一种固相萃取填料、固相萃取小柱及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于仪器分析技术领域，具体涉及一种固相萃取填料、固相萃取小柱及其 制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 生物样品的成分复杂，基质干扰严重，对生物样品中的内源性物质分析检测，一直 是分析工作者的关注焦点。现有的生物样品前处理方法包括有机溶剂沉淀法（0SP)、液液萃 取（LLE)、固相萃取（SPE)、固相微萃取（SPME)等。其中固相萃取的应用最为广泛。
[0003] 固相萃取法，是主要通过固相填料对样品组分的选择性吸附及解吸过程，实现对 样品的分离、纯化和富集，其主要目的在于降低样品基质干扰，提高检测灵敏度。为了方便， 固相萃取一般使用固相萃取小柱。但在具体使用时，现有的基于无定形硅胶填料的固相萃 取小柱存在萃取功能基团单一、样品容量较低、淋洗与浓缩无法一步完成的技术问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一是提供一种固相萃取填料及其制备方法，其键合的功能基团 多。
[0005] 为实现上述目的，本发明的固相萃取填料0DS-⑶-HPS，其键合有β -环糊精 (β-⑶）和十八烷基硅烷（0DS)混合功能基团。
[0006] 所述固相萃取填料0DS-⑶-HPS的制备方法，包括以下步骤：
[0007] (1)材料 CD-HPS 的合成：将经真空干燥（0· 1 ~0· 2mmHg，110 ~120°C，12 ~14h) 后的22~25克β -环糊精溶于500~600毫升无水二甲基甲酰胺中，加入24~26毫克 氢化钠后，在氮气保护下室温搅拌至反应液透明；随后向该反应液中加入3. 5~4. 2毫升 3-(2, 3-环氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷，在氮气保护下于70°C反应5~6小时后，再加入 20~22克经真空干燥后的活化硅胶，于110~120°C反应24~26小时；待反应混合液冷 却至室温后，用G4砂芯漏斗过滤，滤饼依次用二甲基甲酰胺、水、甲醇洗涤；最后将滤饼置 于索式萃取器中，以丙酮为溶剂抽提12~14小时，即制得键合硅胶⑶-HPS。
[0008] (2)填料0DS-CD-HPS的合成：将经真空干燥（0· 1~0· 2mmHg，80~90°C，12~ 14h)后的20~22克键合硅胶⑶-HPS均匀分散于含有0. 2~0. 3毫升无水三乙胺的500~ 600毫升无水甲苯中，随后加入15~18毫升十八烷基三甲氧基硅烷，在氮气保护下加热回 流24~26小时；待反应混合液冷却至室温后，用G4砂芯漏斗过滤，滤饼依次用甲苯、异丙 醇、甲醇、水、丙酮洗涤；最后将滤饼置于索式萃取器中，以丙酮为溶剂抽提12~14小时，BP 制得产物键合硅胶0DS-⑶-HPS。
[0009] 所述β -环糊精在⑶-HPS中的键合量为185~200 ymol/g，所述十八烷基三甲氧 基硅烷在0DS-CD-HPS中的键合量为218~230 ymol/go
[0010] 所述硅胶为多孔球形硅胶，粒径为10~20 μ m，孔径为丨〇〇~120Α<.
