Vinexin-β在治疗脑卒中疾病中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种Vinexin-β在治疗脑卒中疾病中的应用，属于基因的功能与应用领域。本发明以Vinexin-β基因敲除小鼠为实验对象，通过大脑中动脉缺血再灌注损伤模型研究Vinexin-β基因与脑卒中的关系，结果表明与野生型对照小鼠对比，Vinexin-β基因敲除小鼠脑袋梗死体积明显减少，神经功能明显好转，脑袋死亡的神经元细胞数量也明显减少。从而发现Vinexin-β能够促进恶化神经功能和脑卒中的作用；因此，Vinexin-β可作为药物靶标筛选保护神经功能和预防、缓解和/或治疗脑卒中的药物，Vinexin-β的抑制剂可用于制备保护神经功能和预防、缓解和/或治疗脑卒中的药物。
【专利说明】[0001] Vinexin-β在治疗脑卒中疾病中的应用
【技术领域】
[0002] 本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种Vinexin-β在治疗脑卒中疾 病中的应用，具体是在制备预防、缓解和/或治疗脑卒中疾病的药物中应用。
【背景技术】
[0003] 脑卒中疾病是全球第四大致死因素，仅次于心血管疾病、肿瘤和慢性下呼吸道疾 病，也是最主要的导致终生残疾的致病因素之一。其中，约80%的患者为缺血性脑卒中，主 要发病原因是大脑血管阻塞或脑出血引起脑组织供血供氧不足。据预测，2005年至2050年 美国用于脑卒中治疗的费用按2005年购买力评估约为1520亿美元，给经济和健康造成了 巨大的负担。在中国，随着经济发展、人民生活方式转变和人口老龄化，近年来脑卒中发病 率逐年升高。我国每年约有160万人死于脑卒中，死亡率为157/10万人，已经超过心血管 疾病并成为最主要的致死因素和成人致残因素。与其他国家相似，缺血性脑卒中是我国最 常见的脑卒中类型，约占所有脑卒中的43-79%。因此脑卒中是现在以及将来很长一段时间 内人类必须面对的重大公共卫生问题之一。
[0004] 多数研究认为，恢复脑组织供血是治疗脑缺血最有效的方法。尽管1996年起组 织纤溶酶原激活剂（tPA)即批准用于缺血性脑卒中治疗，迄今为止其仍然是美国药监局 (FDA)唯一审核通过的溶栓药物。因为随时间延长出血风险增加，tPA的治疗时间窗仅为 4. 5小时；考虑到缺血性和出血性脑卒中在早期影像学不易鉴别，进一步延误了患者接受 tPA治疗的机会。目前只有小于5%的缺血性脑卒中患者使用tPA溶栓治疗。此外，研究发 现脑组织如果长时间严重缺血缺氧，即使在后期恢复脑血流仍会对脑组织造成不可逆转的 损伤，因此当前仍迫切需要研究针对缺血缺氧和（或）再灌注所致病理生理学事件的治疗策 略。
[0005] 自20世纪90年代以来，研究保护神经和脑组织的治疗策略一直是脑卒中治疗的 热点，这些策略不仅可以延长tPA的治疗时间窗，也可以减轻缺血再灌注诱导的脑组织损 伤。神经元细胞是中枢神经系统重要的组成部分，但其高代谢率降低了对缺血缺氧环境耐 受能力，因此较其他神经血管元件组分更易受到损伤。目前组织纤溶酶原激活剂（tPA)纤 溶的治疗仍是缺血性脑卒中的主要治疗手段，但其仅4. 5小时长的时间窗限制大部分患者 只能接受对症治疗。研究表明，神经元保护策略可以在脑缺血损伤后较长时间内改善大脑 功能，减少神经元细胞损失。凋亡是大脑缺血/再灌注过程中细胞死亡的基本机制之一，但 其调控机制仍未完全阐明。因此，研究大脑缺血/再灌注时神经元细胞凋亡生存的分子机 制，将有助于为神经元保护提供新的治疗策略和方法。
[0006] Vinexin和其结合蛋白粘着斑蛋白（vinculin)是组成细胞粘附的蛋白质网络的 重要组成成分，Vinexin与vinculin的结合直接影响粘着斑的形成，并调控细胞-细胞、 细胞-胞外基质的粘附，并最终影响细胞的迁移、分化、分裂和凋亡等一系列重要细胞行 为。Vinexin包括3个亚型，Vinexin-α、β和γ，这3种亚型的蛋白都在其N端有一个 SoHo (sorbinhomology)结构域和C端的三个SH3 (srchomology 3)结构域，分子结构都 高度保守。Vinexin-β在多处表达，尤其在心脏的表达水平很高。研究发现Vinexin-β 基因敲除的小鼠，对主动脉缩窄手术所引起的心肌肥厚反应更加敏感，这表明Vinexin-β 在高负荷所引起的心肌重构和衰竭反应中是一个很重要的调节蛋白（Ke Chen, et al. Vinexin-β protects against cardiac hypertrophy by blocking the Akt-dependent signalling pathway. Basic Res Cardiol，2013，108:338)。到目前为止尚无文献报道 有关Vinexin-β在脑卒中疾病中应用的内容。
