通过溶剂提取测定样品基质中的分析物的制作方法

本发明涉及一种用于测定样品基质中分析物的方法，特别是谷物中霉菌毒素水平的测定方法，特别是涉及使用溶剂进行分析物提取的方法。

背景技术：

霉菌毒素往往非常稳定，当通过任何其他方式摄取、吸入或引入体内时都可能会产生严重的疾病。例如，霉菌毒素当被人类或动物摄入时被认为是有毒的或致癌的。霉菌毒素在食物和饲料生长期间由霉菌和真菌产生，并且在产生它们的霉菌或真菌已经死亡之后，可能会保留在食物和饲料中。因此，不明显发霉或霉菌计数测试不呈阳性的产品仍然可能含有潜在的危险水平的霉菌毒素。

几个国家目前已经制定或提出了食品和动物饲料中霉菌毒素(主要是黄曲霉毒素)的控制规定。为了协调这些规定，例如，食品和药物管理局已经制定了商品进一步加工所允许的黄曲霉毒素水平的指导方针。允许的水平根据商品的预期最终用途而有所不同。例如，欧盟也制定了赭曲霉毒素a(ota)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)、玉米赤霉烯酮(zea)和其他几种霉菌毒素的水平的规定。

执行这些规定要求准确监测可疑商品。然而，由于霉菌毒素倾向于不均匀地分布在大量的谷物中，对于需要代表特定批次的样品数量进行实验室分析将变得非常昂贵。因此，需要一种快速和便宜的方法来检测大量谷粒中霉菌毒素的存在，从而可以快速鉴定含有霉菌毒素的批次，以便在实验室中进一步进行更准确的分析。

溶剂提取在大多数检测方法中是重要的一步。实际上很多权威机构都没有规定具体的测定方法要求；而是执行某些性能标准：例如，根据2006年2月23日的欧盟委员会条例(ec)第401/2006号标准，其中规定包括提取效率要求，规定回收率为50％至120％，具体取决于霉菌毒素。通常，选择这些要求是为了确保任何测试方法将达到可接受的精度水平、准确度和检测水平。如果提取不能可靠且一致地进行，则分析结果将是不精确的。因此普遍接受的是，提取应该进行足够长的时间以达到提取过程的平衡；在霉菌毒素分析的参考方法的情况下，这段时间是一小时。显然，这大大增加了整体分析时间，并偏离了提供快速测定方法。

然而，从zabe等人(“ethanolextractionmethodforarapidtestforaflatoxinincorn(用于玉米黄曲霉毒素快速检测的乙醇提取方法)”，第297-305页，acs研讨会系列1001-食品污染物-霉菌毒素和食物过敏原)已知的是，提供包括快速溶剂提取霉菌毒素的方法。这里公开了在一分钟内可以实现使用80体积％乙醇和20％水的混合物从玉米中充分提取黄曲霉毒素以满足规章要求。不幸的是，这一水平的乙醇代表着一个小但仍然是不可接受的火灾风险，同时也提供了一种对健康和环境有害的溶剂解决方案。

fossanalyticalab的wo2011/023230中描述了另一种提取方法。这里公开了使用体积20％乙醇和80％水的溶剂混合物可以从谷粒中充分提取霉菌毒素。这显着降低了与更高浓度的乙醇或其他有机溶剂(如甲醇或乙腈)相关的风险和危害方面，但不幸的是，足够的提取需要大约1小时才能实现，这不适用于快速测定技术。

发明概述

本发明的目的是减轻与已知提取技术相关的至少一个问题。

根据本发明的一个方面，提供了一种用于从样品基质、特别是谷粒中提取的一种或多种分析物、特别是霉菌毒素的定量测定的方法，其包括以下步骤，基本上不按照所示的顺序：a)在多个参考样品基质上进行分析物提取，每个参考样品基质具有不同的分析物参考值水平，所述分析物提取包括在相同的提取周期内将每个样品基质与溶剂组合，所述提取周期小于达到平衡所需的时间；并从样品基质中分离含有分析物的溶剂；b)测量从每个参考样品基质获得的分离溶剂中存在的分析物的水平；c)产生计算机可执行校准，通过该计算机可执行校准建立从每个参考基质中提取的分析物的水平与相同的每个参考基质中的分析物的参考水平之间的数学关系；d)重复步骤a和b，将具有未知水平分析物的样品基质替换为参考样品基质，以获得用于样品基质的分离的溶剂中的分析物水平的量度；以及e)在计算机中将在步骤c产生的校准应用于在步骤d确定的分析物的水平，从而得到样品基质中分析物水平的量度。通过认识到在可重复的提取条件下的可靠且可重复的不完全的非平衡提取可能与将从平衡提取获得的、样品基质中存在的分析物水平相关，发明人提供了不依赖于达到提取平衡的检定方法。这允许在较短时间内和/或通常被认为不合适的溶剂进行测定。

