PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器及其制备方法和应用，特点是玻碳电极表面采用石墨烯、青霉素G和nafion共同修饰，其制备方法包括裸电极的抛光与清洗及活化步骤；将石墨烯、青霉素G依次滴加于玻碳电极表面，混匀，置于37℃吹干再滴入nafion，自然晾干表面后，浸于5wt%牛血清蛋白中，置于烘箱37℃，30min，取出用PBS溶液冲洗后，得到表面修饰石墨烯-青霉素G-nafion的玻碳电极作为工作电极，将工作电极置于上述体系溶液，DPV法检测，根据标准曲线确定待测样品中β-内酰胺类抗生素的浓度，优点是具有灵敏度高、检测速度快、检测限低且高效、廉价。
【专利说明】PBP-1A亲和型P -内酰胺类抗生素电化学生物传感器及其 制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品安全检测领域，尤其是涉及一种用于检测乳品中抗生素残留的 PBP-IA亲和型￠-内酰胺类抗生素电化学生物传感器及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 我国是抗生素药物使用大国，对抗菌药物的应用也十分广泛。但是，近年来随着经 济利益的驱使和科学知识的不足，抗菌药物从广泛使用演变成过量使用甚至滥用，严重威 胁着人类健康。合理使用抗菌药物、加强抗菌药物的监督管理正逐渐被全社会所关注。青 霉素是兽药中最常使用的抗生素之一，主要用于预防和治疗奶牛的乳腺炎，治疗尿道、胃肠 道和呼吸道感染等。研究已经证实，牛奶中的抗生素十分稳定，消毒杀菌并不能使其分解。 我国最新发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》规定，牛、羊奶中青霉素的残留量不得 超过4 Iig / kg (ppb)。2001年10月，农业部发布实施的《无公害食品生鲜牛乳》行业标准， 对新鲜牛乳的卫生指标明确规定了 "抗生素不得检出"。但由于检测方法和条件的限制，对 上述标准未能严格执行，致使我国畜产品中青霉素残留问题一直未能得以解决，这就在客 观上要求改进传统的检测方法，引进先进的检测仪器，寻求一种快速精确的检测方法，使得 检测结果更加准确可靠。
[0003] 常规抗生素检测技术种类很多，以技术原理分类大致可分为微生物检测方法、化 学测定法、免疫学测定法。但是，兽药残留分析是复杂混合物中微量或痕量组分的分析技 术，既需要精细的微量操作手段，又需要高灵敏的痕量检测技术，难度大、仪器化程度和分 析成本高，分析质量控制和分析策略都有特殊要求。近年来，涌现出了许多新的技术平台来 完善现有检测方法的不足，生物传感器技术就是其中之一。生物传感器是以固定化的生物 成分或生物体本身为敏感材料，与适当的化学换能器相结合，用于快速检测物理、化学、生 物量的新型器件。生物传感器与常规的化学及生物化学分析方法相比具有良好的敏感性、 准确性和特异性，易操作、价格便宜、方便、省时，精度高、便于利用计算机收集和处理数据 以及不会或很少损伤样品和造成污染，易于批量生产等优点，是一种新型的检测技术。
[0004] 近20年来碳纳米材料一直是科技创新的前沿领域，2004年，英国科学家发现了由 碳原子以sp2杂化连接的单原子层构成的新型二维原子晶体-石墨烯（Graphene)。石墨 烯及其复合材料还是一种理想的酶固定化材料。石墨烯具有较大的比表面积，可以提高酶 的负载量，从而改善传感器的灵敏度。石墨烯氧化物及复合材料表面带有较多的功能基团， 如羟基（-0H)、羧基（-C00H)、羰基（C=0)、环氧基（>0)等，表面活性较高。这类有效官能团的 特异性选择性加上石墨烯特有的大的比表面积可以很大程度地提高生物识别分子在电极 上的固定效率和灵敏度。纳米尺寸的功能材料能够在单位面积上固定大量的生物分子(如 酶、DNA、抗原/抗体等)，并形成高效的生物传感器或生物质催化剂。因此，将石墨烯功能 材料应用到化学修饰电极、传感器和生物【技术领域】必将为生物传感器的发展带来更大的进 步。目前石墨烯及其复合材料已经成为备受关注的电化学活性材料，其电化学催化、传感的 相关研究也必将在电化学科学开辟出一片新的领域。