【发明内容】
[0007] 为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的是确定Vinexin-β的表达与 脑卒中疾病之间的相互关系，提供一种Vinexin-β作为药物靶标在筛选保护神经功能和 预防、缓解和/或治疗脑卒中的药物中的应用，进而提供一种Vinexin-β的抑制剂在制备 保护神经功能和预防、缓解和/或治疗脑卒中的药物中的应用。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现： 本发明以Vinexin-β基因敲除小鼠为实验对象，通过小鼠大脑中动脉缺血再灌注损 伤造成脑卒中模型，研究Vinexin-β基因与脑卒中的关系，结果表明与野生型小鼠(对照 组）相比，Vinexin-β基因敲除小鼠梗死体积明显降低，神经功能明显好转，死亡神经细胞 数量减少。这提示Vinexin-β具有恶化神经功能的作用，能加重促进脑卒中的发展，为研 究预防、缓解和/或治疗脑卒中疾病的新靶点和新策略提供了理论依据和临床基础。
[0009] 因此，Vinexin-β基因可作为药物靶点，构建Vinexin-β基因过表达的体外细胞 模型或动物模型，用于筛选预防、缓解和/或治疗脑卒中的药物；Vinexin-β基因也可作为 基因治疗中的靶基因，设计并制备预防、缓解和/或治疗脑卒中的药物和/或生物学试剂， 通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗脑卒中的目的。例如以Vinexin-β为靶基因， 设计可干扰Vinexin- β表达的双链siRNA，通过化学方法合成以后，注射入人体通过RNA干 扰的方法使Vinexin-β基因沉默来治疗脑卒中；还可以设计并构建Vinexin-β的突变体， 注射后进入细胞，竞争Vinexin-β原形的作用底物，从而抑制Vinexin-β的功能，起到治 疗目的；此外，还可以以Vinexin-β为祀点设计小分子化合物抑制剂，利用Vinexin-β基 因过表达的体外细胞模型或动物模型，通过筛选，发现其中能够特异性抑制Vinexin-β的 分子，从而为脑卒中的治疗提供新的治疗性分子。
[0010] 针对Vinexin-β的上述功能，提供Vinexin-β作为药物祀标在筛选保护神经功 能的药物中的应用。
[0011] 针对Vinexin-β的上述功能，提供Vinexin-β作为药物祀标在筛选预防、缓解和 /或治疗脑卒中的药物中的应用。
[0012] 针对Vinexin-β的上述功能，提供Vinexin-β的抑制剂在制备保护神经功能的 药物中的应用。
[0013] 针对Vinexin-β的上述功能，提供Vinexin-β的抑制剂在制备预防、缓解和/或 治疗脑卒中的药物中的应用。
[0014] -种保护神经功能的药物，包含Vinexin-β的抑制剂。
[0015] -种预防、缓解和/或治疗脑卒中的药物，包含Vinexin-β的抑制剂。
[0016] 所述的Vinexin-β的抑制剂优选为Vinexin-β基因的siRNA、Vinexin-β基因 的RNA干扰载体，Vinexin-β的抗体及其他能够抑制Vinexin-β表达的抑制剂中的一种。
[0017] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果： (1)本发明发现Vinexin-β的新功能，即Vinexin-β能够恶化脑卒中的作用。
[0018] (2)基于Vinexin-β在恶化脑卒中疾病中的功能，其为研制预防、缓解和/或治疗 脑卒中的药物提供靶标。
[0019] (3)Vinexin-0的抑制剂可用于制备保护神经功能和预防、缓解和/或治疗脑卒 中的药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1是WT和Vinexin-β -K0小鼠大脑缺血/再灌注损伤严重程度的评估结果图。 A为TTC染色结果图，B为脑梗体积统计柱状图，C为神经功能评分统计柱状图（* :p < 0. 05 vs 野生型 I/R(24h)组，# :p < 0· 05 vs 野生型 I/R(72h)组)。
[0021] 图2是Fluoro Jade B染色检测脑组织梗死周边区神经元细胞凋亡情况测定结果 图。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0023] 实验用动物及饲养 实验动物：选用雄性，11-12周龄，体重在25-30g，背景为C57BL/6的野生型小鼠（WT， 购自北京华阜康生物科技有限公司，质量合格证号=949431)、Vinexin-β基因敲除小鼠 (Vinexin-β-ΚΟ,购自日本 RIKEN 公司，货号：01732)。
