阴离子交换在线净化固相萃取整体柱的制备方法和用图
【专利摘要】一种阴离子交换在线净化固相萃取整体柱的制备方法及用途。所述整体柱是以甲基丙烯酸二甲氨乙酯为单体，甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂，正丙醇和PEG?400为致孔剂，偶氮二异丁腈为引发剂；经超声混合、脱气后灌入不锈钢管中密封，水浴55℃～65℃反应20～30小时，得到poly(DMAEMA?co?EDMA)整体柱。所述整体柱可用于蔬菜、水果中酸性农药的残留检测分析。该整体柱原位聚合在不锈钢的色谱柱能耐受一定的压力，可接入在线净化富集系统，实现固相萃取净化步骤的自动化。且制备方法简单，具有连续多孔结构，便于流动相的流出，使得传质阻力明显减小，比传统的填充萃取效率高、柱反压低；且能够重复使用。
【专利说明】
阴离子交换在线净化固相萃取整体柱的制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明属于分析化学领域。具体设及一种阴离子交换型在线净化固相萃取整体柱 特别是在不诱钢色谱柱中用甲基丙締酸二甲氨乙醋与乙二醇二甲基丙締酸醋的共聚反应 形成的聚合物整体柱、制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 整体柱作为一种迅速发展中的固相萃取新材料，其因为含有特殊的穿透孔结构， 使得整体柱材料本身具有良好渗透性，传质阻力小，提高了萃取效率，由于具有柱压低、传 质速度快和易于改性，可重复利用等优点，已经得到越来越多的应用，相对于填充型萃取柱 而言，使用整体柱不仅省去了繁琐的填装过程，并且整体柱中特有的穿透孔为液体的流动 提供了大孔通道，W对流传质取代了缓慢的扩散传质，使得传质阻力明显减小，因而有利于 萃取效率的提高。根据目标物的性质差异，通过单体的设计和选择，整体柱固相萃取的模式 可分为疏水(反相)作用、离子交换作用、亲和作用和亲水作用等。
[0003] 1998年，美国加州大学伯克利分校的Frechet研究组[1 ]首次将聚合物整体柱用于 固相萃取。通过优化反应物的比例，提高了目标物的萃取效率。自此，整体柱在固相萃取领 域应用广泛。Eisert等叫设计了管内固相微萃取与高效液相在线联用的装置山uang等W开 发了一种新型的聚合物整体柱微萃取(PMME)装置，用PMME-LC-MS联用测定了蜂蜜、牛奶和 鸡蛋中氯霉素的药物残留；Nie等[4]将有机聚合物整体柱引进管内SPME与HPLC在线联用技 术中，在毛细管中，W甲苯、十二醇为致孔剂，用热引发自由基共聚甲基丙締酸-乙締基二甲 基丙締酸醋，制备了毛细管整体柱;Baryla等W在毛细管进口端用光引发聚合制备了聚甲 基丙締酸醋整体柱，并用于在线富集屯、得安;Wang等W利用2-甲基-2-丙締酸-2-径乙基醋 憐酸醋化EMA)为单体和季戊四醇Ξ丙締酸醋(PETA)为交联剂制备poly(PETA-co-HEMA)整 体柱，用于对鸡蛋中的氣哇诺酬类物质、牛奶中的横胺类物质的检测。从W上应用可知，在 线净化整体柱W制备在毛细管中为主，运种整体柱的萃取容量W及耐压能力均较差，类型 也W反相吸附为主，具有离子交换作用的应用于高压液相系统的在线固相萃取整体柱还是 空白。
[0004] 在线固相萃取净化技术将富集净化后的样品直接洗脱至分离系统，有效地简化了 前处理操作步骤，避免了离线前处理操作中样品损失和遭受污染的风险，节约人力，减少试 剂消耗，目前自动化的检测方法在检测领域应用得越来越多。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是发展一种可重复使用的在线净化整体柱，克服现有食品残留分析前 处理步骤繁多、难W自动化的缺点，提供一种简单、快速和高自动化的样品前处理方法。尤 其是指在不诱钢色谱柱中用甲基丙締酸二甲氨乙醋(DMAEMA)为功能单体，甲基丙締酸乙二 醇醋化DM)为交联剂，通过原位聚合的方法制备阴离子交换整体柱及其制备方法。