[0005] 2012年，Babington在《分析与生物分析化学》发表《青霉素检测的生物分析方法 现状》一文，明确指出由于青霉素种类繁多，制备青霉素免疫传感器的关键技术难题在于难 以获得具有高灵敏度的青霉素抗体，包括ELISA的检测效率也大受影响。而用受体型蛋白 代替青霉素抗体，不仅可以广泛识别带有￠-内酰胺结构的抗生素，而且有类似抗原抗体 反应的特异性结合特征，Babington指出，选择PBPs研发类免疫反应的生物传感器是检测 3 -内酰胺类抗生素的最佳途径。而PBP的应用第一次出现在1999年，Setford等开发出 一种非生物型免疫传感器，将青霉素结合蛋白（PBPs)修饰在碳糊电极上，由于PBPs既可与 青霉素结合，又能与葡萄糖氧化酶结合，制成了电流型青霉素传感器，间接测定青霉素。近 年来，也有报道陆续出现，例如Zhang等在《Analytical Biochemistry》发表《肺炎链球菌 PBP-3与其在检测乳中￠-内酰胺类抗生素的应用》，他们利用标记辣根过氧化物酶（HRP) 的氨苄青霉素和样品中的0 -内酰胺类抗生素竞争PBP-3, ELISA法检测27种P -内酰胺 类抗生素，包含11种青霉素和16中头孢菌素。Gamella等在《Analyst》发表《PBP亲和 型@ -内酰胺类抗生素电流磁性传感器》利用丝网印刷碳电极（SPCE)，并在表面修饰带有 HIS6标签的亚甲基蓝，再固定PBP-2X，利用标记HRP青霉素 G和样品中的￠-内酰胺类抗 生素竞争PBP-2X，在含有对苯二酚的PBS (pH 6.0)中进行电化学检测，对青霉素类和头孢 菌素类抗生素均有效。
[0006] 但是，目前国内外还没有公开任何关于将石墨烯、PBP、电化学分析方法结合到一 起制备出PBP-IA亲和型￠-内酰胺类抗生素电化学生物传感器的相关研究报道。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种具有灵敏度高、检测速度快、检测限低且 高效、廉价的PBP-IA亲和型￠-内酰胺类抗生素电化学生物传感器及其制备方法和应用 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为： 1、一种PBP-IA亲和型P -内酰胺类抗生素电化学生物传感器，玻碳电极为工作电极， 所述的工作电极表面采用纳米材料石墨烯、识别元件青霉素 G和粘合剂nafion共同修饰表 面，作为检测载体。
[0008] 所述的PBP-IA为肺炎链球菌来源的青霉素结合蛋白-1A。
[0009] 2、一种BP-IA亲和型P -内酰胺类抗生素电化学生物传感器的制备方法，具体包 括如下步骤： (1) 裸电极的抛光与清洗：将玻碳电极依次用粒径为Iu m、0.3 iim、0.05 iim的Al2O3粉末打磨成镜面，再依次用无水乙醇、去离子水分别超声清洗5min ;再用循环伏安法检测 峰电压差小于SOmV后，用pH为7. 4的PBS溶液冲净电极表面，吹干； (2) 裸电极的活化：然后将步骤（1)得到的玻碳电极置于lmol/L硫酸溶液中，循环伏安 法扫描10圈至电压稳定； (3) 裸电极的修饰：将4 ii L 2. 5mg/mL的纳米材料石墨烯、2 ii L 0. 2g/L的识别原件 青霉素 G依次滴加于步骤（2)得到的玻碳电极表面，混匀，置于37°C烘箱内吹干表面，再滴 入L体积比5%的粘合剂nafion，自然晾干表面后，浸于5wt%牛血清蛋白中，置于烘箱 37°C，30min，取出用pH为7.4的PBS溶液冲洗后，得到表面修饰石墨烯-青霉素 G-nafion 的玻碳电极作为工作电极，采用钼电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极构成三电 极体系的PBP-IA亲和型P -内酰胺类抗生素电化学生物传感器。