[0024] 饲养环境：所有实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级实验动物中 心。SRF级大小鼠饲料购自北京华阜康生物科技有限公司。饲养条件：室温在22-24°C之 间，湿度在40-70%之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。
[0025] 实施例1小鼠脑梗死模型（I/R)获得 1.实验动物分组：野生型小鼠及Vinexin-β基因敲除小鼠，通过大脑中动脉缺血再 灌注建立脑梗死模型（I/R)。随机分为2组，每组10只小鼠：野生型小鼠 I/R术组（WT 1/ RXVinexin-β基因敲除小鼠 I/R术组（K0 I/R)。
[0026] 2.线栓法脑梗死 I/R 手术米用 MCA0(middle cerebral artery occlusion，大脑 中动脉闭塞）模型操作流程： (1)抓取小鼠，使用3%异氟烷麻醉小鼠，8%硫化钠脱去颈部的鼠毛，颅顶鼠毛用手术剪 迅速剪掉，3%活力碘消毒颈部及颅顶皮2次，75%酒精脱碘1次。
[0027] (2)在小鼠的颅顶部位横向切口，暴露颅骨，用镊子轻轻剥离颅骨表面的结缔组 织。将激光多普勒血流仪的光纤探头用生物胶固定在前?后方2_、左侧5_的部位。
[0028] (3)将小鼠仰卧固定，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离左 侧颈总动脉（CCA)、颈外动脉（ECA)和颈内动脉（ICA)。用微动脉夹暂时夹闭ICA、CCA，在 ECA远心端结扎和剪一小口，将线栓由剪口送入ICA，当线栓进入深度在9-11mm左右至血流 下降遇阻力停，整个过程必须维持小鼠的肛温在37±0. 5°C。
[0029] (4)从线栓进入脑血管至血流下降遇阻力时开始计时，45min后将线栓拔出，并将 ECA近心端结扎，迅速松开CCA处动脉夹。注意观察血流恢复情况，选择血流下降75%以上， 血流恢复达70%以上的小鼠纳入实验。
[0030] (5)缝合小鼠颈部及头部皮肤，并用活力碘消毒伤口。手术结束后，将小鼠放在温 箱中，箱温维持在28°C，给水和饲料，分别在24h、72h取材。
[0031] 实施例2脑梗死模型（I/R)小鼠脑梗死体积测定 脑缺血/再灌注损伤严重程度的评估指标主要包括大脑梗死体积和神经功能评分，这 些指标均与缺血/再灌注损伤严重程度正相关。
[0032] (1)分别在手术后24h、72h取材前进行神经功能及行为学评分； 基于Berderson神经功能评分改进方法（9分制）： 0分：无神经受损的症状； 1分：提尾时对侧前肢蜷曲，或者不能完全到达患侧前肢； 2分：提尾时对侧肩膀内收； 3分：平推：向对侧推动时阻力下降； 4分：可自发的向各个方向运动，但在脱尾巴时只向对侧转弯； 5分：自发运动时转圈或只向对转； 6分：无自主运动，只在刺激时运动； 7分：无自主运动，刺激时也无运动； 8分：与脑缺血有关的死亡。
[0033] (2)抓取小鼠，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉小鼠，取脑。
[0034] (3)将取下的脑组织放入1mm小鼠脑模，置于_20°C冰箱冻存。
[0035] (4)脑组织 2, 3, 5_ 三苯基氯化四氮唑（2, 3, 5-Triphenyltetrazolium chloricej，TTC)染色：从-20°C冰箱取出脑组织，立即切成1mm厚的切片，共切7片。将切 片立即置于10mL 2% TTC溶液中，37°C恒温孵育lOmin。正常脑组织染色后呈鲜红色，而梗 死区呈苍白色。
[0036] (5)用10%中性福尔马林溶液固定脑组织切片，大体拍照。
[0037] (6)脑梗体积计算（Image-Pro Plus 6. 0软件）：梗死体积％ =(对侧大脑半球体 积-梗死侧未梗死体积）/(对侧大脑半球体积X2) X 100%; 总梗死体积为各自7张大脑切片结果数据之和。
[0038] TTC是脂溶性光敏感复合物，它是呼吸链中吡啶-核苷结构酶系统的质子受体，与 正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，而缺血组织内脱氢酶活性下降，不能反应，呈苍白色。