[0011] 本发明的目的之二是提供一种填充上述填料的固相萃取小柱，其样品容量高。
[0012] 为实现上述目的，本发明的一种固相萃取小柱，包括空管柱和填料，所述填料为键 合硅胶固相萃取填料0DS-⑶-HPS。
[0013] 所述固相萃取小柱的空管柱内部直接填充填料0DS-CD-HPS，填料两端由筛板封 住，防止混合填料外漏，柱子一端为样品或溶剂注入口，柱子另一端为样品或溶剂流出口。
[0014] 所述空管柱的容积为1~6毫升，所述填料0DS-⑶-HPS的填充量为8~50毫克， 填充柱床厚度为2~3毫米。
[0015] 本发明提供的固相萃取填料是以高纯度的多孔球形硅胶为原材料，经化学键合 β -⑶和0DS两种功能团制备而得。由于键合到同一硅胶颗粒上的两种混合功能基团β -⑶ 和0DS的协同作用，并且使用粒径小的球形硅胶基质，使得填充该键合填料的固相萃取小 柱具有很尚的样品容量。
[0016] 本发明的目的之三是提供上述固相萃取小柱在生物样品前处理方法中的应用，操 作简单，淋洗与浓缩能一步完成，能快速的萃取与富集生物样品。
[0017] 为实现上述目的，本发明提供的固相萃取小柱在生物样品前处理中的应用，主要 是起萃取与富集中等极性和弱极性物质的作用。
[0018] 所述的生物样品包括但不仅限于人体体液和组织匀浆，所述的体液主要是指血清 和尿液。
[0019] 本发明的基于上述固相萃取小柱的生物样品前处理方法中的应用，包括以下步 骤：
[0020] (1)将活化剂加入0DS-CD-HPS固相萃取小柱中，所述活化剂的体积为所述空管柱 的容积的1/3倍~1倍；所述活化剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲 烷、四氯化碳、乙醚、甲苯、苯、环己烷、石油醚、己烷、戊烷中的至少一种；
[0021] (2)用超纯水平衡所述固相萃取小柱，所述超纯水的体积与所述活化剂的体积相 同；
[0022] (3)将待处理的生物样品注入平衡后的所述固相萃取小柱中；所述待前处理的生 物样品的体积为所述空管柱的容积的1/3倍~1倍；
[0023] (4)用超纯水洗涤上样后的所述固相萃取小柱，所述超纯水的体积为所述空管柱 的容积的1/3~2/3 ;
[0024] (5)用氮气或空气吹干所述固相萃取小柱；
[0025] (6)用淋洗剂对所述固相萃取小柱进行淋洗，所述淋洗剂的体积为所述分离柱的 容积的1/10~1/30倍；所述淋洗剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲 烷、四氯化碳、乙醚、甲苯、苯、环己烷、石油醚、己烷、戊烷中的至少一种；
[0026] (7)将步骤（6)得到的淋洗液直接进样到LC-MS/MS分析仪中分析留体激素及其代 谢物。
[0027] 与现有的基于无定形硅胶填料的普通固相萃取小柱相比，本发明的固相萃取小柱 只需使用极少体积的有机溶剂淋洗，对中等极性和弱极性物质具有高萃取回收率、高重现 性、高萃取效率。并且使用该固相萃取小柱，淋洗与浓缩一步完成，最终得到的淋洗液无需 额外的加热氮吹等步骤实现富集浓缩，适用于自动样品前处理仪对各类人体体液和组织匀 浆中的多类化合物的快速在线萃取与富集。
【附图说明】
[0028] 图1为三种典型的甾体激素 A4、T、DHT萃取后LC-MS/MS分析谱图。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述。
[0030] 实施例1
[0031] 固相萃取填料0DS-⑶-HPS的制备方法，包括以下步骤：
[0032] ⑴材料CD-HPS的合成：将经真空干燥（0.1 mmHg，110°C，14h)后的22克β -环 糊精溶于500毫升无水二甲基甲酰胺中，加入24毫克氢化钠后，在氮气保护下室温搅拌致 反应液形成透明溶液；随后向该反应液中加入3. 5毫升3-(2, 3-环氧丙氧）丙基三甲氧基 硅烷，在氮气保护下于70°C反应5小时后，再加入20克经真空干燥后的活化硅胶（粒径为 10~20 μ m，孔径为100A )，于120°C反应24小时；待反应混合液冷却至室温后，用G4砂芯 漏斗过滤，滤饼依次用二甲基甲酰胺、水、甲醇洗涤；最后将滤饼置于索式萃取器中，以丙酮 为溶剂抽提12小时，即制得键合硅胶⑶-HPS。
[0033] (2)填料0DS-CD-HPS的合成：将经真空干燥（0· ImmHg，80 °C，14h)后的20克 CD-HPS硅胶均匀分散于含有0. 2毫升无水三乙胺的500毫升无水甲苯中，随后加入15毫 升十八烷基三甲氧基硅烷，在氮气保护下加热回流24小时；待反应混合液冷却至室温后， 用G4砂芯漏斗过滤，滤饼依次用甲苯、异丙醇、甲醇、水、丙酮洗涤；最后将滤饼置于索式萃 取器中，以丙酮为溶剂抽提12小时，即制得产物键合硅胶0DS-CD-HPS。其化学合成路线如 下所示：
[0035] 材料⑶-HPS进行元素分析，结果为含C 8. 9%，含Η 1.9%，揭示了 β -环糊精在 ⑶-HPS中的键合量为185 ymol/g。
[0036] 填料0DS-⑶-HPS进行元素分析，结果为含C 14. 6%，含Η 3. 2%，揭示了 0DS在 0DS-CD-HPS 中的键合量为 218 ymol/g。
[0037] 实施例2
[0038] 固相萃取填料0DS-⑶-HPS的制备方法，包括以下步骤：
[0039] ⑴材料CD-HPS的合成：将经真空干燥（0· 2mmHg，120°C，12