为了实现快速分离，从而提高提取过程的可靠性和可重复性，可以通过施加力以分离固体和液体材料来有效地进行分离。这可以通过迫使溶剂/基质混合物通过过滤器来完成，例如可以使用法式压机简单且可靠地实现，或者通过使用通常为沉淀物或过滤器类型的离心机来实现。

应当理解，一个人(合法或真实)完全可能执行直到并包括生成校准模型(上述步骤a至c)的步骤并且另一个人(合法或真实)可执行对具有未知水平分析物的样品基质进行提取和水平测量并将校准模型应用于这些测量。因此，根据本发明的另一方面，提供了一种用于检定样品基质中的一种或多种分析物的方法，包括以下步骤：在样品基质上进行分析物提取，所述分析物提取包括在提取周期内将样品基质与溶剂组合，提取周期小于达到平衡所需的时间，并从样品基质中分离含有分析物的溶剂；测量分离的溶剂中存在的分析物的水平；并在计算机中应用校准，通过该校准建立了借助于上文在样品基质的提取中使用的方法从多个参考样品中的每一个提取的分析物的水平与每个参考样品的分析物水平的参考值之间的数学关系，从而得到样品基质中分析物水平的量度。

通过以下参考附图的附图对本发明的实施例的说明性和非限制性的详细描述，将更好地理解本发明的这些以及附加的目的、特征和优点，其中：

附图说明

图1示出了说明根据本发明的方法的实施例的流程图；

图2示出了在实验研究中使用的根据本发明的方法的第二实施例的流程图；

图3示出了使用不同溶剂的don的时间依赖性回收率；

图4示出了使用不同溶剂的ota的时间依赖性回收率；

图5示出了通过hplc所发现的don浓度和参考浓度之间的相关性；

图6示出了通过hplc所发现的ota浓度和参考浓度之间的相关性；

图7示意性地示出了适用于在根据本发明的方法中测量分析物水平的流式细胞仪装置；和

图8示出了定义提取平衡的图示说明。

发明详述

根据本发明的用于检定分析物的示例性方法通常由图1的流程图示出。在步骤110，进行分析物提取。这包括将样品基质与溶剂混合，可能包括摇动或其他搅拌以确保良好的混合，然后在比达到平衡所需时间短的提取周期之后将样品基质与溶剂分离，但在此期间从基质中提取的分析物可以以可测量的量移入溶剂中。

一旦分离，在步骤120测量溶剂中分析物的水平。该测定中使用的测量技术当然取决于所研究的分析物。将对具有不同参考分析物水平的多个参考样品基质中的每一个重复步骤110和120，并且每个样品基质的结果对计算机可用。获得每个参考基质中包含的分析物水平的参考值(步骤130)，并且也可供计算机使用。这些参考值可以从有意引入参考基质的分析物水平的知识或从对基质进行的参考测量中获得。在后一种情况下，如果将相同的测量技术用于获得溶剂中分析物的水平所用的技术是有利的。在步骤140中，从参考水平值(参考数据集)以及与在同样品基质的分离溶剂(溶剂数据集)中测量的水平值构建计算机可执行数学模型，该计算机可执行数学模型将溶剂中测量的分析物的量与存在于样品基质中的分析物相关联。数据集的回归分析用于以已知方式对变量之间的关系进行建模。特别地，可以对数据集执行简单的线性回归，以便确定要在计算机可执行校准模型中表达的数学关系。然后将该模型提供给相同或不同的计算机用于测定测试样品基质中的分析物的水平。

