刺玫果黄酮有效部位的薄层鉴别方法
【专利摘要】本发明公开了一种刺玫果黄酮有效部位的薄层鉴别方法，属于中药鉴别【技术领域】。本发明涉及一种中药材有效部位中的主要成分的薄层鉴别方法及最佳薄层鉴别条件。主要
【发明内容】
：取刺玫果黄酮有效部位的供试品溶液、芦丁、金丝桃苷或槲皮素对照品溶液，用微量注射器点样于层析硅胶(G)-薄板（铝箔片基）上，芦丁和金丝桃苷薄层鉴别采用醋酸乙酯-甲酸-水展开体系，槲皮素薄层鉴别采用苯-醋酸乙酯-甲酸展开体系展开，采用AlCl3乙醇溶液为显色剂，根据供试品溶液、对照品溶液出现斑点的位置与颜色定性地判断供试品溶液中所含主成分的种类，为刺玫果黄酮有效部位的质量控制提供了一种专属性较强、操作方便、简单的薄层鉴别方法。
【专利说明】刺玫果黄酮有效部位的薄层鉴别方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及刺玫果黄酮有效部位的薄层鉴别方法，属于中药鉴别【技术领域】。
【背景技术】
[0002]山刺玫(愈似davurica Pall.)为蔷薇科蔷薇属落叶灌木植物，其果实为刺玫果。现代医学研究发现，刺玫果具有抗衰老、抗疲劳、耐缺氧，增强人体免疫功能作用，长期服用能显著提高人体中SOD含量。刺玫果为药食同源的宝贵资源，富含有机酸，黄酮、香豆素、甾醇、三萜、烯烃、皂苷、挥发油、矿物质、微量元素等多种活性成分，其中的黄酮类化合物具有抗氧化、降低脂质过氧化反应、降低心肌耗氧量、防治血管硬化、降压、抗衰老、抗自由基和抗癌、防癌等作用。是一种不可多得的极具开发价值与潜力的绿色资源。
[0003]目前，许多研究人员已对刺玫果展开了基础研究，对其活性成分的提取、纯化工艺及生物活性进行了研究，钟方丽等对山玫片中刺玫果粗提物的薄层鉴别条件下进行了研究，比较了苯-醋酸乙酯-冰醋酸(5:2:0.1)及氯仿-甲醇-水(28:10:1)两个系统的展开效果，结果确定苯-醋酸乙酯-冰醋酸系统略好。郭淑华等人也开展了刺玫果成分鉴别及定量分析，但有关刺玫果粗提物的薄层鉴别研究并不深入。
[0004]有效部位是指当一味中药或复方中药提取物中的一类或几类化学成分的含量达到总提取物的50%以上，而且这一类或几类已知化学成分被认为是有效成分，该一类或几类成分的混合体即被认为是有效部位。与传统的中药制剂相比，有效部位中药的药物物质基础或药效基础基本得到明确，药效比传统中药有所提高，疗效确切，服用安全可靠，毒副作用低。目前，有效部位中药的研究与开发日渐得到人们的重视。
[0005]目前，钟方丽等已对刺玫果总黄酮的提取、纯化方法及医药用途进行了研究并申请了专利(专利名称:刺玫果总黄酮提取物及其提取方法和其医药用途，专利号:ZL201110091577.4)。为了在刺玫果有效部位综合利用与开发中，能够较好地控制其质量，对刺玫果黄酮有效部位的薄层鉴别方法进行了研究。薄层鉴别具有操作简便、迅速，专属性较强，目前未见有关薄层法鉴别刺玫果黄酮有效部位的研究报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的之一是提供一种简单、方便、快捷的刺玫果黄酮有效部位的薄层鉴别方法。
[0007]本发明的目的之二是提供可鉴别刺玫果黄酮有效部位中三种主成分的薄层鉴别方法。
[0008]本发明的目的之三是提供了可鉴别刺玫果黄酮有效部位中三种主成分的最佳条件。
[0009]刺玫果黄酮有效部位的薄层鉴别具体研究内容如下:
1.刺玫果黄酮有效部位供试品溶液的制备精密称取干燥至恒重的刺玫果黄酮有效部位浸膏适量于容量瓶中，加乙醇溶解，定容备用。
[0010]2.对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的芦丁、槲皮素、金丝桃苷对照品各适量，分别置于容量瓶中，用甲醇溶解定容，备用。
[0011]3.薄层板的制备
称取一定量硅胶G，加入蒸馏水适量，溶胀一段时间后，在研钵中研磨后，将其均匀铺在预先清洗干净并干燥的玻璃板上，自然晾干，使用前，置105°C活化30min-lh。
[0012]4.去除总黄酮的阴性对照液的制备
称取刺玫果黄酮有效部位提取物适量，用水溶解，得到的溶液过D-101树脂柱，流出液重复上柱，至流出液无黄酮反应(用盐酸镁粉法做颜色鉴别试验至不发生反应)，收集流出液，在水浴上挥干用适量60%乙醇溶解，即得除去总黄酮的阴性对照液，备用。
