专利名称：：通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂的方法
技术领域：
：本发明涉及一种制备蛋白质基表面活性剂方法，特别涉及一种通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂的方法。
背景技术：
：蛋白质是一类最重要的生物大分子，存在于一切生物体内，是细胞的主要成分，是生命的基础物质，是一种纯天然的营养物质。根据侧链基团的极性，组成蛋白质的20多种氨基酸基本上可以划分为极性氨基酸和非极性氨基酸两大类，因此，所有蛋白质都同时含有极性和非极性基团，是一种理想的两性分子或表面活性分子，理论上应该具有理想的表面活性性能。然而，由于极性和非极性氨基酸在每一种蛋白质肽链中的不规则性或特异性分布，以及蛋白质空间结构和空间结构作用力如二硫键等的影响，绝大多数水溶性蛋白质因非极性基团被包裹在致密稳固的蛋白质分子内部而无法表面出其表面活性功能。现有技术对蛋白质制备表面活性剂的处理是通过酸、碱、酶等水解蛋白质，打断蛋白质分子的结构，使蛋白质变成多肽、氨基酸等小分子的混合物，或者在蛋白质进行水解后，再对水解后的多肽、氨基酸等小分子混合物进行化学修饰，而制成蛋白质基表面活性剂。该方法破坏了蛋白质极性和非极性基团，破坏了蛋白质结构的完整性和蛋白质的天然性能。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂的方法，该方法最大限度的保护了蛋白质的极性和非极性基团不受破坏，保持了蛋白质结构的完整性、性能的天然性。解决上述技术问题的技术方案是一种通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂的方法，该方法是用过氧化物氧化蛋白质中的二硫键，使二硫键转化成磺酸基，打开蛋白质的折叠盘绕结构，使它的表面活性性能表现出来，从而制备出具有乳化、起泡、消泡、洗涤、去污和浸润等功能的蛋白质基表面活性剂。本发明的进一步技术方案是该方法的具体步骤是A、制备水溶性蛋白质溶液并测定其二硫键的含量；b、打开蛋白质二硫键；C、纯化去除混合物中多余的氧和过氧化物；D、测定纯化后的蛋白质基表面活性剂中二硫键的含量。本发明的更进一步技术方案是根据使用性能和目的的不同，对打开二硫键后得到蛋白质进行进一步的化学修饰，其方法包括通过或是在打开二硫键的蛋白质侧链中引进极性基团如-cocr、-so3-、-so3h、^(0^3)+或-011，或是在打开二硫键的蛋白质侧链中引进非极性基团如垸基、苯基，进一步改善或提高肽段的表面活性性能；根据使用性能和目的的不同，对打开二硫键后得到蛋白质进行进一步的化学修饰的方法还包括通过乙酰化、琥珀酰化、脂酰化或磷酸化进一步改变蛋白质的表面活性性能，所述的表面活性性能是指表面张力、乳化、起泡、消泡、洗涤、去污和浸润性能。本发明之通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂的方法的原理是通过氧化二硫键来打开蛋白质的盘绕折叠的分子结构，使蛋白质分子的基性和非极性基团完全暴露出来，从而制备出蛋白质基表面活性剂(参见图l)。以甲酸为例，其反应式为-1、甲酸与过氧化氢反应生成过氧甲酸-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>2、过氧甲酸与蛋白质水溶液反应打开二硫键:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其有益效果是本发明最大限度地保护了蛋白质的极性和非极性基团免受破坏，保持了蛋白质分子结构的完整性、性能的天然性，使蛋白质变为纯天然、高性能的表面活性齐U。它能大幅度地改善蛋白质的表面活性性能，这些性能包括乳化、起泡、消泡、洗涤、去污和浸润性能。经初步实验，其乳化性有明显提高，起泡性能大大改善。本发明制备的纯天然蛋白质表面活性剂是现有的合成表面活性剂的最好代替品，有广阔的实用前景。