[0006] 本发明利用该系列整体柱作为在线净化固相萃取整体柱，建立了简便快速的食品 (如蔬菜水果）中酸性农药残留的分析检测新方法。该整体柱选择性高，富集净化效果显著， 且可重复使用。
[0007]本发明技术方案：
[000引一种阴离子交换在线净化固相萃取整体柱的制备方法，包括如下步骤：
[0009] (1似甲基丙締酸二甲氨乙醋（DMAEMA)为单体，甲基丙締酸乙二醇醋化DMA)为交 联剂，正丙醇和阳G-400为致孔剂，偶氮二异下腊(AIBN)为引发剂；
[0010] (2)按反应物总体积1.25mL~2 . OmL计，取单体DMAEMA 3.7%~6.1 % (体积百分 比），加入交联剂抓MA16.7 %~20.0 % (体积百分比）、致孔剂70 %~80 % (体积百分比）， AIBNlOmg，超声混合、脱气；
[0011] (3)将步骤（2)混合均匀的液体灌入一端密封的不诱钢管中，然后再将另一端密 封;水浴55 °C-65 °C 反应20-30小时，得到 po ly (DMAEMA-CO-EDMA)整体柱；
[0012] (4)最后将步骤(3)合成的整体柱连接到高压累上，用甲醇冲去致孔剂和未反应的 单体，制得所述的整体柱，待用。
[OOU] 所述poly(DMAEMA-co-EDMA)整体柱可用于蔬菜水果中酸性农药的残留检测分析。
[0014] 本发明的优点和积极效果：
[0015] 1、本发明制得的阴离子交换在线净化整体柱是由甲基丙締酸二甲氨乙醋和甲基 丙締酸乙二醇醋共聚而成，甲基丙締酸二甲氨乙醋带有的氨基为聚合物骨架提供了与酸性 有机物相互作用的位点，而骨架本身还存在疏水作用，能够选择性的富集净化带有簇基的 有机化合物。
[0016] 2、该整体柱的制备方法简单，具有连续多孔结构，大量的孔隙便于流动相的流出， 使得传质阻力明显减小，比传统的填充萃取效率高、柱反压低。
[0017] 3、该整体柱原位聚合在不诱钢的色谱柱可耐受一定的压力，可很好的接入在线净 化富集系统，实现固相萃取净化步骤的自动化。
[001引4、该整体柱性质稳定、生物兼容性好、可W重复利用、选择性好，经试验证明，可应 用于酸性农药的在线净化分析。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明的整体柱截面的扫描电镜图；
[0020] 图2为实施分析检测食品中酸性农药的液相色谱串联质谱图。即空白苹果样品添 加的多反应监测色谱图，图中分析物为2-甲4-氯，2，4，5-T，氣草烟，化氣氯禾灵，Ξ氣簇草 酸和双草酸。
[0021] 图3为实施分析检测食品中酸性除草剂的液相色谱串联质谱图。即空白豆芽样品 添加的多反应监测色谱图，图中分析物为4-氯苯氧乙酸，1-糞乙酸，2,4-D和赤霉素。
【具体实施方式】
[0022] 下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
[0023] 实施例1 :ploy(DMAEMA-c〇-EDMA)整体柱的制备方法
[0024] (1)按反应物总体积（1.25mL)计，3.7 %单体DMAEMA，交联剂20 %抓MA，致孔剂 70%，引发剂偶氮二异下腊lOmg。在室溫下超声混合、脱气30min。
[0025] (2)将溶液灌注至干燥的不诱钢空柱管（10mmX2.1mm i.d.)中，两端密封，固定水 浴溫度55°C反应时间为30h进行整体柱的制备。并将反应完成后的整体柱接入到高效液相 色谱高压累，用甲醇冲洗该整体柱W除去未反应的单体和致孔剂，得到P〇ly(DMAEMA-c〇- EDM)整体柱，待用。
[0026] 实施例2: P1 oy (DMAEMA-CO-EDMA)整体柱的制备方法
[0027] (1)按反应物总体积(2.0血)计，6.1%单体DMAEMA，交联剂抓MA17%，致孔剂80%， 引发剂偶氮二异下腊lOmg。在室溫下超声混合、脱气30min。
