一种细菌染色方法
【专利摘要】本发明公开了一种细菌染色方法，利用该方法对石蜡切片进行快速染色，可以对其中的细菌进行很好的定位，而且，该方法对细菌抹片也同样适用，而且步骤简单，容易控制。本发明公开的一种细菌染色方法，是用甲苯胺蓝溶液进行染色。本发明公开的方法具有如下优点：1、本发明的方法不仅可以对细菌抹片进行染色，而且也可以显示石蜡切片组织中的细菌。2、本发明的方法与现有的细菌染色方法相比较，具有方便、快捷的优点。
【专利说明】一种细菌染色方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种细菌染色方法，属于微生物领域。
【背景技术】
[0002] 细菌是一类原核细胞型微生物，因为菌体小、半透明，要想更清楚的观察其大小和 形态，需经染色和显微镜放大后才能看到。常用的细菌染色法有单染法、复染法和鉴别染色 法，主要有革兰氏染色、美蓝染色、抗酸染色、瑞氏染色和姬姆萨染色等方法。在进行上述染 色之前，需要制备细菌抹片，但是对石蜡切片的组织中的细菌染色报道还不多见。开发一种 既适用于石蜡切片又适用于细菌抹片的细菌染色方法具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种细菌染色方法--甲苯胺蓝法，利用该方法对石蜡切片 进行快速染色，可以对其中的细菌进行很好的定位，而且，该方法对细菌抹片也同样适用， 而且步骤简单，容易控制。
[0004] 本发明提供一种细菌染色方法，是用甲苯胺蓝溶液进行染色；
[0005] 所述甲苯胺蓝溶液按照如下方法制备：
[0006] A液：将0. 8g甲苯胺蓝在80毫升蒸馏水中溶解；
[0007] B液：将0. 6g高锰酸钾在20毫升蒸馏水中溶解；
[0008] 将A液煮沸，再将B液滴入A液中，再煮沸，用蒸馏水补足至100毫升，自然冷却后 过滤即得；
[0009] 所述煮沸的时间为lOmin。
[0010] 上述方法中，所述染色的时间为5-15s，具体为10s。
[0011] 上述任一所述的方法中，所述细菌是石蜡切片或细菌抹片中的细菌。
[0012] 上述任一所述的方法中，所述染色之后还包括如下步骤：将甲苯胺蓝溶液染色后 的石蜡切片或细菌抹片放入体积百分含量95%的乙醇水溶液中洗去浮色；
[0013] 所述洗去浮色的标准是石蜡切片的组织颜色变为浅蓝色或细菌抹片中的细菌显 示出明显的蓝色形态。
[0014] 上述任一所述的方法中，所述石蜡切片在甲苯胺蓝溶液中染色之前，还包括脱蜡 至水的步骤；
[0015] 所述脱蜡至水具体是将石蜡切片依次经过二甲苯、等体积二甲苯和无水乙醇的混 合液、无水乙醇、体积百分含量为95%的乙醇水溶液、体积百分含量为90%的乙醇水溶液、 体积百分含量为80%的乙醇水溶液、体积百分含量为70%的乙醇水溶液、蒸馏水，石蜡切 片在各试剂中的时间为3-5min ;
[0016] 所述细菌抹片在甲苯胺蓝溶液中染色之前，还包括火焰固定的步骤；
[0017] 所述火焰固定是将自然干燥的细菌抹片涂抹面向上，以其背面在火焰外焰上加 热，以不烫手为度进行固定。
[0018] 上述任一所述的方法中，所述石蜡切片在洗去浮色之后，还包括将其依次经过无 水乙醇，等体积的二甲苯和无水乙醇的混合液、二甲苯，最后将切片用中性树胶封片的步 骤；
[0019] 所述石蜡切片在所述无水乙醇，等体积的二甲苯和无水乙醇的混合液、二甲苯中 的时间为5-10min，具体为5min ;
[0020] 所述细菌抹片在洗去浮色之后，还包括自然晾干的步骤。
[0021] 上述任一所述的方法中，所述石蜡切片为鸽子嗉囊组织的石蜡切片或孟加拉虎动 物肠道组织的石蜡切片；
[0022] 所述细菌抹片为蜡样芽孢杆菌的抹片。
[0023] 本发明提供的方法具有如下优点：
[0024] 1、本发明的方法不仅可以对细菌抹片进行染色，而且也可以显示石蜡切片组织中 的细菌。
[0025] 2、本发明的方法与现有的细菌染色方法（比如革兰氏染色法和瑞氏染色法）相比 较，具有方便、快捷的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为甲苯胺蓝染色显示嗉囊组织石蜡切片中的细菌图1。
[0027] 图2为甲苯胺蓝染色显示嗉囊组织石蜡切片中的细菌图2。
[0028] 图3为甲苯胺蓝染色显示肠道组织石蜡切片中的细菌图1。
[0029] 图4为甲苯胺蓝染色显示肠道组织石蜡切片中的细菌图2。
[0030] 图5为甲苯胺蓝染色显示蜡样芽孢杆菌纯培养物图1。
[0031] 图6为甲苯胺蓝染色显示蜡样芽孢杆菌纯培养物图2。
【具体实施方式】
[0032] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0033] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034] 甲苯胺蓝溶液的配制方法：
[0035] A液：甲苯胺蓝0. 8g溶于80毫升蒸馏水中；
[0036] B液：高锰酸钾0.6g溶于20毫升蒸馏水中；
[0037] 将已溶解的A液煮沸10分钟，再将已溶解的B液逐滴加入A液中，再煮沸10分钟， 用蒸馏水补足至1〇〇毫升，待自然冷却后过滤备用。