[0010] 所述的PBP-IA为肺炎链球菌来源的青霉素结合蛋白-1A。
[0011] 所述的青霉素结合蛋白-IA于的制备方法具体如下： (1) 肺炎链球菌（ATCC 49619)的培养与基因组的提取 将肺炎链球菌于脑心浸液肉汤（BHI)固体培养基，CO2环境，36°C培养后，将单菌落接 种于营养肉汤（LB)液体培养基中，振荡培养过夜；菌液基因组的提取，采用上海生工试剂 盒（SK 8255)提取，TE缓冲液溶解后于-20°C保存，备用； (2) 表达质粒的构建 PCR扩增体系为50iiL，包括：10X如7 plus I DNA聚合酶缓冲液5iiL，10iimol/L (^?1111，1〇11111〇1/15'端引物与1〇11111〇1/13'端引物各0.5111，仙/111七&9〇嫩聚合酶 〇. 5 ii L，模板基因组2 ii L，加水补充总体积为50 ii L ;PCR反应条件为94°C变性lmin，60°C 退火45s，72°C延伸45s，30个循环后72°C保温IOmin。PCR产物回收后，首先克隆进pGEM-T 克隆载体，再进一步克隆进PGEX-6P-1表达载体； (3) PBP-IA的表达 将测序正确的重组质粒转化到表达菌株BL21 (DE3)中，挑取单克隆，接种到5mL的氨 苄霉素终浓度100 U g/mL的LB培养基中，37°C，220rpm/min过夜培养；将过夜培养的菌液 作为种子液，按1%体积比接种到氨苄霉素终浓度1〇〇 U g/mL的LB培养基中，37°C，220rpm/ min扩大培养至培养物0D_在0. 6~0. 8之间时，加入终浓度为0. 2mmol/L的IPTG诱导蛋白 表达，15°C，过夜，6000g，4°C，离心5min收集菌体； (4) PBP-IA的纯化与GST标签的去除 将步骤（3)得到的菌体用结合缓冲液重悬、破碎、离心取上清液，过0.45 滤膜备用； 用10倍柱体积的结合缓冲液清洗平衡谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和柱，流速60mL/h ;将上 清液上柱，流速为45mL/h，收集穿透液；10倍柱床体积的结合缓冲液清洗柱子，流速60mL/ h ;将穿透液上柱，洗脱缓冲液洗脱，流速45mL/h，收集洗脱液，加到透析袋中放入PBS溶液 中透析过夜除去GSH ;将透析后的蛋白溶液收集后加入带有HIS6标签的凝集酶4°C反应过 夜，反应混合物先过分子筛，将切下的GST标签去除掉；凝集酶和不含标签的目的蛋白过Ni 亲和层析柱，收集流出液，聚乙二醇2000包埋浓缩，得到最终产物PBP-1A，保存于-20°C体 积分数10%甘油溶液中。
[0012] 所述的结合缓冲液的成分如下：50mmol/L Tris，300mmol/L NaCl，2mmol/L二硫苏 糖醇（DIT)，0. 2% Triton-100, pH=8. 0 ; 所述的洗脱缓冲液的成分如下：10mM Tris-HCl，lmM EDTA，PH=8. 0。
[0013] 所述的 5' 端引物为：ATGAACAAACCAACGATTCTGCG ; 所述的 3' 端引物为：TTATGGITGTGCTGGITGAGG。
