml 、8mg/ml 、4mg/ml 、2mg/ml 、 lmg/ml ，将所 述标准溶液摇匀后使用高压毛细管电泳分析仪进行检测分析，得到检测结果，利用高压毛 细管电泳分析仪所带的分析软件对检测结果的图谱积分计算出峰面积，并根据所述酪蛋白 磷酸肽标准溶液浓度与对应的所述峰面积之间的关系生成标准曲线。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(a)中标准曲线的制定方法如下配制 五种浓度的酪蛋白磷酸肽标准溶液，分别为16mg/ml 、8mg/ml 、4mg/ml 、2mg/ml 、0. lmg/ml ，将 所述标准溶液摇匀后使用高压毛细管电泳分析仪进行检测分析，得到检测结果，并利用高 压毛细管电泳分析仪所带的分析软件对检测结果的图谱积分计算出峰面积，并根据所述酪 蛋白磷酸肽标准溶液浓度与对应的所述峰面积之间的关系生成标准曲线。
5. 根据权利要求l所述的方法，其中，所述步骤(a)中利用所述高压毛细管电泳分析仪 对所述多种酪蛋白磷酸肽标准溶液分别检测的步骤包括将所述酪蛋白磷酸肽标准溶液置 于离心管中，摇匀之后加入样品管中，超声波清洗，然后使用高压毛细管电泳分析仪测定。
6. 根据权利要求l所述的方法，其中，所述步骤(b)中使用高压毛细管电泳分析仪对 牛乳制品进行检测的方法包括将牛乳制品装入10ml 50ml离心管中，在1500 6000r/ min离心条件下离心2 15min，离心温度控制在4 25°C ;将所述牛乳制品与样品缓冲液 按l : 1 20的比例加入离心管中，摇匀之后精确提取10 200ul加入样品管中，超声波 清洗1 15min，然后使用高压毛细管电泳分析仪测定。
7. 根据权利要求l-6中任一项所述的方法，其中，所述高压毛细管电泳分析仪的检 测参数如下检测温度控制在15 45t:之间，毛细管柱直径20 80iim、长度为150 700mm，紫外光检测器，压力进样，压力为0. 5 2psi，时间为0. 5s 25s，分离温度为15 45。C，工作电压为7 35kV。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中，所述毛细管柱可以是涂层或未涂层。
9. 根据权利要求l所述的方法，其中，所述步骤(a)和(b)中利用所述高压毛细管电泳 分析仪进行检测时所使用的电泳缓冲液pH值为2. 0 3. O，主要成分为柠檬酸。
10.根据权利要求l所述的方法，其中，所述步骤(c)计算所述牛乳制品中酪蛋白磷酸 肽含量的方法如下运用高压毛细管电泳分析仪所带的分析软件对检测结果中牛乳制品分 离的图谱进行积分计算出峰面积，将所述牛乳制品的该峰面积与所述步骤(a)中的标准曲 线进行比对，得出高压毛细管电泳分析仪所检测的所述牛乳制品中的酪蛋白磷酸肽含量。
全文摘要
本发明揭示了一种检测牛乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的方法，使用了高压毛细管电泳分析仪作为检测设备。上述方法包括制备酪蛋白磷酸肽标准溶液以生成酪蛋白磷酸肽含量与高压毛细管电泳分析仪获得的分析图谱积分值之间的标准曲线、对待测牛乳制品进行检测、根据待测牛乳制品的检测结果利用标准曲线获得待测牛乳制品的酪蛋白磷酸肽含量。本发明提供的方法检测所需时间短、精度高，并且使用了毒性和刺激性气味均较低而且灵敏性较高的样品缓冲液。
文档编号G01N27/447GK101782549SQ20101013440
公开日2010年7月21日 申请日期2010年3月29日 优先权日2010年3月29日
发明者刘卫星, 孙国庆, 康小红 申请人:内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司