[0038] 錯样芽抱杆菌（Bacillus cereus)在文献"Mizuka Yamaguchi, Takao Kawai. A new method for rapid and quantitative detection of the Bacillus cereus emetic toxin cereulide in food products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. Food Microbiology34 (2013) 29-37" 中公开过，公众可从中国农 业大学获得。
[0039] 鸽子嗉囊组织的石蜡切片可从中国农业大学获得。
[0040] 孟加拉虎肠道组织的石蜡切片可从中国农业大学获得。
[0041] 实施例1、石蜡切片中细菌的甲苯胺蓝法染色
[0042] 一、取鸽子嗉囊组织的石蜡切片，脱蜡至水（依次经二甲苯、二甲苯：无水乙醇（体 积比1 :1)、无水乙醇、体积百分含量为95%的乙醇水溶液、体积百分含量为90%的乙醇水 溶液、体积百分含量为80%的乙醇水溶液、体积百分含量为70%的乙醇水溶液、蒸馏水（各 步骤时间3-5min))，将切片放入配制好的甲苯胺蓝溶液中5-15s，将其放入体积百分含量 95%的乙醇水溶液中洗去浮色，显微镜控制（组织颜色变为浅蓝色），将切片依次经过无水 乙醇（脱水），二甲苯：无水乙醇（体积比1:1)、二甲苯（脱乙醇）（各5min，5-10min均可）， 最后将切片用中性树胶封片。
[0043] 常温状态下封好的切片自然晾干，用显微镜观察（细菌呈蓝色），甲苯胺蓝溶液中 染色10s的鸽子嗉囊组织的石蜡切片中的细菌染色结果如图1和图2所示。
[0044] 二、取孟加拉虎肠道组织的石蜡切片，按照步骤一的方法进行甲苯胺蓝法染色，甲 苯胺蓝溶液中染色l〇s的石蜡切片中的细菌染色结果如图3和图4所示。
[0045] 实施例2、细菌抹片的甲苯胺蓝法染色
[0046] 蜡样芽孢杆菌纯培养物（将蜡样芽孢杆菌在普通琼脂培养基上划线培养，37°C， 培养24小时），进行细菌抹片（挑取一个蜡样芽孢杆菌菌落溶于1毫升蒸馏水中，然后用 灭菌接种环取一环菌液，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小薄层），得到蜡样芽孢杆菌纯 培养物的抹片，自然干燥。火焰固定（将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯 外焰上如钟摆样来回拖过数次，略作加热，不能太热，以不烫手为度，进行固定），在抹片位 置滴加甲苯胺蓝溶液染色5-15 8，用体积百分含量95%的乙醇水溶液冲洗3〇8(158-3〇8均 可）洗去浮色，显微镜控制（看到蓝色的细菌为止），自然晾干显微镜观察，结果如图5和图 6所示。
【权利要求】
1. 一种细菌染色方法，是用甲苯胺蓝溶液进行染色； 所述甲苯胺蓝溶液按照如下方法制备： A液：将0. 8g甲苯胺蓝在80毫升蒸馏水中溶解； B液：将0. 6g高锰酸钾在20毫升蒸馏水中溶解； 将A液煮沸，再将B液滴入A液中，再煮沸，用蒸馏水补足至100毫升，自然冷却后过滤 即得。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述染色的时间为5-15s，具体为10s。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述细菌是石蜡切片或细菌抹片中 的细菌。
4. 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述染色之后还包括如下步骤：将 甲苯胺蓝溶液染色后的石蜡切片或细菌抹片放入体积百分含量95%的乙醇水溶液中洗去 浮色。
5. 根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述石蜡切片在甲苯胺蓝溶液中 染色之前，还包括脱蜡至水的步骤； 所述脱蜡至水具体是将石蜡切片依次经过二甲苯、等体积二甲苯和无水乙醇的混合 液、无水乙醇、体积百分含量为95 %的乙醇水溶液、体积百分含量为90 %的乙醇水溶液、体 积百分含量为80%的乙醇水溶液、体积百分含量为70%的乙醇水溶液、蒸馏水，石蜡切片 在各试剂中的时间为3-5min ; 所述细菌抹片在甲苯胺蓝溶液中染色之前，还包括火焰固定的步骤； 所述火焰固定是将自然干燥的细菌抹片涂抹面向上，以其背面在火焰外焰上加热，以 不烫手为度进行固定。
6. 根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述石蜡切片在洗去浮色之后，还 包括将其依次经过无水乙醇，等体积的二甲苯和无水乙醇的混合液、二甲苯，最后将切片用 中性树胶封片的步骤； 所述石蜡切片在所述无水乙醇，等体积的二甲苯和无水乙醇的混合液、二甲苯中的时 间均为5-10min，具体为5min ; 所述细菌抹片在洗去浮色之后，还包括自然晾干的步骤。
【文档编号】G01N1/30GK104089807SQ201410321905
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月7日 优先权日:2014年7月7日
【发明者】佘锐萍, 杜芳 申请人:中国农业大学