一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法
【专利摘要】一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法，是采用碘乙酸与蛋白质中的游离巯基反应，通过超滤去除未反应的碘乙酸，再运用二硫苏糖醇切断蛋白质中的二硫键，进而采用碘乙酰胺与新产生的巯基反应，运用胰蛋白酶将蛋白质水解成多肽，借助高分辨率质谱检测多肽的质荷比信息，与天然蛋白质的二硫键信息进行对比，确定二硫键是否发生断裂。本发明可有效用于确定巯基是以游离或者二硫键的形式存在；碘乙酸和碘乙酰胺与巯基反应后引起的质量差在1Da以内，因此运用高分辨率质谱能十分准确的断定二者的差别；蛋白质二硫键是否发生断裂的准确判断能为相关理论研究奠定基础，为特定的蛋白质修饰及实际生产提供理论依据。
【专利说明】一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法。
【背景技术】
[0002]二硫键是由2个巯基被氧化而形成的-S-S-形式的共价键。二硫键分两种，即分子内和分子间二硫键，分子内二硫键存在于单独的多肽链中用来稳固蛋白质的三级结构，而分子间二硫键存在于肽链之间用来稳定蛋白质的四级结构。二硫键的断裂会促使蛋白质的立体结构发生一定程度的改变，进而影响蛋白质的生物特性及反应活性，例如，二硫键的断裂会加速卵清蛋白发生糖基化反应。目前，人类正不断尝试通过某种技术改变蛋白质结构，从而改造其性能。例如，通过超声波技术可以改变牛血清白蛋白结构，进而加速其发生糖基化反应的速率。蛋白质结构的改变是否和二硫键断裂有关？这一问题的回答有利于指导蛋白质功能性质的定向改造，因此，寻找一种能够准确检测蛋白质二硫键是否发生断裂的方法显得十分必要。
[0003]本发明采用碘乙酸与蛋白质中的游离巯基反应，通过超滤去除未反应的碘乙酸，再运用二硫苏糖醇断裂蛋白质的二硫键产生新的巯基，采用碘乙酰胺与蛋白质中新产生的巯基反应，运用胰蛋白酶将被碘乙酰胺作用后的蛋白质水解成多肽，借助高分辨率质谱检测多肽的质荷比信息，与天然蛋白质的二硫键信息进行对比，确定二硫键是否发生断裂。本发明采用碘乙酸与蛋白质的游离巯基反应、碘乙酰胺与经二硫苏糖醇断裂蛋白质二硫键得到的巯基反应，运用高分辨率质谱进行检测，国内外未有文献进行相关报道。
【发明内容】
[0004]本发明旨在提供一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法，采用碘乙酸与蛋白质的游离巯基反应、碘乙酰胺与经二硫苏糖醇断裂蛋白质二硫键得到的巯基反应，运用高分辨率质谱进行检测，与天然蛋白质的二硫键信息进行比对，确定二硫键是否发生断裂。
[0005]其具体工艺步骤如下：
I、蛋白质游离巯基与碘乙酸反应
(1)蛋白质溶液的配制：用IO-IOOmM的碳酸氢氨溶液溶解得到O.1-2. O mg/ml的蛋白质溶液；
(2)碘乙酸溶液的配制：用超纯水配制50-150mM的碘乙酸溶液；
(3)蛋白质游离巯基与碘乙酸反应：将10-30μ I蛋白质溶液与3-10 μ I碘乙酸溶液混合，混勻后，避光放置20-60 min ；
(4)去除未参与反应的碘乙酸：采用1000-10000Da的超滤离心管去除未参与反应的多余碘乙酸。
[0006]2、二硫苏糖醇断裂蛋白质二硫键
(O 二硫苏糖醇溶液配制：用超纯水配制50-150mM的二硫苏糖醇溶液；
(2)二硫苏糖醇断裂蛋白质二硫键：向蛋白质溶液中加入二硫苏糖醇溶液2-10 μ 1，50-100°C处理3-30min，冷却至室温；
3、碘乙酰胺与经二硫苏糖醇断裂二硫键得到的巯基反应
(1)碘乙酰胺溶液的配制：用超纯水配制50-150mM的碘乙酰胺溶液；