[00%] (2)之后将溶液灌入不诱钢柱管中，两端密封，固定水浴溫度65°C反应时间为20h 进行整体柱的制备。并将反应完成后的整体柱接入到高效液相色谱高压累，用甲醇冲洗该 整体柱W除去未反应的单体和致孔剂得到poly(DMAEMA-co-EDMA)整体柱，待用。
[0029] 实施例3: W实施例1制备的整体柱为萃取介质，结合液相色谱串联质谱对水果中5 种酸性农药进行在线净化富集检测
[0030] 1样品处理
[0031] 准确称取鲜梨、苹果样品约lO.Og，置于50mL离屯、管中，加入乙腊lOmL，无水氯化钢 5g，1500化pm均质Imin，于5000rpm条件下离屯、5min，取上清液于50血离屯、管中。重复上述提 取过程两次，合并上清液，取ImL上清液，经0.22WI1微孔滤膜过滤，待测。
[00创 2测试条件
[0033] 2.1在线净化条件
[0034] 在线固相萃取条件分为4个部分:上样、淋洗、洗脱和条件化。
[0035] a)上样:上样累流动相A为5mmol/L乙酸锭水溶液，B为乙腊，C为丙酬/乙腊/异丙醇 (体积比为1:1:1)，D为1.5%甲酸-乙腊。实验采用5mmol/L乙酸锭水溶液作为上样流动相， 进样量为50化。样品经过poly (DMAEMA-CO-EDMA)在线固相萃取柱，目标分析物保留在净化 柱上。
[0036] b)淋洗:使用乙腊将基质中的一部分杂质冲洗下来排入废液，同时要确保目标化 合物仍然保留在固相萃取柱上。
[0037] C)洗脱：在洗脱过程中，采用1.5%甲酸-乙腊作为洗脱流动相，将目标化合物洗 脱，并通过六通阀转移至分析柱中进行分离分析。
[0038] d)条件化:最后的条件化分为两部分:在线固相萃取柱的冲洗及平衡，实验平衡流 动相与上样流动相一致，同时，洗脱累驱动分析流动相在分析柱上完成目标化合物的分离。
[0039] 色谱分离部分采用Agilent Eclipse Plus Ci8柱（150mmX4.6mm，5ym)为分析柱， 分析流动相E为乙腊，流动相F为0.002%的氨水溶液。其中在线净化过程中流动相梯度变化 每步采用瞬变模式，色谱分离过程每步的变化除表1中步骤4、步骤5、步骤6采用渐变模式外 其他步骤之间的转换均采用瞬变模式改变。在线净化过程见表1。
[0040] 表1.在线净化液相色谱串联质谱测定巧巾酸性农药的流动相梯度洗脱程序
[0041]
[0042]
[0043] a在线净化：（A)5mmol/L乙酸锭水溶液(B)乙腊(C)丙酬/乙腊/异丙醇(体积比为1: 1:1),(0)
[0044] 1.5%甲酸-乙腊溶液
[0045] b分离：巧）乙腊(f)〇.〇〇2%的氨水溶液。
[0046] 2.2质谱条件
[0047] 电喷雾离子源；多反应监测(Multiple reaction monito;ring，MRM)负离子扫描模 式;銷气压力，40unit;辅助气压力，30unit;离子源溫度:300°C ;电喷雾电压巧lectrospray Ionization,ESI): 2500V;表面诱导解离电压（Surface-induced dissociation,SID): 10V; 毛细管溫度:350°C ;Qi，化单位分辨率:化=0.7u、跑=0.7u;其他测定条件见表2。
[004引表2. 6种酸性农药的保留时间、母离子、子离子和裂解能量
[0049]
[(K)加]注:*定量离子。
[0化1 ] 3实验结果
[0052]对双草酸和化氣氯禾灵，方法在0 . l-20ng/mL范围内线性关系良好，对2，4，5-T， MCPA，Ξ氣簇草酸和氣草烟，方法在ο. 2-50ng/mL范围内线性关系良好，线性相关系数r均大 于0.997。巧中酸性农药在苹果和梨中的检出限和定量限分别是0.2-0.4和0.7-1.化g/kg，在 黄瓜中的检出限和定量限分别是0.4-0.8和1.3-2. ^ig/kg。
[0053] 食品中6种酸性农药的日内平均加标回收率在80.6%-115%，日内相对标准偏差 为5.1 %-13.5%。日间平均加标回收率在79.8%-113%，日间相对标准偏差为5.6%- 13.8%。