这种蛋白质基表面活性剂可用于日用化工、纺织、食品工业和医学等领域，添加到洗涤剂、化妆品、纤维油剂、整理剂、染色剂、金属捕捉剂、防锈剂和离子浮选剂中作为表面活性剂，应用范围广。下面，结合实施例对本发明之通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂的方法的技术特征作进一步的说明。图l:通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂方法的原理图(以过氧甲酸为例)。具体实施例方式本发明通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂的方法，是用过氧化物氧化蛋白质中的二硫键，使二硫键转化成磺酸基，打开蛋白质的折叠盘绕结构，使它的表面活性性能表现出来，从而制备出具有乳化、起泡、消泡、洗涤、去污和浸润等功能的蛋白质基表面活性剂。以下，通过两个实施例进一步说明该方法的具体步骤以及过氧化物的用量、反应时间长短对蛋白质基表面活性度的影响。实施例一一种采用不同用量的过氧化物通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂的方法，它包括以下具体步骤A、制备水溶性蛋白质溶液并测定其二硫键的含量-取50g大豆分离蛋白放入离心管中，加入500mL的蒸馏水，放到摇床里，温度控制在20士2。C、摇床速度50次/分钟，60min后离心，离心速度为4000转/分钟，然后将上清液倒入2500mL的容量瓶中，再加入500mL的蒸馏水，放到摇床里，60min后离心，如此重复三次，然后把水溶蛋白溶液定容到2500mL，再用凯氏定氮法分析水溶性蛋白质含量为0.01246g/mL,并用分光光度计测定出未打开前二硫键的含量为0.3034pmol/mL(参见附表一)；B、打开蛋白质二硫键①制备过氧甲酸溶液在2(TC下，将900mL甲酸按9:1的比例和浓度为30%的100mL过氧化氢水溶液混合后放置2到2.5小时，制成1000mL过氧甲酸浓度为lmol/L的过氧甲酸溶液备用；②用过氧化物氧化蛋白质在6个分别装有200mL蛋白质含量为0.01246g/mL的水溶性大豆蛋白质溶液的烧瓶中，分别加入上述过氧甲酸浓度为lmol/L的过氧化物溶液lmL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL，将所得的混合物置于零下l(TC左右的冰盐浴中，在黑暗中反应3小时后，测定反应物中二硫键的含量(参见附表二)，再分别加入2mL的乙醇使其终止反应；C、纯化将加入终止剂的混合液在405(TC的水浴中减压蒸馏，待溶剂蒸干后加入50mL水再蒸干，如此重复蒸干23次水后除去混合物中多余的氧、中和多余的甲酸或过氧甲酸，制得蛋白质基表面活性剂；D、测定纯化后的蛋白质基表面活性剂中二硫键的含量据测算,纯化后的蛋白质基表面活性剂中二硫键的数量比打开前减少30%100%。本实施例中，未采用本发明方法处理前水溶性大豆分离蛋白中二硫键含量及其性能参见附表一《未处理前水溶性大豆分离蛋白中二硫键含量及其性能一览表》，本发明方法中过氧化物的用量对于蛋白质基表面活性度的影响参见附表二《过氧化物的用量比对蛋白质基表面活性度的影响一览表》。附表一《未处理前水溶性大豆分离蛋白中二硫键含量及其性能一览表》<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>附表二过氧化物的用量比对蛋白质基表面活性度的影响一览表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>从上表可以看出随着过氧甲酸加入量的增加，水溶性大豆蛋白中二硫键的含量越来越少，即二硫键的打开程度越来越大，说明过氧甲酸的量对二硫键的打开程度有很大的影响，二硫^T开的百分率从35.87。/。逐渐上升至95.49Q/。，而且也影响到了蛋白质的表面活性性能，其乳化性能也愈沬鉞子。1，乳化性的测定效提:取40mL的大豆油+5mL的样品+50mL的水，在高速乳化机下搅打1分钟后，再静置一小时后测定油层的高度——即乳化层高度，别媳高度愈高，表明欺L化性^子。