(2)碘乙酰胺与经二硫苏糖醇断裂二硫键得到的巯基反应：向蛋白质溶液中加入碘乙酰胺溶液5-15 μ 1，混匀后，避光放置20-60 min ；
4、胰蛋白酶酶解蛋白质
(O胰蛋白酶的配制：用超纯水配制O. 1-1. Omg/ml的胰蛋白酶溶液；
(2)胰蛋白酶酶解蛋白质：按照蛋白质与胰蛋白酶质量比g/g为100:1-100:1，将胰蛋白酶与蛋白质溶液混合，在30-50°C的摇床中放置8-24h ；
(3)中止胰蛋白酶的水解反应：加入1-10%的三氟乙酸2-10μ I中止胰蛋白酶的水解反应，得到最终的蛋白质水解混合物。
[0007]5、高分辨率质谱检测
(1)上样：将2-15μ g的蛋白质水解物注射入高效液相色谱仪，脱盐3-10min ；
(2)高分辨率质谱检测：连接高效液相色谱仪和高分辨率质谱设备，采谱30-60min，记录蛋白质水解物的质谱信息；
6、数据分析
(1)质谱图谱分析：整理蛋白质水解产物的质谱信息，碘乙酸与巯基反应会使多肽质量增加57. 09-58. 02Da，碘乙酰胺与巯基反应会使多肽质量增加57. 01-57. 03Da ；
(2)蛋白质中巯基游离情况分析：根据蛋白质水解物的质荷比增加信息，断定巯基是与碘乙酸发生反应还是与碘乙酰胺发生反应，若与碘乙酸发生反应则说明蛋白质中的巯基是游离的，若与碘乙酰胺发生反应则说明蛋白质中的巯基是结合的，即以二硫键的形式存在；
(3)确定蛋白质中的二硫键是否发生断裂：根据数据库中天然蛋白质的二硫键存在信息，对比实验中得到的二硫键信息，确定蛋白质中的二硫键是否发生断裂。
[0008]本专利技术特征：采用碘乙酸与蛋白质的游离巯基反应、碘乙酰胺与经二硫苏糖醇断裂蛋白质二硫键得到的巯基反应，运用高分辨率质谱进行检测，根据质谱图谱给出的二硫键信息，对比天然蛋白质的二硫键信息，准确判断蛋白质的二硫键是否发生断裂。
[0009]本发明的有益效果：
I、碘乙酸和碘乙酰胺都可以与游离巯基发生反应，但是反应后二者引起的质量增加情况不同，可以有效用于确定巯基是以游离或者二硫键的形成存在；2、碘乙酸和碘乙酰胺与巯基反应后引起的质量差在IDa以内，因此，运用高分辨率质谱能十分准确的断定二者的差别；3、蛋白质二硫键是否发生断裂的准确判断能为相关理论研究奠定基础，为特定的蛋白质修饰及实际生产提供依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图I为本发明的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0011]实施例一 I、蛋白质游离巯基与碘乙酸反应
(1)蛋白质溶液的配制：用50mM的碳酸氢氨溶液溶解得到I.O mg/ml的蛋白质溶液；
(2)碘乙酸溶液的配制：用超纯水配制IOOmM的碘乙酸溶液；
(3)蛋白质游离巯基与碘乙酸反应：将10μ I蛋白质溶液与3μ I碘乙酸溶液混合，混匀后，避光放置30min ；
(4)去除未参与反应的碘乙酸：采用3000Da的超滤离心管去除未参与反应的多余碘乙酸。
[0012]2、二硫苏糖醇断裂蛋白质二硫键
(O 二硫苏糖醇溶液配制：用超纯水配制IOOmM的二硫苏糖醇溶液；
(2) 二硫苏糖醇断裂蛋白质二硫键：向蛋白质溶液中加入二硫苏糖醇溶液2 μ 1，95°C处理5 min,冷却至室温；
3、碘乙酰胺与经二硫苏糖醇断裂二硫键得到的巯基反应
(1)碘乙酰胺溶液的配制：用超纯水配制IOOmM的碘乙酰胺溶液；
(2)碘乙酰胺与经二硫苏糖醇断裂二硫键得到的巯基反应：向蛋白质溶液中加入碘乙酰胺溶液5 μ 1，混匀后，避光放置20min ；
4、胰蛋白酶酶解蛋白质
(O胰蛋白酶的配制：用超纯水配制O. lmg/ml的胰蛋白酶溶液；
(2)胰蛋白酶酶解蛋白质：按照蛋白质与胰蛋白酶质量比50:1(g/g)，将胰蛋白酶与蛋白质溶液混合，在37 °C的摇床中放置12 h ;