[0014] 3、一种应用所述的PBP-IA亲和型P -内酰胺类抗生素电化学生物传感器检测样 品中@ -内酰胺类抗生素浓度的方法，包括以下步骤：将10 U L PBP-IA溶液、5 ii L样品溶 液和35 ii L pH为7. 4的PBS溶液加入离心管中形成50 ii L体系溶液，将石墨烯-青霉素 G-nafion玻碳电极置于上述体系溶液，37°C孵育25min，取出用pH为7. 4的PBS溶液冲洗 后作为工作电极，采用钼电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极构成三电极体系的 PBP-IA亲和型￠-内酰胺类抗生素电化学生物传感器，DPV法检测，记录数据，根据相应电 流值与￠-内酰胺类抗生素浓度的定量关系，确定待测样品中￠-内酰胺类抗生素的浓度。 [0015] 所述的PBP-IA的纯度为彡95%，PBP-IA溶液的浓度为I. 18mg/mL。
[0016] 所述的DPV法检测的电化学检测溶液为含0. 2mM的K3Fe (CN) 6的pH为7. 4的PBS 溶液。
[0017] 原理：PBP-IA亲和型e -内酰胺类抗生素电化学生物传感器，用电化学分析仪进 行三电极体系差分伏安脉冲法（DPV法)检测，将传感器表面的电流变化传输到电脑，其利用 石墨烯-青霉素 G-nafion玻碳电极识别与青霉素 G有亲和性的游离PBP-IA ;玻碳电极中的 青霉素 G与待测液中的P -内酰胺类抗生素竞争结合游离PBP-1A，游离PBP-IA与待测液中 的@ -内酰胺类抗生素结合后无法再与玻碳电极中的青霉素 G的结合，从而导致玻碳电极 表面电流变化；电脑所得数据可获得标准曲线和线性方程，间接测定3 -内酰胺类抗生素 的浓度，如图1和图2所示。
[0018] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明PBP-IA亲和型￠-内酰胺类抗生 素电化学生物传感器及其制备方法和应用，其利用PBP-IA与石墨烯-青霉素 G-nafion玻 碳电极中的青霉素 G和样品中的P -内酰胺类抗生素具有竞争性亲和性，实现对样品中的 3 -内酰胺类抗生素进行检测。本发明PBP-IA亲和型P -内酰胺类抗生素电化学生物传感 器创新性地将石墨烯、PBP、电化学分析方法结合到一起，并利用纳米材料石墨烯的优良性 能和￠-内酰胺类抗生素能与PBP-IA特异性结合的特性，达到提高分析灵敏度、降低检测 限的目的，本发明具有快捷、廉价、准确、低检测限等多种优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为PBP-IA亲和型P -内酰胺类抗生素电化学生物传感器的检测原理图； 图2为PBP-IA亲和型P -内酰胺类抗生素电化学生物传感器的制备及应用于检测的 流程图； 图3为表面修饰石墨烯-青霉素 G-nafion的玻碳电极在青霉素浓度为（a) 0 ng/mL， (b)I ng/mL, (c)10 ng/mL, (d)100 ng/mL, (e)500 ng/mL, (f) 1000 ng/mL, (g) 1500 ng/mL, (h)2000 ng/mL溶液中孵育的DPV曲线图； 图4为不同浓度青霉素的DPV法峰电流的标准曲线。
【具体实施方式】
[0020] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0021] 具体实施例一 一种PBP-IA亲和型P -内酰胺类抗生素电化学生物传感器，玻碳电极为工作电极，该 工作电极表面采用纳米材料石墨烯、识别元件青霉素 G和粘合剂nafion共同修饰表面，作为 检测载体，上述PBP-IA为肺炎链球菌来源的青霉素结合蛋白-1A。