其i"t^公式为乳化层的高度乳化性U)=-xl加液体总髙度本发明实施例一也说明，在打开蛋白质二硫键的反应过程中，根据对蛋白质基表面活性剂活性要求的不同，可以通过改变过氧化物与蛋白质原料比例来控制蛋白质中二硫键的打开量，一般，过氧化物与蛋白质原料比例按体积比计算为过氧化物溶液水溶性蛋白质溶液=0.0050.03:1。实施例二一种通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂的方法。方法的A、制备水溶性蛋白质溶液并测定其二硫键的含量，B、打开蛋白质二中的①制备过氧甲酸溶液过程与实施例一相同，所不同之处在于用过氧化物氧化蛋白质过程中，过氧化物反应时间长短不同，其具体实验步骤如下②用过氧化物氧化蛋白质在6个分别装有200mL蛋白质含量为0.01246g/mL的水溶性大豆蛋白质溶液的烧瓶中，分别加入4mL浓度为lmol/L的过氧甲酸溶液，将其混合液置于温度为零下l(TC左右的冰盐浴中，在黑暗中反应，各个烧瓶中溶液的反应时间分别定为lh、2h、3h、4h、5h、6h，然后分别加入2mL的乙醇使其终止反应，经过纯化处理得到蛋白质表面活性剂，测定纯化后的蛋白质基表面活性剂中二硫键的含量据测算,纯化后的蛋白质基表面活性剂中二硫键的数量比打开前减少85°/。100%(参见附表三《加入过氧化物反应时间长短对蛋白质基表面活性度的影响》。附表三《加入过氧化物反应时间长短对蛋白质基表面活性度的影响》<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>从附表三中可以看出随着反应时间的增加，水溶性大豆蛋白中二硫键的含量也越来越少，但是含量的变化不是很大，即反应时间对二硫键的打开程度的影响较小，但对于蛋白质的表面活性性能而言，二硫键的不同打开程度，表面活性性能不同。经过实验，本发明发明人还发现样品的pH值对衡量蛋白质基表面活性性能的其他指标亦有很大的影响，所以对反应后不同pH值状态下，样品的乳化性、乳化稳定性以及起泡性(Foamability)和泡沫稳定性(Fo謹sStability,FS)要重新测定，其结果参见附表四、附表五。附表四pH值及过氧化物的用量比对蛋白质基表面活性——(乳化性、起泡性)的影响一览表加入的过甲酸量lmL2mL3mL4mL5mL6jiiL乳化性测定(％)未调pH值62.167.670.567.972.665.8调pH值8079.269.584.275.877.4乳化稳定性测定C1/。未调pH值98.3793.594.0588.489.992.8调pH值94.777.186.47094.4肌3起泡性测定(％)未调pH值143.373.3156.7180100166.7调pH值160186.7166.7160183.3183.3起泡稳定性测定(7。)未调pH值53.542.319.1724.126.718调pH值62.841.15264,66072.7附表五pH值及过氧化物反应时间长短对蛋白质基表面活性——(乳化性、起泡性)的影响一览表反应时间lh2h3h4h5h6h乳化性测定(％)未调pH值69.567.467.970.568.966.3调pH值65.363.284.285.38074.71乳化稳定性测定C3/。)未调pH值97.093.888,489.693.188.9调pH值96.895.87071.073.783.1起泡性测定(％)未调pH值176.7140180166.7160166.7调pH值196.7176.7160l卯190l卯起泡稳定性测定(％)未调pH值37.733.324.142化744调pH值67.869.864.647.470.266.710其乳化稳定性的测定方法是将上述装有反应后样品的量筒置于8(TC水浴中，加热30min后，冷却至室温，再静置l小时后，测出此时的乳化层高度，则乳化稳定性为現備纖《30=<-^:XI:節起泡性及泡沬稳定性的测试方法是取30mL的样品2份，一份调解pH值到7左右，一份不调pH值