(3)中止胰蛋白酶的水解反应：加入10%的三氟乙酸2μI中止胰蛋白酶的水解反应，得到最终的蛋白质水解混合物。
[0013]5、高分辨率质谱检测
(1)上样：将3μ g的蛋白质水解物注射入高效液相色谱仪，脱盐5 min ；
(2)高分辨率质谱检测：连接高效液相色谱仪和高分辨率质谱设备，采谱60min，记录蛋白质水解物的质谱信息；
6、数据分析
(1)质谱图谱分析：整理蛋白质水解产物的质谱信息，碘乙酸与巯基反应使多肽质量增加58. 005?a，碘乙酰胺与巯基反应会使多肽质量增加57. 0215Da ；
(2)蛋白质中巯基游离情况分析：根据蛋白质水解物的质荷比增加信息，断定巯基是与碘乙酸发生反应还是与碘乙酰胺发生反应，若与碘乙酸发生反应则说明蛋白质中的巯基是游离的，若与碘乙酰胺发生反应则说明蛋白质中的巯基是结合的，即以二硫键的形式存在；
(3)确定蛋白质中的二硫键是否发生断裂：根据数据库中天然蛋白质的二硫键存在信息，对比实验中得到的二硫键信息，实验结果显示为游离巯基但是天然蛋白质信息中显示是以二硫键形成存在，说明蛋白质的二硫键发生了断裂。
[0014]实施例二
I、蛋白质游离巯基与碘乙酸反应
(1)蛋白质溶液的配制：用IOOmM的碳酸氢氨溶液溶解得到I.O mg/ml的蛋白质溶液；
(2)碘乙酸溶液的配制：用超纯水配制IOOmM的碘乙酸溶液； (3)蛋白质游离巯基与碘乙酸反应：将20μ I蛋白质溶液与3μ I碘乙酸溶液混合，混匀后，避光放置30min ；
(4)去除未参与反应的碘乙酸：采用2000Da的超滤离心管去除未参与反应的多余碘乙酸。
[0015]2、二硫苏糖醇断裂蛋白质二硫键
(O 二硫苏糖醇溶液配制：用超纯水配制IOOmM的二硫苏糖醇溶液；
(2)二硫苏糖醇断裂蛋白质二硫键：向蛋白质溶液中加入二硫苏糖醇溶液2 μ 1，95°C处理10 min,冷却至室温；
3、碘乙酰胺与经二硫苏糖醇断裂二硫键得到的巯基反应
(1)碘乙酰胺溶液的配制：用超纯水配制IOOmM的碘乙酰胺溶液；
(2)碘乙酰胺与经二硫苏糖醇断裂二硫键得到的巯基反应：向蛋白质溶液中加入碘乙酰胺溶液5 μ I,混匀后,避光放置40min ；
4、胰蛋白酶酶解蛋白质
(O胰蛋白酶的配制：用超纯水配制O. lmg/ml的胰蛋白酶溶液；
(2)胰蛋白酶酶解蛋白质：按照蛋白质与胰蛋白酶质量比20:1(g/g)，将胰蛋白酶与蛋白质溶液混合，在37°C的摇床中放置18h ；
(3)中止胰蛋白酶的水解反应：加入5%的三氟乙酸2μI中止胰蛋白酶的水解反应，得到最终的蛋白质水解混合物。
[0016]5、高分辨率质谱检测
(1)上样：将5μ g的蛋白质水解物注射入高效液相色谱仪，脱盐5min ；
(2)高分辨率质谱检测：连接高效液相色谱仪和高分辨率质谱设备，采谱45min，记录蛋白质水解物的质谱信息；
6、数据分析
(1)质谱图谱分析：整理蛋白质水解产物的质谱信息，碘乙酸与巯基反应使多肽质量增加58. 004?a，碘乙酰胺与巯基反应会使多肽质量增加57. 0225Da ；
(2)蛋白质中巯基游离情况分析：根据蛋白质水解物的质荷比增加信息，断定巯基是与碘乙酸发生反应还是与碘乙酰胺发生反应，若与碘乙酸发生反应则说明蛋白质中的巯基是游离的，若与碘乙酰胺发生反应则说明蛋白质中的巯基是结合的，即以二硫键的形式存在；
(3)确定蛋白质中的二硫键是否发生断裂：根据数据库中天然蛋白质的二硫键存在信息，对比实验中得到的二硫键信息，实验结果显示为游离巯基但是天然蛋白质信息中显示是以二硫键形成存在，说明蛋白质的二硫键发生了断裂。
【权利要求】