[0022] 具体实施例二 上述实施例一的PBP-IA亲和型P -内酰胺类抗生素电化学生物传感器的制备方法，实 验材料为玻碳电极、Al2O3粉末、麂皮及玻璃板、铁架台、电化学分析仪均购自上海辰华仪器 有限公司，无水乙醇、Na2HP04、NaH2PO4等均为上海国药分析纯。去离子水来自实验室制备。 具体包括如下步骤： (1) 裸电极的抛光与清洗：将玻碳电极依次用粒径为1^111、0.311111、0.0511111的41203粉末打磨成镜面，再依次用无水乙醇、去离子水分别超声清洗5min ;再用循环伏安法检测 峰电压差小于SOmV后，用pH为7. 4的PBS溶液冲净电极表面，吹干； (2) 裸电极的活化：然后将步骤（1)得到的玻碳电极置于lmol/L硫酸溶液中，循环伏安 法扫描10圈至电压稳定； (3) 裸电极的修饰：将4 ii L 2. 5mg/mL的纳米材料石墨烯、2 ii L 0. 2g/L的识别原件 青霉素 G依次滴加于步骤（2)得到的玻碳电极表面，混匀，置于37°C烘箱内吹干表面，再滴 入211]^体积比5%的粘合剂仙1:丨〇11(似1:丨〇1#是聚四氟乙烯（16；1^1〇1#)和全氟-3,6-二环 氧-4-甲基-7-癸烯-硫酸的共聚物，sigma购买，没有准确的中文名，中文参考文献中也 都以英文出现)，自然晾干表面后，浸于5wt%牛血清蛋白中，置于烘箱37°C，30min，取出用 pH为7. 4的PBS溶液冲洗后，得到表面修饰石墨烯-青霉素 G-nafion的玻碳电极作为工作 电极，采用钼电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极构成三电极体系的PBP-IA亲和 型￠-内酰胺类抗生素电化学生物传感器。
[0023] 上述PBP-IA为肺炎链球菌来源的青霉素结合蛋白-1A，该青霉素结合蛋白-IA于 的制备方法具体如下： (1) 肺炎链球菌（ATCC 49619)的培养与基因组的提取 将肺炎链球菌于脑心浸液肉汤（BHI)固体培养基，CO2环境，36°C培养后，将单菌落接种 于营养肉汤（LB)液体培养基中，振荡培养过夜；菌液基因组的提取，采用上海生工试剂盒 (SK 8255)提取，TE缓冲液溶解后于-20°C保存，备用； (2) 表达质粒的构建：PCR扩增体系为50 iiL，包括plus I DNA聚合酶缓冲液 5iiL，dNTP (10iimol/L)liiL，5' 端引物（lOiimol/L)与 3' 端引物（lOiimol/L)各 0. 5iiL， taqDNA聚合酶（4U/ ii L) 0. 5 ii L，模板基因组2 ii L，加水补充总体积为50 ii L。PCR反应条 件为94°C变性lmin，60°C退火45s，72°C延伸45s，30个循环后72°C保温10min。PCR产物 回收后，首先克隆进PGEM-T克隆载体，再进一步克隆进pGEX-6P-l表达载体； 所述的 5' 端引物为：ATGAACAAACCAACGATTCTGCG ; 所述的 3' 端引物为：TTATGGITGTGCTGGITGAGG ; (3) PBP-IA的表达：将测序正确的重组质粒转化到表达菌株BL21 (DE3)中，挑取单克 隆，接种到5mL的氨苄霉素终浓度100 ii g/mL的LB培养基中，37°C，220rpm/min过夜培养； 将过夜培养的菌液作为种子液，按1%体积比接种到氨苄霉素终浓度100 U g/mL的LB培养 基中，37°C，220rpm/min扩大培养至培养物OD6tltl在0. 6~0. 8之间时，加入终浓度为0. 2mmol/ L的IPTG诱导蛋白表达，15°C，过夜，6000g，4°C，离心5min收集菌体； (4) PBP-1A的纯化与GST标签的去除：将步骤（3)得到的菌体用结合缓冲液重悬、破碎、 离心取上清液，过0. 