在步骤150，使用具有未知水平的分析物的测试样品基质进行分析物提取。在该步骤150中采用的提取程序需要基本上类似于在步骤110中采用的从参考样品基质中提取分析物的方法。应当理解，“基本上”被认为包括从步骤110采用的提取程序变化到不可测量地影响从相同参考基质提取到溶剂中的分析物的量的程度。一旦分离，就使用测量在步骤120从样品基质提取的分析物的水平所采用的基本上相似的测量技术和方法来进行在分离的溶剂中存在的分析物水平的测量(步骤160)。该测量水平被提供给已经被提供对计算机可执行校准模型的访问权的计算机，并且在步骤170，计算机将校准应用于所测量的水平，并且定量地测定存在于未知样品基质中的分析物的量，其中然后该值可以按机器或优选地人类可理解的格式从计算机输出。

应当理解，上述过程步骤不一定按照关于该特定实施例提供的顺序来执行，并且并不是落入本发明的范围的所有的处理步骤都需要由相同的人执行或以相同的频率执行。实际上，一个人(合法或真实)完全可能执行直到并包括产生校准模型(步骤110至140)的步骤，而另一个人(合法或真实)可以对具有未知水平的分析物的样品基质进行提取和水平测量，并将校准模型应用于这些测量(步骤150至170)。

通常，可以大量多次执行未知样品的检定中所涉及的步骤(步骤150至170)，而生成校准模型所涉及的步骤(步骤110至140)可能相对较少地进行。因此，根据用于检定样品基质中的一种或多种分析物的另一示例性方法，待进行的步骤包括在样品基质上进行分析物提取150，所述分析物提取包括在提取周期内将样品基质与溶剂组合，提取周期小于达到平衡所需的量，并从样品基质中分离含有分析物的溶剂；测量分离的溶剂中存在的分析物的水平(步骤160)；并且在步骤170，在计算机中应用校准，通过该校准建立了借助于以上在样品基质的提取中使用的过程从多个参考样品中的每一个提取的分析物的水平与每个参考样品的分析物水平的参考值之间的数学关系，从而得出样品基质中分析物水平的量度。

步骤160(在一个实施方案中也可以在步骤120中)的分析物水平的测量可有利地使用使用微珠770的图7所示的常规流式细胞仪装置710进行，微珠770在其表面具有对分离的溶剂中的目标分析物的优先结合亲和力的分子。这样的分子可以是抗体、适体、分子印迹聚合物或对待检定水平的分析物之一具有优先结合亲和力的任何已知分子。本示例性实施例的装置710包括流动池720；光源730；一个或多个光学检测器(这里是两个，740a，740b)；以及可操作地连接以接收检测器740a，740b的输出的信号处理器750。

将在步骤150获得的分离的溶剂与已知量的荧光标记的分析物分子和包被的微珠770混合。来自分离的溶剂的分析物和荧光标记的分析物分子在微观上竞争可用的结合位点，一旦已经达到平衡，来自珠粒的荧光将反映其相对浓度。传统上，通过使用试剂30-60分钟孵化使该反应平衡，但本发明人已经发现，定量信息可在孵化数分钟后提取，尽管不确定性增加。可以通过跟踪反应动力学，而不是在固定的时间窗中测量，来增加基于早期测量的预测的鲁棒性。

将含有孵化的试剂的溶液通过样品入口700注入流动池720中，并被无颗粒的鞘液790包围。溶液以微珠770悬浮于其中的流体动力学聚焦的样品流760流过流动池720。基本单色光的光束780由光源730(例如激光光源或发光二极管)产生，并且被入射到流动池720中的聚焦样品流760上。通过将光束聚焦到一个小斑点，单独的珠子可以被光学地寻址，珠子上标记的分析物的荧光可以与溶液中标记的分析物的荧光区别开来。发射的光的一部分例如用透镜收集，被过滤以选择特定的波长范围并指向适当的一个或多个光学检测器740。来自每个光学检测器740的输出被发送到信号处理器750，信号处理器750被配置为使得例如可以读出并存储来自各个珠的总和/或最大荧光以用于随后的分析。

在上述流式细胞仪测量装置710的变型中，微珠770可以包括不同组的微珠，每组由涂覆有对该组特定的且不同于其它组的分析物具有结合亲和力的分子的微珠组成。也可以选择附着于分析物分子的荧光标记，以便为每种类型的分析物提供不同的波长(该术语包括窄带波长)的荧光信号。以这种方式，可以通过区分由检测器740检测到的荧光的波长来同时容易地检多种分析物。众所周知，这可以通过使用多个检测器来实现，其中多个检测器中的每一个被配置(用于例如通过在每个检测器之前添加适当的过滤器)以检测不同的荧光波长。可替代地，将相同的荧光标记附着到不同的分析物上。然后用在不同波长带上发射的染料对微珠770进行染色，并且将珠粒荧光的强度用作标记以指示该珠粒结合的分析物的类型。任一种方法有利地允许从样品基质同时检测多种分析物。