，在DS-1高速组织捣碎机中均质(6000r/min)1min，记下均质停止时泡沫体积，则起泡性为均质停止时泡沫体积起泡性U)二-x10030均质停止30min后，记下此时泡沫体积，则泡沫稳定性为30mir^泡沫体积泡沫稳定性(％)二-"-X100均质停止时泡沫体积从表四《pH值及过氧化物的用量比对蛋白质基表面活性——(乳化性、起泡性)的影响一览表》中发现，调pH值后，可以增加样品的乳化性，但对乳化稳定性的影响不大，调pH值可以增加样品的起泡性和起泡稳定性；从表五《pH值及过氧化物反应时间长短对蛋白质基表面活性——(乳化性、起泡性)的影响一览表》中发现，随着反应时间的增长，调pH值对增加样品的乳化性和乳化稳定性的影响不大，但调pH值可以增加样品的起泡性和起泡稳定性。对于用本发明上述实施例一、实施例二制得的蛋白质基表面活性剂，还要根据使用性能和目的的不同，对打开二硫键后得到蛋白质进行进一步的化学修饰，即通过化学修饰的手段在打开二硫键的蛋白质侧链中引进极性基团——如-COCT，-SO"-S03H，-N(CH3)+，-OH等，或引进非极性基团，如烷基，苯基等，进一步改善或提高肽段的表面活性性能。也可以通过乙酰化、琥珀酰化、脂酰化、磷酸化等化学修饰显著改变蛋白质的表面张力、乳化、起泡、消泡、洗涤、去污、浸润等表面活性性能。作为本发明实施例的一种变换，所述的纯化工序也可以不用将加入终止剂的混合液在405(TC的水浴中减压蒸馏的方式，而是采用碱中和方法来除去混合物中多余的氧、中和多余的甲酸或过氧甲酸。作为本发明实施例的一种变换，也可以不进行进一步的化学修饰。作为本发明实施例的一种变换，所述制作水溶性蛋白质溶液的方法不仅仅限于实施例一所述方法，也可以用其他方法制备，例如沉淀法，酶水解法等，本发明方法中，水溶性蛋白质溶液的蛋白质含量一般控制在0.01g/mL0.02mg/mL。本发明实施例各实施例中，终止剂除采用乙醇外，还可以采用氢溴酸，但氢溴酸有毒性，应慎用，其用量按体积比计算为终止剂混合物=0.0050.013:1。作为本发明实施例的一种变换，用来打开蛋白质二硫键的过氧化物除过氧甲酸外，还可以用过氧乙酸、过氧丙酸、过氧化氢、过氧化钠等过氧化物，过氧化物一般以水溶液形式添加，其浓度为0.5mol/L1.5mol/L，过氧化物一般在使用时临时制作，其制作方法为公知技术，此处不再赘述。作为本发明实施例的一种变换，所述的蛋白质原料除用大豆蛋白外，还可以是其他动植物蛋白，例如牲畜蛋白、血蛋白、乳蛋白、蚕蛹蛋白、蚕丝蛋白、花生蛋白、大米蛋白、小麦蛋白和玉米蛋白之中的一种。1权利要求1.一种通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂的方法，所述的蛋白质基表面活性剂是具有乳化、起泡、消泡、洗涤、去污和浸润等功能的蛋白质基表面活性剂，其特征在于该方法是用过氧化物氧化蛋白质中的二硫键，使二硫键转化成磺酸基，打开蛋白质的折叠盘绕结构，使它的表面活性性能表现出来，从而制备出蛋白质基表面活性剂。2.根据权利要求1所述的通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂的方法，其特征在于该方法的具体步骤包括A、制备水溶性蛋白质溶液并测定其二硫键的含量；B、打开蛋白质二硫键将过氧化物溶液加入到水溶性蛋白质溶液中，加入量按体积比计算为过氧化物溶液水溶性蛋白质溶液=0.0050.03:1，所得的混合物置于零下15匸零下5"C的冰盐浴中，在黑暗中反应15小时，再在混合物中加入终止剂终止反应；C、纯化去除混合物中多余的氧和过氧化物；D、测定纯化后的蛋白质基表面活性剂中二硫键的含量。3.根据权利要求2所述的通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂的方法，其特征在于所述的C、纯化工序是将加入了终止剂的混合液在405(TC的水浴中减压蒸馏，待溶剂蒸干后加入适量水再蒸干，如此重复蒸干23次水后即得蛋白质基表面活性剂。4.