一种净化真菌毒素的固相萃取柱及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种固相萃取柱的制作和使用方法，尤其涉及一种净化真菌毒素的固 相萃取柱及其应用。
【背景技术】
[0002] 果蔬在生长、采收、贮藏、运输、销售等各个过程，易受到病原微生物污染，特 别是在贮藏期间，由病原菌侵染引起的果蔬采后腐烂较重，产生并积累各种真菌毒 素（Mycotoxin)，对人和动物的健康造成了极大的危害。其中，最主要的污染果蔬的真 菌毒素包括链格孢毒素 （alternaria toxin)，展青霉素（patulin，PAT)，赭曲霉毒素 (ochratoxin)及橘青霉素（citrinin，CIT) 〇
[0003] 链格孢毒素是由链格孢霉产生的一系列代谢产物，主要包括5种：交链孢酚 (AOH)，交链孢酚单甲醚（AME)，细交链格孢酮酸（TeA)，交链孢烯（AOH)，腾毒素（TEN)。已 有研究表明：进食受链格孢毒素污染的粮食与人类食管癌高发病率密切相关。最近欧洲食 品安全局（EFSA)对食品中链格孢毒素的潜在风险进行评估，研究结果表明，随膳食摄入的 链格孢毒素对公众健康存在潜在风险，目前已开始着手制定链格孢毒素的最大残留限量标 准。
[0004] 赭曲霉毒素（ochratoxin，0T)是由曲霉菌属和青霉菌属等产生的次生代谢产物， 分为0TA、0TB、0TC 3种，其中以OTA毒性最大，广泛地分布于农产品及饲料中。OTA被证明 具有较强的的肝毒性和肾毒性，并有致畸、致癌和致突变作用。
[0005] 展青霉素（patulin，PAT)又名棒曲霉素，由曲霉菌、青霉菌和丝衣霉产生的次级 代谢产物，是水果中常见真菌毒素。PAT具有急性毒性，包括对动物的肺、脑水肿、肝脏、脾 脏、肾的损害和免疫系统的毒害作用；也具有慢性毒性，表现在对动物的细胞毒性，基因毒 性和免疫毒性。
[0006] 橘青霉素（Citrinin，CIT)是一类醌甲基化合物，它对动物和人类具有肾毒性、基 因毒性、致癌性、胚胎毒性，它是一种肾毒素，会破坏动物肾小管，毒害胚胎期动物的肾脏， 是巴尔干肾病的潜在的病原体。
[0007] 长期以来，由于鲜食的果蔬在食用过程中会去除腐烂部位，果蔬中的真菌毒素污 染未引起足够的重视。但已有研究结果表明，未腐烂部位也有不同程度的真菌毒素检出。此 外，在果汁、果酱、果酒等工业生产过程中，主要是通过剔除腐烂部分降低毒素及病菌污染 的风险，但是这并不能完全消除风险。特别是有的病原菌，如链格孢菌属（Alternaria spp) 可使果实内部腐烂而表皮无明显变化，不能通过冲洗，分拣操作去除毒素，进而增加了果汁 类产品的安全隐患。近年来，皮渣的回收利用成为果蔬加工和副产品综合利用的一大重点， 特别是作为新型动物饲料应用广泛。这些产品极大增加了毒素污染食品和通过污染饲料继 而污染畜禽等动物源性食品的风险，间接威胁人类饮食安全。因此，加强果蔬产品真菌毒素 监测技术研究已刻不容缓。
[0008] 目前报道的农产品及食品中上述8种真菌毒素的检测方法主要采用液相色谱法 (HPLC)、液相色谱法-质谱法（HPLC-MS/MS)等。此类方法前处理操作繁琐，难以满足现场 的、大批量样品的快速检测；而且检测成本高，同时AOH和AME回收率偏低。
[0009] 而有关固相萃取柱的描述：
[0010] 在 CN201410001661.6(公开号为 CN103954714A，黄曲霉毒素）和 CN201410835645. 7 (公开号为CN104502481A，呕吐霉素和玉米赤霉烯酮）提到了 11^(3〇8印? 228固相萃取柱。但]\^(：〇8印? 228主要应用于农产品中黄曲霉毒素、展青霉素的固相萃取 柱，目前未见针对链格孢毒素开发的固相萃取柱。