在给定的一组条件下达到平衡所需时间的一个可操作的定义可以说明如下(也参见图8)：rm是在非常长的提取时间(例如，几个小时)之后获得的最大回收率，s是回收率r的重复测量的标准偏差。此外，提取的特征时间尺度t可以定义为回收率r达到rm的一半所需的时间。然后，达到平衡所需要的时间te可以被定义为在大于特征时间尺度的预定时间段t(比如3*t)内测量的回收率r已经改变小于一个标准偏差s的时间，说)。提取未达到平衡的时间的定义可能比自平衡的该预定时间段(比如3*t)的时间早几倍。

应该明白，“基本上”“基本上相似”和类似术语被用于包括关于未知样品基质所采用的任何程序，从关于参考样品基质在步骤110和120中采用的的程序到与不可测量地影响从相同的参考基质提取到溶剂中的分析物的量的程度。

实验研究

用于证明不同提取时间和溶剂类型的效果的样品由具有参考霉菌毒素水平don：1987ppb±123ppb和ota：18ppb±3ppb的小麦样品基质构成。

用于在2分钟内用30％乙醇提取的证明中所使用的样品由五个小麦样品基质组成，每个样品基质具有如下表所示的不同的霉菌毒素浓度：

霉菌毒素浓度

使用的提取溶剂是乙醇(30％v/v)，乙腈(60％v/v)和甲醇(80％v/v)的水溶液。溶剂的有机组分的选择是基于科学研究中通常使用的。

选择提取时间为1分钟、2分钟、4分钟和30分钟。使用30分钟提取时间作为参考，并测量每种提取溶剂的最大回收率rm。为了获得精确的提取，在精细过滤之前通过在法式压机(frenchpress)中过滤进行快速分离。法式压机在建筑和操作上与众所周知的法式咖啡冲压机类似，包括一个装有柱塞的窄圆柱形烧杯，其柱塞紧紧地但可滑动地安装在气缸中，并且在一端具有网状过滤器。随着柱塞移动通过由样品基质和含有溶剂的分析物组成的混合物，溶剂被迫通过过滤器并与样品基质分离。这种压力增强的分离极大地提高了从提取到分离提取物的速度，通常不长于30秒。在替代的实施方案中，提取可以使用标准离心机进行，以分离溶剂和样品基质，例如通过过滤或沉淀。

在实验研究中使用的根据本发明的方法中与hplc分析相结合的don和ota的提取和样品清理程序的概述如图2所示。

在vicamdontestwb的参考方法的don样品制备中，免疫亲和柱(iac)用作清除步骤。参考方法遵循vicam描述的样品制备程序(dontesthplc&dontestwb，使用说明书(hplc用途)，rev.b，vicam)。使用的hplc设置为：1ml/min流量的乙腈/水10/90。以500μl/min的抽吸和注射速度注入50μl。柱：phenomenex的反相synergi4μm，hydro-rp250×4,6mm，具有预柱。柱部分加热至30℃。在218nm±2nm下进行uv-vis检测，参考值为500nm±50nm。

提取和清理程序如下：

1.样品5g细磨小麦(步骤210a))

2.用20ml的去离子水，同时在密封容器中搅拌混合物(步骤210b))

3.法式压机快速过滤，液相样品5ml(使用注射器)，(步骤210c))

4.通过whatmangf/a过滤器进行过滤。滤液必须澄清的(od600<0,02)。(步骤210d))

5.让iac温和至环境温度(5分钟)

6.传递存储缓冲液通过iac。(步骤220)

7.用1ml去离子水清洗iac。

8.将1ml过滤的提取物加入到iac中，让其约1滴/秒通过。

9.用5ml去离子水冲洗iac(1滴/秒)。施加空气压力，直到空气通过色谱柱并用纸吸干。

10.用2ml甲醇洗脱至少5分钟(<1滴/秒)。施加空气压力，直到空气通过色谱柱。

11.从样品中蒸发甲醇并用500μl的hplc流动相重组。(步骤230)

12.转移到hplc样品瓶并进行hplc分析。(步骤240)