[0039] TTC染色结果如图1A和B所示，经过I/R缺血45min再灌注24小时后 Vinexin-β -K0小鼠梗死体积较野生型小鼠降低，且这种保护作用在I/R术后72小时仍然 持续，脑组织梗死比野生型小鼠均低；而神经功能评分在I/R术后24小时、72小时均比野 生型小鼠均低（图1C)。表明Vinexin-β基因的缺失可减少缺血再灌注损伤引起的脑卒中 小鼠的大脑梗死体积，可保护神经功能。
[0040] 实施例3脑组织梗死周边区神经元细胞凋亡情况测定 1.脑组织冰冻切片制备 (1)抓取小鼠，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉小鼠。
[0041] (2)开胸暴露心脏，用注射针头穿刺入左心室，同时剪开右心房。
[0042] (3)用PBS (0.01M，pH 7.4)100mmHg压力灌流至肝脏变白后，用4%多聚甲醛灌流 15min〇
[0043] (4)开颅迅速取出小鼠大脑，室温4%多聚甲醛后固定6_8h。
[0044] (5)切除脑组织的嗅球和小脑，再延正中线将大脑分为先后两个部分，用先前的固 定液再固定15min。
[0045] (6)随后浸没于含30%蔗糖的PBS (0· 01M，pH 7. 4)中，4°C冰箱沉底过夜。
[0046] (7) 30%蔗糖与0CT包埋剂按1:1 (v/v)混合后，倒适量到包埋框中，将前一步的 组织取出，在纱布上吸去液体后在该包埋框中浸泡一会儿，再将其转入到先已加入2滴0CT 的另一个包埋框中，调整组织的位置，使其正好位于包埋框的正中。
[0047] (8)将盛组织的包埋框，移入干冰中，尽量使其处于水平位，稍待一会儿后，继续加 入0CT，浸没组织一定的高度，待0CT凝固后，将其储存于-80°c的冰箱中。
[0048] (9)用冰冻切片机的标准程序切5 μ m的冰冻切片备用。
[0049] 2. FJB (Fluoro Jade B)染色 (1) 将冰切组织切片在烘箱中烘干1小时； (2) 1% Na0H+80% 无水乙醇 5min ; (3) 70%无水乙醇2min ; (4) ddH20 2min ； (5) Flouro Jade B 稀释液（AG310, Millipore, Billerica, MA)，室温，避光 20min; (6) ddH20 lminX3 ； (7) 在烘箱中烘片5-10min ; (8) 二甲苯 > lmin ; (9) 封片，拍照。
[0050] 脑组织梗死周边区神经元细胞凋亡情况测定结果见图2所示，本实施例检测了 Vinexin-β-ΚΟ小鼠和野生型小鼠 I/R术后24小时脑组织梗死周边区神经元细胞凋亡 情况。Fluoro Jade B细胞凋亡检测显示，Vinexin-β-ΚΟ组小鼠的凋亡细胞数量明显比 WT组小鼠少，这表明Vinexin-β与神经元细胞缺血再灌注时死亡相关。这些结果表明， Vinexin-β的缺失可以减少神经元细胞的凋亡。
[0051] 研究结果表明，在大脑中动脉缺血再灌注引起的损伤中，Vinexin-β敲除后 的小鼠梗死体积显著减少，神经功能明显好转，凋亡的神经细胞数量也明显减少，这说明 Vinexin-β敲除可保护神经功能，改善脑卒中；Vinexin-β在脑卒中疾病模型中有着重 要的恶化作用。
[0052] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. Vinexin-β作为药物靶标在筛选保护神经功能的药物中的应用。 2. Vinexin- β作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脑卒中疾病的药物中的应 用。 3. Vinexin-β的抑制剂在制备保护神经功能的药物中的应用。
4. 一种保护神经功能的药物，其特征在于：包含Vinexin-β的抑制剂。 5. Vinexin-β的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脑卒中疾病的药物中的应用。
6. -种预防、缓解和/或治疗脑卒中疾病的药物，其特征在于：包含Vinexin-β的抑 制剂。
7. 根据权利要求3或5所述的应用或权利要求4或6所述的药物，其特征在于：所述 的Vinexin-β的抑制剂为Vinexin-β基因的siRNA、Vinexin_i3基因的RNA干扰载体或 Vinexin-β的抗体及其他能够抑制Vinexin-β表达的抑制剂中的一种。
【文档编号】G01N33/68GK104087678SQ201410355303
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2014年7月23日
【发明者】李红良, 郭森, 卢燕云, 郑安康, 李明昌 申请人:武汉大学