[0011] 另外，CAPCELL PAK CRStrong Cation Exchange&Reversed Phase 强阳离子交换 与反向粒子混合柱CAPCELL PAK CR是2007年最新推出的产品之一，是将阳离子交换填料 SCX与C18包被型填料按一定比例混合（SCX :C18 = 1 :50,1 :20和1 :4三种）制成的。可 实现离子和亲水性化合物在LC/MS上的同时分离。但经验证，C18填料对于链格孢毒素有 较强的吸附能力，按照固相萃取柱适用的方法使用时，回收率低（低于20% )，因此该产品 不适用于链格孢毒素的净化。
[0012] 因此，有必要建立高效且可靠的分析方法来监控果蔬真菌毒素的发生及污染情 况。
【发明内容】
[0013] 本发明的旨在解决现有固相萃取柱技术对果蔬真菌毒素检测净化效果差，回收率 低，并且试剂较为复杂，不能对各种水果、蔬菜、粮食和食品样品进行准确的检测的问题，进 而提出一种用于真菌毒素检测的固相萃取柱及其使用方法。
[0014] 本发明提供了一种用于果蔬真菌毒素检测的固相萃取柱（简称SPE柱），该固相萃 取柱包含以下部件中的至少两种：弱阴离子交换色谱填料、反相色谱填料、阳离子交换色谱 填料。
[0015] 优选地，固相萃取柱包含弱阴离子交换色谱填料和阳离子交换色谱填料时，弱阴 离子交换色谱填料和阳离子交换色谱填料的体积比为1-5 :1_3。
[0016] 进一步优选，弱阴离子交换色谱填料和阳离子交换色谱填料的体积比为3-5: 1_3 〇
[0017] 更进一步优选，弱阴离子交换色谱填料和阳离子交换色谱填料的体积比为3-5 : 1〇
[0018] 优选地，所述固相萃取柱中：弱阴离子交换色谱填料、反相色谱填料与阳离子交换 色谱填料的体积比为1_5 :1_3 :1_3。
[0019] 进一步优选，所述固相萃取柱中：弱阴离子交换色谱填料、反相色谱填料与阳离子 交换色谱填料的体积比为3-5 :1-3 :1-3。
[0020] 更进一步优选，所述固相萃取柱中：弱阴离子交换色谱填料、反相色谱填料与阳离 子交换色谱填料的体积比为3-5 :1-3 :1。
[0021] 本发明所述的固相萃取柱中，还含有筛板，筛板在不同色谱填料中间，将两种填料 隔开。
[0022] 优选地，所述筛板有3-4层，分别在不同色谱填料的两边和中间。
[0023] 上述固相萃取柱中：
[0024] 所述弱阴离子交换色谱填料为NH2，市售购买，其主要成分是以硅胶为基质的氨丙 基，其粒径优选为40-60 μ m。
[0025] 所述反相色谱填料为HLB，市售购买，其主要成分为N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基 苯共聚物，其粒径优选为40-60 μ m。
[0026] 所述阳离子交换色谱填料为MCX，市售购买，其基质为N-乙烯吡咯烷酮与二乙烯 基苯按特定比例聚合而成，再将磺酸基团键合在该基质上，其粒径优选为40-60 μ m。
[0027] 所述筛板为10-30微米孔径的聚乙烯或聚四氟乙烯筛板。
[0028] 本发明还提供了上述固相萃取柱的制备方法，具体为：在筛板上加入阳离子交换 色谱填料，再加入一层筛板，在此筛板上加入弱阴离子色谱填料，其上再加入一层筛板，压 紧，即得固相萃取柱。
[0029] 本发明还提供了上述另外一种固相萃取柱的制备方法，具体为：在筛板上加入阳 离子交换色谱填料，再加入一层筛板，在此筛板上加入反向色谱填料，其上再加一层筛板， 在此筛板上加入弱阴离子色谱填料，其上再加入一层筛板，压紧，即得固相萃取柱。
[0030] 本发明还提供了上述固相萃取柱在净化果蔬真菌毒素方面的应用。
[0031] 所述净化为真菌毒素穿漏法：将含真菌毒素的提取液直接加入多功能柱，收集过 柱后的提取液，提取液中的杂质被多功能柱保留。
[0032] 上述穿漏时，固相萃取柱与样本溶液的体积比为I :5_1 :30。