为了对用有机溶剂提取的don进行定量，在样品制备中包括稀释步骤(步骤215a)。这是因为vicamiac针对水提取物进行了优化。如果将具有高含量有机溶剂的提取物施加到柱上，则don不会在柱中结合，并且实现低回收率。当用有机溶剂提取时，稀释步骤包括：

·过滤的提取物用水稀释10倍：500μl提取物+4500μl的去离子水(点4a)。

·将所有稀释的提取液(5ml)施用于iac，使其以1滴/秒通过。(替换上面的第8点)。

从样品中蒸发甲醇并用300μl的hplc流动相重新构成(代替上述11点)。

使用的解决方案

对于ota的提取和清理，遵循的步骤是：

1.样品5g，均质研磨的小麦。(步骤210a))

2.在密封容器中搅拌混合物的同时在1分钟内提取20ml溶液a。(步骤210b))

3.通过法式压机快速过滤，并取样5ml的液相(使用注射器)。(步骤210c))

4.通过whatmangf/a过滤器进行过滤。滤液必须是澄清的。(步骤210d))

5.提取样品500μl，用溶液b稀释至2.5ml。(步骤215b)

6.让iac温和至环境温度(5分钟)。

7.传递存储缓冲液通过iac。(步骤220)

8.用1000μl溶液b洗涤iac。

9.将1ml稀释的提取物加入到iac中，使其以1滴/秒通过。

10.用700μl溶液b洗涤iac(1滴/秒)。施加空气压力，直到空气通过色谱柱并用纸吸干。

11.用500μl溶液c洗脱(<1滴/秒)。施加空气压力，直到空气通过色谱柱。

12.转移到hplc样品瓶并进行hplc分析。(步骤240)

使用的解决方案

使用一种天然污染的小麦样品(1987ppbdon和18ppbota)的不同提取溶剂和时间的实验结果如图3所示。

在图3说明了在不同提取时间下，用60％乙腈(三角形数据集)，80％甲醇(圆形数据集)和30％乙醇(方形数据集)提取don的回收率曲线。回收率是异常高的，这源于样品清理问题。从图3可以推导出的是，对于所有三种溶剂来说，每分钟最高的don的获得在前4分钟内发生，并且溶剂的水含量似乎对回收率具有积极的影响。

当绘制作为不同溶剂的提取时间的函数的ota的回收率时，这一点也是显而易见的；在最初四分钟内提取最多量的霉菌毒素(图4)。提取的参考溶剂为60％乙腈(三角形数据集)，并在短提取时间提供约50％的回收率，30％乙醇(方形数据集)提供约30％的回收率，或比60％乙腈低40％。80％甲醇(圆形数据集)提供在60％乙腈和30％甲醇之间的回收率。ota参考值的不确定度的下限用虚线表示，可以看出，30分钟后乙腈提取接近该值。

通常在1-4分钟内用60％乙腈提取的ota得到45-55％的回收率。在同一时间间隔内，30％乙醇的回收率为28-29％。80％的甲醇使回收率在33-39％之间。从don的时间和溶剂实验可以推导出，在最初4分钟内提取最大量的don，溶剂的含水量对回收率有积极的影响。

如上所述，应当理解，水中的30％乙醇可以是用于快速提取don和ota的可行溶剂，并且被选择用于进一步的实验。实际上，使用在水中的20％至40％的乙醇浓度可以实现don和ota的快速、但不完全的提取。在图5绘制了通过hplc发现的don浓度与5个样品的参考浓度之间的相关性。由于提取错误(三角形)，一次重复被删除；在提取后发现一团面粉，导致该样品的回收率较低。另外一个样品是一个不明原因的异常值(圆圈)，被排除。看出有明显的线性相关性，平均回收率70％，cv回收率为5％。图6中可以看到具有不同浓度的ota的五种不同参考样品的相应图。在hplc发现的浓度和参考值之间也存在线性相关性。平均回收率为44％，cv回收率为27％。高cv值可能是由于三个不同的人完成提取

在don数据集和ota数据集上进行线性回归分析，这里例如以最小二乘法拟合的形式，并且所得到的直线拟合分别示出在图5和图6中。

从上述实验研究的考虑可以理解，已经建立了用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)和赭曲霉毒素a(ota)的霉菌毒素的快速提取方法。在2分钟内用30％乙醇提取霉菌毒素是可能的，don的平均回收率为70％，ota的平均回收率为44％。对于通过hplc发现的浓度和参考浓度，可以获得不同霉菌毒素的线性回归，从中可以建立表达每个回归的计算机可执行校准，用于根据使用与上述那些基本相似的技术提取的溶剂中存在的水平来确定未知样品基质(例如小麦)中的分析物的量。对于0-300ppb范围内的don，发现r平方值为0.99，ota在0-101.8ppb范围内，r平方为0.96。