45 y m滤膜备用；用10倍柱体积的结合缓冲液清洗平衡谷胱甘肽琼脂 糖凝胶4B亲和柱，流速60mL/h ;将上清液上柱，流速为45mL/h，收集穿透液；10倍柱床体积 的结合缓冲液清洗柱子，流速60mL/h ;将穿透液上柱，洗脱缓冲液洗脱，流速45mL/h，收集 洗脱液，加到透析袋中放入PBS溶液中透析过夜除去GSH ;将透析后的蛋白溶液收集后加入 带有HIS6标签的凝集酶4°C反应过夜，反应混合物先过分子筛，将切下的GST标签去除掉； 凝集酶和不含标签的目的蛋白过Ni亲和层析柱，收集流出液，聚乙二醇2000包埋浓缩，得 到最终产物PBP-1A，保存于-20°C体积分数10%甘油溶液中。其中结合缓冲液的成分如下： 50mmol/L Tris, 300mmol/L NaCl，2mmol/L二硫苏糖醇（DTT)，0? 2% Triton-100，pH=8. 0 ;洗 脱缓冲液的成分如下：10mM Tris-HCl，ImM EDTA，PH=8. 0。
[0024] 具体实施例三 PBP-IA亲和型P -内酰胺类抗生素电化学生物传感器对P -内酰胺类抗生素的灵敏度 及线性范围，具体步骤如下： (1) 裸电极的抛光与清洗：将玻碳电极依次用粒径为1^111、0.311111、0.0511111的41203粉末打磨成镜面，再依次用无水乙醇、去离子水分别进行超声清洗5min (超声清洗机，昆山 舒美KQ3200E);用电化学分析仪(上海辰华CHI852c)进行循环伏安法（CV法）检测峰电压 差<80mV后，用PBS缓冲液（pH=7. 4)冲净电极表面，用N2吹干； (2) 裸电极的活化：将步骤（1)得到的玻碳电极于lmol/L硫酸溶液中，CV法扫描10圈 至稳定； (3) 裸电极的修饰：将4 ii L 2. 5mg/mL的纳米材料石墨烯、2 ii L 0. 2g/L的识别原件 青霉素 G依次滴加于步骤（2)得到的玻碳电极表面，混匀，置于37°C烘箱内吹干表面，再滴 入2yL体积比5%的粘合剂nafion，自然晾干表面后，浸于5wt%牛血清蛋白中，置于烘箱 37°C，30min，取出用pH为7. 4的PBS溶液冲洗后，微分脉冲伏安法（DPV法)检测，电压扫描 范围为-0. 2V?I. 8V，记录峰电流； (4) 标准品的检测：选定标准品青霉素 G的不同梯度的终浓度（ng/mL)为2000、1500、 1000、500、100、50、10、1和空白对照，配制标准品母液，浓度（ii g/mL)分别为25、2. 5、0. 25、 0. 025。在9个2mL离心管中分别加入10 ii L PBP-IA溶液（PBP-IA的制备方法见上述具体实 施例2)、不同体积不同浓度的标准母液到达目标终浓度，最后补足PBS (pH=7. 4)溶液形成 50 ii L体系，将修饰电极分别从高浓度至低浓度置于上述溶液，37°C烘箱内孵育25min。取 出用PBS(pH=7. 4)溶液冲洗后，DPV法检测，分别记录峰电流，如图3所示。根据各梯度峰电 流与空白对照峰电流的差值绘制标准曲线，得到线性方程y=〇. 0006x+0. 0309, R2=O. 9909， 线性范围为I ng/mL?2000 ng/mL，如图4,其中X为待测样品中P -内酰胺类抗生素，y为 相应电流大小）； (5) 最低检出限的检测：同（4)，不同在于选定标准品青霉素 G的不同梯度的终浓度 (ng/mL)为0? 5、0. 4、0. 3、0. 2、0. 1和空白对照，得出最低检出限为0? 3 ng/mL。
[0025] 具体实施例四 应用PBP-IA亲和型P -内酰胺类抗生素电化学生物传感器检测全脂和脱脂牛乳中 3-内酰胺类抗生素的浓度。
[0026] 取市售的1种全脂牛奶和1种脱脂牛奶样品，每种牛奶样品取IOmL于15mL离心 管，每只离心管加入3g硫酸铵，充分混匀出现沉淀后，9000g，4°C，离心10 min。分别取上清 液，每种牛奶样品的上清液分装到8个I. 5mL离心管中，每只离心管lmL，分别加入100 ii L 、50iiL UOiiL和OiiL 0. 2g/L青霉素 G，平行一组，配制成含不同浓度青霉素 G的样品溶 液。