1.一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法，其特征是: A、蛋白质游离巯基与碘乙酸反应； B、二硫苏糖醇断裂蛋白质二硫键； C、碘乙酰胺与经二硫苏糖醇断裂二硫键得到的巯基反应； D、胰蛋白酶酶解蛋白质； E、高分辨率质谱检测； F、数据分析。
2.根据权利要求1所述的一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法，其特征是: 所述蛋白质游离巯基与碘乙酸反应包括如下步骤: (1)用10-100mM的碳酸氢氨溶液溶解得到0.1-2.0mg/ml的蛋白质溶液； (2)用超纯水配制50-150mM的碘乙酸溶液；(3)将10-30μ 1蛋白质溶液与3-10 μ 1碘乙酸溶液混合，混匀后，避光放置20-60min ； (4)采用1000-10000Da的超滤离心管去除未参与反应的多余碘乙酸。
3.根据权利要求1所述的一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法，其特征是: 所述二硫苏糖醇断裂蛋白质二硫键包括如下步骤: (1)用超纯水配制50-150mM的二硫苏糖醇溶液； (2)向蛋白质溶液中加入二硫苏糖醇溶液2-1(^1，50-1001:处理3-301^11，冷却至室温。
4.根据权利要求1所述的一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法，其特征是: 所述碘乙酰胺与经二硫苏糖醇断裂二硫键得到的巯基反应包括如下步骤: (1)用超纯水配制50-150mM的碘乙酰胺溶液； (2)向蛋白质溶液中加入碘乙酰胺溶液5-15μ 1，混匀后，避光放置20-60min。
5.根据权利要求1所述的一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法，其特征是: 所述胰蛋白酶酶解蛋白质包括如下步骤: (1)用超纯水配制0.1-1.0mg/ml的胰蛋白酶溶液； (2)按照蛋白质与胰蛋白酶质量比g/g为100:1-100:1，将胰蛋白酶与蛋白质溶液混合，在30-50°C的摇床中放置8-24h ； (3)加入1-10%的三氟乙酸2-10μ 1中止胰蛋白酶的水解反应，得到最终的蛋白质水解混合物。
6.根据权利要求1所述的一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法，其特征是: 所述高分辨率质谱检测包括如下步骤: (1)将2-15μ g的蛋白质水解物注射入高效液相色谱仪，脱盐3-10min ； (2)连接高效液相色谱仪和高分辨率质谱设备，采谱30-60min，记录蛋白质水解物的质谱信息。
7.根据权利要求1所述的一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法，其特征是: 所述数据分析包括如下步骤: (1)整理蛋白质水解产物的质谱信息，碘乙酸与巯基反应会使多肽质量增加.57.09-58.02Da，碘乙酰胺与巯基反应会使多肽质量增加57.01-57.03Da;(2)根据蛋白质水解物的质荷比增加信息，断定巯基是与碘乙酸发生反应还是与碘乙酰胺发生反应，若与碘乙酸发生反应则说明蛋白质中的巯基是游离的，若与碘乙酰胺发生反应则说明蛋白质中的巯基是结合的，即以二硫键的形式存在；(3)根据数据库中天然蛋白质的二硫键存在信息，对比实验中得到的二硫键信息，确定蛋白质中的二硫键是否发生断裂。
【文档编号】G01N30/88GK104237439SQ201410526145
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年10月9日 优先权日:2014年10月9日
【发明者】涂宗财, 沙小梅, 肖辉, 王辉, 段邓乐, 陈媛, 刘光宪 申请人:江西师范大学