应当理解，根据本发明的方法适用于从相同或其它类型的谷粒中提取其它霉菌毒素如伏马毒素、zea、t2-毒素和黄曲霉毒素，并且可以更一般地应用于传统上依赖于完全恢复的其它基于提取的检定。本发明的保护范围仅由权利要求书的措辞限定，而不是由上面提供的示例性实施方案和实验研究来限定。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.用于定量检定样品基质中一种或多种分析物的方法，包括以下步骤：

a)在多个参考样品基质上进行分析物提取，每个参考样品基质具有不同的分析物参考值水平，所述分析物提取包括在相同的提取周期内将每个样品基质与溶剂混合，所述提取周期小于达到平衡所需的时间；并从样品基质中分离含有分析物的溶剂；

b)测量从每个参考样品基质获得的分离的溶剂中存在的分析物的水平；

c)生成计算机可执行校准，由该计算机可执行校准建立从每个参考基质提取的分析物的测量水平与每个参考基质的分析物的参考水平之间的数学关系；

d)基本上重复步骤a和b，将具有未知水平分析物的相同类型的样品基质替换为参考样品基质，以获得用于样品基质的分离溶剂中分析物水平的量度；以及

e)在计算机中将在步骤c生成的校准应用于在步骤d确定的分析物水平，从而得出样品基质中分析物水平的量度。

2.如权利要求1所述的方法，其中分离含有分析物的溶剂包括在施加的力下分离。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种分析物是霉菌毒素，并且样品基质是谷粒。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述霉菌毒素是脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)和赭曲霉毒素a(ota)中的一种或两种。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述溶剂是含有体积为20体积％至40％乙醇的乙醇水混合物。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述溶剂含有体积为30％的乙醇。

7.根据权利要求1所述的方法，其中生成计算机可执行校准包括在计算机中执行线性回归分析以建立所述数学关系。

8.根据权利要求1所述的方法，其中测量分析物的水平包括将分离的溶剂与已知量的荧光标记的分析物分子混合，以及与在其表面具有对分析物具有优先结合亲和力的分子的微珠混合；并在混合后使用流式细胞仪测量荧光作为分析物水平的量度。

9.如权利要求8所述的方法，其中在测量所述荧光之前，在小于建立反应平衡所需时间的时间内进行混合。

10.一种用于检定样品基质中一种或多种分析物的方法，包括以下步骤：在所述样品基质上进行分析物提取，所述分析物提取包括在提取周期内将所述样品基质与溶剂混合，所述提取周期小于达到平衡所需时间，并从样品基质中分离出含有分析物的溶剂；测量分离的溶剂中存在的分析物的水平；并在计算机中应用校准，通过该校准建立借助于上文在样品基质的提取中使用的方法从多个参考样品中的每一个提取的分析物的水平与每个参考样品的分析物水平的参考值之间的数学关系，从而得出样品基质中分析物水平的量度。

11.根据权利要求10所述的方法，其中测量分析物的水平包括将分离的溶剂与已知量的荧光标记的分析物分子混合，并且与在其表面被提供有对分析物具有优先结合亲和力的分子的微珠混合；并在混合后使用流式细胞仪测量荧光作为分析物水平的量度。

12.根据权利要求10所述的方法，其中混合分离的溶剂包括在测量荧光之前在比建立反应平衡所需时间少的时间内与微珠一起孵化。

13.一种用于生成用于根据权利要求10所述的方法的校准的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在多个参考样品基质上进行分析物提取，每个参考样品基质具有不同的参考值水平分析物，所述分析物提取包括在相同的提取周期内将每个样品基质与溶剂组合，所述提取周期小于达到平衡所需的时间；并从样品基质中分离含有分析物的溶剂；

b)测量从每个参考样品基质获得的分离的溶剂中存在的分析物的水平；

c)生成计算机可执行校准，通过该校准建立从每个参考基质提取的分析物的测量水平与每个参考基质中相同的一个分析物的参考水平之间的数学关系。