[0013]5.展开剂的配置
分别配置展开剂1:醋酸乙酯-甲酸-水(8:1:1);展开剂2:醋酸乙酯-甲酸-水(9:1:1);展开剂3:醋酸乙酯-甲酸-水(7:1:1);展开剂4:醋酸乙酯-甲酸-水(10:1:1)；展开剂5:醋酸乙酯-甲酸-水(12:1:1);展开剂6:醋酸乙酯-甲酸-水(20:1:1);展开剂7:甲醇-冰醋酸-水(4:1:5);展开剂8:苯-醋酸乙酯-甲酸(5:4:1);展开剂9:苯-醋酸乙酯-甲酸(6:4:1);展开剂10:氯仿-甲醇-水(28:10:1)，并对展开系统进行比较。
[0014]6.显色剂的配置
显色剂1: FeCl3溶液的配置:称取FeCl3.6H20适量，用蒸馏水溶解，并于容量瓶中定各，备用。
[0015]显色剂2 =AlCl3乙醇溶液的配置:称取无水AlCl3适量，缓慢少量多次溶于无水乙醇，并用无水乙醇于容量瓶中定容，备用。
[0016]7.薄层层析
(O点样点样前，将距板1_2_的吸附剂去掉，露出玻璃板，以防止边缘效应，两个边点距两板边缘为1.5cm，用微量注射器点样，样点直径为3-5_。
[0017](2)展开将点好样的薄层板放入已事先配置好并达到饱和的层析缸中，浸入展开剂的深度为距原点2-2.5mm，待展开剂在板上边缘至顶端为1-1.5cm时，将板取出，自然晾干。
[0018](3)显色将晾干的薄层板均匀喷洒上显色剂，至于105°C烘箱或用电吹风加热显色，显色后于暗箱式紫外分析仪(365nm)中观察并计算Rf值。
[0019]8.刺玫果黄酮有效部位薄层鉴别条件的优化
(O展开剂的选择刺玫果总黄酮提取物经过大孔树脂纯化后，其总黄酮含量> 50%,其主要成分分别为芦丁、金丝桃苷和槲皮素。金丝桃苷，又名槲皮素-3-0-/?-D-吡喃半乳糖苷。属于黄酮醇苷类化合物。苷元为槲皮素，糖基为吡喃半乳糖。芦丁，又称芸香苷，也属于黄酮醇苷类化合物，苷元为槲皮素，糖基为I分子葡萄糖和I分子鼠李糖，金丝桃苷和芦丁的极性相近，槲皮素与两者相比极性稍小，在展开剂选择时三者的分子结构和极性都对展开剂系统的选择产生较大的影响。对10种展开剂的展开效果进行了评价、选择与优化。如附图1、附图2、附图3。
(2)硅胶板的选择评价自制硅胶G板(玻璃片基)、自制硅胶H板(玻璃片基)、购置层析硅胶(G)--薄板(铝箔片基)、购置层析硅胶(G)-薄板(玻璃片基)的刺玫果黄酮有效部位薄层层析效果。如附图4、附图5。
[0020](3)显色剂的选择
分别用5%A1C13和9%FeCl3溶液显色剂显色，对比显色效果，确定最佳显色剂。
[0021](4)供试品薄层鉴别浓度的选择
分别对供试品原液浓度、原液稀释2倍、5倍、10倍进行薄层层析鉴别，确定较适宜的供试品薄层鉴别浓度。
[0022](5)点样体积的选择
分别用微量注射器吸取2 μ L、3 μ L、5 μ L供试品和对照品点样于硅胶板上，对比薄层层析效果，确定最佳点样体积。
[0023](6)确定最佳薄层层析条件
根据以上各因素的优化结果，确定刺玫叶果黄酮有效部位的最佳的薄层鉴别条件，如附图6、附图7。
[0024]【专利附图】
【附图说明】:
附图1是以醋酸乙酯-甲酸-水(8:1:1)为展开剂。
[0025]附图2是以甲醇-冰醋酸-水(4:1:5)为展开剂。
[0026]附图3是芦丁、金丝桃苷对照品在醋酸乙酯甲酸水8:1:1中展开，槲皮素对照品在苯-醋酸甲酸6:4:1中展开。
[0027]附图4是使用自制硅胶G板(玻璃片基)薄层层析效果。
[0028]附图5是使用市售层析硅胶(G)-薄板(铝箔片基)薄层层析效果。
[0029]附图6是最佳条件下薄层层析效果。
[0030]附图7是最佳条件下薄层层析效果。
[0031]本发明的有益效果是:
(O目前未见有关刺玫果黄酮有效部位的薄层鉴别方法，本发明提供了一种刺玫果黄酮有效部位的薄层鉴别方法，为其应用开发过程中的质量监控提供了简便快捷的方法；
(2)本发明提供了一种可鉴别刺玫果黄酮有效部位中三种主成分的薄层鉴别方法，使其薄层鉴别更准确、专一性更强；
(3)本发明提供了一种可鉴别刺玫果黄酮有效部位中三种主成分的最佳薄层鉴别条件。
[0032]
【具体实施方式】
实施例1