[0033] 本发明还提供了上述固相萃取柱净化样品在净化其他中性或酸性的毒素方面的 应用。
[0034] 所述其他中性或酸性毒素为黄曲霉毒素、玉米赤霉酮、脱氧雪镰刀菌烯醇。
[0035] 所述检测是利用液相色谱串联质谱仪进行分析，通过多反应监测（MRM)方式进行 准确定量。
[0036] 需要说明的是，本发明提供的多功能净化柱在使用时，弱阴离子交换色谱填料、反 相色谱填料和阳离子交换色谱填料均可以调换位置，或者反向色谱填料在上，或者阳离子 交换色谱填料在上。
[0037] 本发明提供的固相萃取柱具有以下有益效果：
[0038] (1)本发明提供的真菌毒素检测的固相萃取柱，适用于各种水果、蔬菜、粮食、饲料 和食品样品，样品乙腈/水提取后，可直接过柱，净化。与通用的固相萃取方法相比，此方法 更加简便快捷、节省了样品处理的时间及成本、减少了有机溶剂的消耗量，使毒素检测的前 处理更为方便、高效、标准。并且本发明所述净化柱可一次性对不同真菌毒素进行净化，而 同类的Romer的固相萃取柱需分别对每一大类真菌毒素进行净化和分析，极大的节省了成 本及分析时间。
[0039] (2)本发明提供的真菌毒素检测的固相萃取柱，包括三种净化机理：亲水作用、反 相分离和离子交换。
[0040] (3)本发明提供的真菌毒素检测的固相萃取柱，除适用于上述8种果蔬主要真菌 毒素的净化外，也适用于检测粮食和食品中的真菌毒素或其他中性或酸性的毒素；
[0041] (4)本发明提供的固相萃取柱较单独使用阳离子交换色谱填料、反向色谱填料或 弱阴离子交换色谱填料相比，能显著降低基质效应。阳离子交换色谱填料可用于去除色素 等碱性杂质和蛋白质等两性杂质，HLB是亲水-亲脂平衡的吸附剂，其保留机理为反相，可 有效去除脂肪等非极性杂质。弱阴离子交换色谱对于小分子的极性杂质有较强的净化效 果，如：苷类、生物碱盐、单糖类、氨基酸、鞣质、小分子有机酸、亲水性色素等。因此，三种填 料复配可有效去除样本中的杂质，经处理后的样本十分干净，基质效应几乎全部去除；连续 进样后灵敏度不会有明显变化，三重四级杆质谱仪的离子源仍保持干净。
【附图说明】
[0042] 图1为固相萃取柱，其中1为柱管，2为筛板，3为弱阴离子色谱填料，4为筛板，5 为反向色谱填料，6为筛板，7为阳离子交换色谱填料，8为筛板；
[0043] 图2为固相萃取柱，其中1为柱管，2为筛板，3为弱阴离子色谱填料，4为筛板，5 为阳离子交换色谱填料，6为筛板；
[0044] 图3为固相萃取柱与myC〇%p? 228固相萃取柱净化效果比较，上面为净化前，下 面的为净化后液质进样前，右面的试管中的液体为mycosep? 228固相萃取柱净化效果。
【具体实施方式】
[0045] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0046] 聚乙烯或聚四氟乙烯筛板的孔径在市场上购买时只能是范围值的孔径，如 10-30 μ m，其平均孔径为22 μ m，生产厂家为北京茨维特科技有限公司。
[0047] 弱阴离子交换色谱填料的粒径为40-60 μ m，其平均粒径为50 μ m，生产厂家为北 京茨维特科技有限公司。
[0048] 同样，反相色谱填料的粒径为40-60 μ m，其平均粒径为50 μ m，生产厂家为北京茨 维特科技有限公司。
[0049] 同样，阳离子交换色谱填料的粒径为40-60 μ m，其平均粒径为50 μ m，生产厂家为 北京茨维特科技有限公司。
[0050] 实施例1 :固相萃取柱的原料及制备
[0051] 1、原料：
[0052] (1)柱管：6mL的聚丙烯或玻璃柱管，内径12. 7mm ;
[0053] (2)筛板：10-30 μ m孔径的聚乙烯或聚四氟乙烯筛板；
[0054] (3)弱阴离子色谱填料：600 μ L粒径为40-60 μ m弱阴离子色谱填料NH2