根据权利要求2所述的通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂的方法，其特征在于所述的C、纯化工序是采用碱中和方法去除混合物中多余的氧、中和多余的甲酸或过氧甲酸。5.根据权利要求2、3或4所述的通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂的方法，其特征在于该方法还包括步骤El、蛋白质基表面活性剂的化学修饰即通过化学修饰的手段或是在打开二硫键的蛋白质侧链中引进极性基团如-COCT、-SCV、-S03H、^(013)+或-0^1,或是在打开二硫键的蛋白质侧链中引进非极性基团烷基或苯基，进一步改善或提高肽段的表面活性性6.根据权利要求2、3或4所述的通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂的方法，其特征在于该方法还包括步骤E2、蛋白质基表面活性剂的化学修饰，g卩通过乙酰化、琥珀酰化、脂酰化或磷酸化进一步改变蛋白质的表面活性性能，所述的表面活性性能是指表面张力、乳化、起泡、消泡、洗涤、去污和浸润性能。7.根据权利要求2、3或4所述的通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂的方法，其特征在于所述的水溶性蛋白质溶液的制备方法是将原料放入容器中，加入原料重量515倍的蒸馏水，在速度为5070次/分钟，温度为20±2"的摇床里摇动搅拌5070分钟后进行离心分离，离心速度为40004500转/分钟，分离后取出上清液水溶性蛋白质溶液，残渣按上述方法再加入蒸馏水，依次进行摇动搅拌、离心分离，如此重复23次，将每次制得的上清液混合用蒸馏水配制成水溶性蛋白质溶液，水溶性蛋白质溶液中蛋白质含量为0.01g/mL0.02g/mL。8.根据权利要求2、3或4所述的通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂的方法，其特征在于所述的水溶性蛋白质溶液的制备方法是公知的沉淀法或酶水解法，水溶性蛋白质溶液中蛋白质含量为0.01g/mL0.02g/mL。9.根据权利要求l、2、3或4所述的通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂的方法，其特征在于所述的过氧化物包括过氧甲酸、过氧乙酸、过氧丙酸、过氧化氢或过氧化钠之中的一种，其浓度为0.5mol/L1.5mol/Lo10.根据权利要求2、3或4所述的通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂的方法，其特征在于所述的终止剂是乙醇，终止剂用量按体积比计算为终止剂混合物=0.0050.013:1。11.根据权利要求l、2、3或4所述的通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂的方法，其特征在于所述的蛋白质是动、植物蛋白，包括牲畜蛋白、血蛋白、乳蛋白、蚕蛹蛋白、蚕丝蛋白、大豆蛋白、花生蛋白、大米蛋白、小麦蛋白或玉米蛋白。全文摘要一种通过打开蛋白质二硫键制备蛋白质基表面活性剂的方法，是用过氧化物氧化蛋白质中的二硫键，使二硫键转化成磺酸基，打开蛋白质的折叠盘绕结构，使它的表面活性性能表现出来，从而制备出具有乳化、起泡、消泡、洗涤、去污和浸润等功能的蛋白质基表面活性剂；通过在打开二硫键的蛋白质侧链中引进极性基团或是非极性基团可进一步改善或提高肽段的表面活性性能；通过对其乙酰化、琥珀酰化、脂酰化或磷酸化处理可进一步改变蛋白质的表面张力、乳化、起泡、消泡、洗涤、去污和浸润性能等表面活性性能。该方法最大限度地保护了蛋白质的极性和非极性基团免受破坏，保持了蛋白质分子结构的完整性、性能的天然性，使蛋白质变为纯天然、高性能的表面活性剂。文档编号B01F17/30GK101590382SQ200810166640公开日2009年12月2日申请日期2008年10月9日优先权日2008年5月29日发明者李丽娜,李军生,程海涛,阎柳娟申请人:广西工学院