1.刺玫果黄酮有效部位供试品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的刺玫果浸膏0.1607g于25mL容量瓶中，加60%乙醇溶解，定容；将此溶液过滤，取续滤液5mL于1mL容量瓶中加60%乙醇定容；取续滤液2mL于1mL容量瓶中加60%乙醇定容，取续滤液ImL于1mL容量瓶中加60%乙醇，定容，备用。
[0033]2.对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的芦丁对照品5.02mg，槲皮素对照品5.0Omg，金丝桃苷对照品5.05mg,分别置于1mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，备用。
[0034]3.去除总黄酮的阴性对照液的制备称取刺玫果黄酮有效部位提取物适量，用水溶解，得到的溶液过D-1Ol树脂柱，流出液重复上柱，至流出液无黄酮反应(用盐酸镁粉法做颜色鉴别试验至不发生反应)，收集流出液，在水浴上挥干用适量60%乙醇溶解，即得除去总黄酮的阴性对照液，备用。
[0035]4.展开剂的配置
配置芦丁和金丝桃苷的最佳展开剂:醋酸乙酯-甲酸-水(8:1:1);配置槲皮素的最佳展开剂:苯-醋酸乙酯-甲酸(6:4:1)。
[0036]5.显色剂的配置
配置较佳显色剂AlCl3乙醇溶液:称取无水AlCl3 4.1705g，缓慢少量多次溶于无水乙醇，并用无水乙醇定容于10mL容量瓶中即得，备用。
[0037]6.薄层层析 (O点样
选用层析硅胶(G)-薄板(铝箔片基)，用微量注射器点样，样点直径为3-5mm，供试品溶液的点样量为5μ L ;金丝桃苷对照品溶液的点样量为3 μ L，芦丁对照品溶液的点样量为5μ L ;槲皮素对照品溶液的点样量为2μ L时，荧光效果明显且清晰。
[0038](2)展开
将点好样的薄层板放入已事先配置好并达到饱和的层析缸中，浸入展开剂的深度为距原点2-2.5_，待展开剂在板上边缘至顶端为1-1.5cm时，将板取出，自然晾干。
[0039](3)显色
将晾干的薄层板均匀喷洒上AlCl3乙醇溶液显色剂，至于105°C烘箱或用电吹风加热显色，显色后于暗箱式紫外分析仪(365nm)中观察并计算Rf值，见附图6、附图7。
【权利要求】
1.一种刺玫果黄酮有效部位的薄层鉴别方法，其特征在于包括如下步骤: (1)配制刺玫果黄酮有效部位供试品溶液； (2)制备不同浓度的芦丁、槲皮素、金丝桃苷对照品溶液； (3)制备去除总黄酮的阴性对照液； (4)取刺玫果黄酮有效部位供试品溶液、芦丁、槲皮素、金丝桃苷对照品溶液、去除总黄酮的阴性对照液做薄层鉴别分析，其主要特征在于供试品溶液与对照品溶液在相同的位置显示相同颜色的斑点，阴性对照液未显示斑点，则表明供试品溶液中含有此成分，且不存在其他因素的干扰。
2.根据权利要求1所述的刺玫果黄酮有效部位的薄层鉴别方法，其特征在于，可同时鉴别刺玫果黄酮有效部位中的1-2种主要成分。
3.根据权利要求1所述的刺玫果黄酮有效部位的薄层鉴别方法，其特征在于，其具体操作步骤为:取供试品溶液、芦丁、金丝桃苷或槲皮素对照品溶液，用微量注射器于层析硅胶(G)-薄板(招箔片基)上点样，以展开剂展开后，晾干，显色，烘干，供试品溶液与对照品溶液在相同的位置显示相同颜色的斑点。
4.权利要求3中所述的刺玫果黄酮有效部位的薄层鉴别方法，其特征在于，所用的展开剂体系分别为:芦丁和金丝桃苷薄层鉴别采用醋酸乙酯-甲酸-水展开体系；槲皮素薄层鉴别采用苯-醋酸乙酯-甲酸展开体系。
5.权利要求3中所述的刺玫果黄酮有效部位的薄层鉴别方法，其特征在于，所用的展开剂体系的具体体积比为:醋酸乙酯-甲酸-水=8:1:1 ;苯-醋酸乙酯-甲酸=6:4:1。
6.权利要求3中所述的刺玫果黄酮有效部位的薄层鉴别方法，其特征在于，所用的显色剂为AlCl3乙醇溶液。
7.权利要求3中所述的刺玫果黄酮有效部位的薄层鉴别方法，其特征在于，所用的显色剂为AlCl3乙醇溶液浓度约为0.04g/mL。
【文档编号】G01N30/90GK104459012SQ201410823341
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月26日 优先权日:2014年12月26日
【发明者】钟方丽, 王晓林, 杨英杰, 薛健飞, 陈帅, 梁力文, 刘艳文 申请人:吉林化工学院