[0027] 同实施例2中的步骤（1) (2) (3)，然后在2mL离心管中加入IOiiL PBP-IA溶液、 5 y L样品溶液和35 PBS(pH=7. 4)溶液形成50 ii L体系，将石墨烯-青霉素 G-nafion玻碳电 极置于上述溶液，37°C孵育25min;10iiL PBP-IA溶液和40 PBS (pH=7. 4)溶液形成50iiL 体系作空白对照。取出用PBS (pH=7. 4)溶液冲洗后，DPV法检测，记录峰电流，由样品峰电 流与空白对照峰电流的差值，根据线性方程得出样品中￠-内酰胺类抗生素的浓度。
【权利要求】
1. 一种PBP-1A亲和型0 -内酰胺类抗生素电化学生物传感器，玻碳电极为工作电极， 其特征在于：所述的工作电极采用纳米材料石墨烯、识别元件青霉素G和粘合剂nafion共同 修饰表面，作为检测载体。
2. 根据权利要求1所述的PBP-1A亲和型￠-内酰胺类抗生素电化学生物传感器，其特 征在于：所述的PBP-1A为肺炎链球菌来源的青霉素结合蛋白-1A。
3. -种根据权利要求1所述的PBP-1A亲和型0 -内酰胺类抗生素电化学生物传感器 的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤： (1) 裸电极的抛光与清洗：将玻碳电极依次用粒径为1^111、0.311111、0.0511111的41203粉末打磨成镜面，再依次用无水乙醇、去离子水分别超声清洗5min ;再用循环伏安法检测 峰电压差小于80mV后，用pH为7. 4的PBS溶液冲净电极表面，吹干； (2) 裸电极的活化：然后将步骤（1)得到的玻碳电极置于lmol/L硫酸溶液中，循环伏安 法扫描10圈至电压稳定； (3) 裸电极的修饰：将4 y L 2. 5mg/mL的纳米材料石墨烯、2 y L 0. 2g/L的识别原件 青霉素G依次滴加于步骤（2)得到的玻碳电极表面，混匀，置于37°C烘箱内吹干表面，再滴 入2yL体积比5%的粘合剂nafion，自然晾干表面后，浸于5wt%牛血清蛋白中，置于烘箱 37°C，30min，取出用pH为7.4的PBS溶液冲洗后，得到表面修饰石墨烯-青霉素G-nafion 的玻碳电极作为工作电极，采用钼电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极构成三电 极体系的PBP-1A亲和型0 -内酰胺类抗生素电化学生物传感器。
4. 根据权利要求3所述的PBP-1A亲和型0 -内酰胺类抗生素电化学生物传感器的制 备方法，其特征在于：所述的PBP-1A为肺炎链球菌来源的青霉素结合蛋白-1A。
5. 根据权利要求4所述的PBP-1A亲和型￠-内酰胺类抗生素电化学生物传感器的制 备方法，其特征在于所述的青霉素结合蛋白-1A于的制备方法具体如下： (1) 肺炎链球菌的培养与基因组的提取 将肺炎链球菌于脑心浸液肉汤固体培养基，C02环境，36°C培养后，将单菌落接种于营 养肉汤液体培养基中，振荡培养过夜；菌液基因组的提取，采用上海生工试剂盒提取，TE缓 冲液溶解后于_20°C保存，备用； (2) 表达质粒的构建 PCR扩增体系为50iiL，包括：10X如7 plus I DNA聚合酶缓冲液5iiL，10iimol/L (^?1111，1〇11111〇1/15'端引物与1〇11111〇1/13'端引物各0.5111，仙/111七&9〇嫩聚合酶 〇. 5 ii L，模板基因组2 ii L，加水补充总体积为50 ii L ;PCR反应条件为94°C变性lmin，60°C 退火45s，72°C延伸45s，30个循环后72°C保温lOmin ;PCR产物回收后，首先克隆进pGEM-T 克隆载体，再进一步克隆进PGEX-6P-1表达载体； (3) PBP-1A的表达 将测序正确的重组质粒转化到表达菌株BL21 (DE3)中，挑取单克隆，接种到5mL的氨 苄霉素终浓度100 U g/mL的LB培养基中，37°C，220rpm/min过夜培养；将过夜培养的菌液 作为种子液，按1%体积比接种到氨苄霉素终浓度1〇〇 U g/mL的LB培养基中，37°C，220rpm/ min扩大培养至培养物0D_在0. 6~0. 8之间时，加入终浓度为0. 2mmol/L的IPTG诱导蛋白 表达，15°C，过夜，6000g，4°C，离心5min收集菌体； (4) PBP-1A的纯化与GST标签的去除 将步骤（3)得到的菌体用结合缓冲液重悬、破碎、离心取上清液，过0.45^ m滤膜备用； 用10倍柱体积的结合缓冲液清洗平衡谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和柱，流速60mL/h ;将上 清液上柱，流速为45mL/h，收集穿透液；10倍柱床体积的结合缓冲液清洗柱子，流速60mL/ h ;将穿透液上柱，洗脱缓冲液洗脱，流速45mL/h，收集洗脱液，加到透析袋中放入PBS溶液 中透析过夜除去GSH ;将透析后的蛋白溶液收集后加入带有HIS6标签的凝集酶4°C反应过 夜，反应混合物先过分子筛，将切下的GST标签去除掉；凝集酶和不含标签的目的蛋白过Ni 亲和层析柱，收集流出液，聚乙二醇2000包埋浓缩，得到最终产物PBP-1A，保存于-20°C体 积分数10%甘油溶液中。
6. 根据权利要求5所述的PBP-1A亲和型￠-内酰胺类抗生素电化学生物传感器的 制备方法，其特征在于所述的结合缓冲液的成分如下：50mmol/L Tris，300mmol/L NaCl， 2mmol/L二硫苏糖醇，0. 2% Triton-100, pH=8. 0 ;所述的洗脱缓冲液的成分如下：10mM Tris-HCl,ImM EDTA, PH=8. 0〇
7. 根据权利要求5所述的PBP-1A亲和型0 -内酰胺类抗生素电化学生物传感器的制 备方法，其特征在于所述的5'端引物为：ATGAACAAACCAACGATTCTGCG ;所述的3'端引物为： TTATGGTTGTGCTGGTTGAGG。
8. -种应用权利要求1-7中任一项所述的PBP-1A亲和型0 -内酰胺类抗生素电化 学生物传感器检测样品中￠-内酰胺类抗生素浓度的方法，其特征在于包括以下步骤：将 lOiiL PBP-1A溶液、5iiL样品溶液和35iiL pH为7. 4的PBS溶液加入离心管中形成50iiL 体系溶液，将石墨烯-青霉素G-nafion玻碳电极置于上述体系溶液，37°C孵育25min，取出 用pH为7. 4的PBS溶液冲洗后作为工作电极，采用钼电极作为对电极，饱和甘萊电极作为 参比电极构成三电极体系的PBP-1A亲和型0 -内酰胺类抗生素电化学生物传感器，DPV法 检测，记录数据，根据相应电流值与￠-内酰胺类抗生素浓度的定量关系，确定待测样品中 3-内酰胺类抗生素的浓度。
9. 根据权利要求8所述的应用PBP-1A亲和型￠-内酰胺类抗生素电化学生物传感器 检测样品中0 -内酰胺类抗生素浓度的方法，其特征在于：所述的PBP-1A的纯度为> 95%， PBP-1A溶液的浓度为1. 18mg/mL。
10. 根据权利要求8所述的PBP-1A亲和型￠-内酰胺类抗生素电化学生物传感器的应 用，其特征在于：所述的DPV法检测的电化学检测溶液为含0. 2mM的K3Fe (CN) 6的pH为7. 4 的PBS溶液。
【文档编号】G01N27/327GK104407031SQ201410615994
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】潘道东, 黄璐, 孙杨赢, 曾小群, 曹锦轩, 吴振, 李桦 申请人:宁波大学