[0054] 在相同条件下，同一根poly(DMAEM-co-EDMA)整体柱在重复使用500次后，其背压 及萃取效率均无明显差异(RSD = 7.3% )。使用不同批次合成的整体柱对食品中酸性农药在 线净化前处理，在使用过程中未发现色谱柱柱压、出峰情况W及萃取效率上有明显的差异， W双草酸萃取量计算RSD，相同批次和不同批次合成的poly(DMAEMA-co-EDMA)整体柱对双 草酸萃取效率的RSD分别为8.7%和11.6%。结果说明该整体柱具有良好的机械强度、稳定 性和重现性。
[0055] 实施例4: W实施例2制备的整体柱为萃取介质对豆芽中植物生长调节剂的在线净 化检测
[0化6] 1样品处理
[0化7] 将豆芽绞碎混合均匀后，准确称取5.Og置于50血离屯、管中，加入10血乙腊，5g无水 氯化钢，于1500化pm均质Imin。提取液5000rpm条件下离屯、5min，取上清液于50mL离屯、管中。 重复上述提取过程两次，合并上清液，取ImL上清液经0.22WI1微孔滤膜过滤，待测。
[005引2测试条件 [0化9] 2.1在线净化
[0060] 表3.在线净化液相色谱串联质谱测定4种植物生长调节剂的流动相梯度洗脱程序
[0061]
[0062] a在线净化：（A)5mmol/L乙酸锭水溶液(B)乙腊(C)丙酬/乙腊/异丙醇(体积比为1: 1:1),(0)1.5%
[0063] 甲酸-乙腊溶液
[0064] b分离：（E)乙腊(F)〇.002%的氨水溶液。
[0065] 2.2质谱条件
[0066] 电喷雾离子源；多反应监测(Multiple reaction monitoring，MRM)负离子扫描模 式;銷气压力，40unit;辅助气压力，30unit;离子源溫度:250°C ;电喷雾电压(^Electrospray lonization,ESI):2500V;表面诱导解离电压（Source-induced dissociation，SID): 10V; 毛细管溫度:350°C ;Qi，化单位分辨率:0.7u。其他测定条件见表4。
[0067]表4 LC-MS/MS分析植物生长调节剂的保留时间、母离子、子离子和裂解能量
[006引
[0069] *定量离子。
[0070] 3实验结果
[0071] 通过豆芽加标样品分析，4-氯苯氧乙酸的检出限为1.化g/kg，定量限为3.扣g/kg， 赤霉素和2,4-二氯苯氧乙酸巧巾生长调节剂的检出限为1.扣g/kg，定量限为扣g/kg;l-糞乙 酸的检出限为2.扣g/kg，定量限为8.扣g/kg，完全能够满足中国、美国、日本等国家对4种生 长调节剂所规定的最大残留限量的测定要求。豆芽中4种生长调节剂的平均加标回收率在 75.0%-93.3%，日内相对标准偏差为4.5%-9.1 %，日间相对标准偏差为5.6%-10.2%。
[0072] 参考文献
[0073] [1]Xie S,Svec F,Frechet JMJ.Porous polymer monoliths:Preparation of sorbent materials with high-surface areas and controlled surface chemistry for high-throughput.online,solid-ph曰se extraction ofpol曰r org曰nic compounds [J].Chem.Mater，1998，10:4072-4078.
[0074] [2]Luo YB,Feng Y Q. Stir rod sorpive with monolithic polymer as CO曰ting 曰nd its 曰pplic曰tion to the 曰n曰lysis of fluoroquinoloness in honey sample[J].J.Qiromatogr.A.2010,1217:3583-3589.
[0075] [3]魏远隆，邹娟娟，杨长龙，张庆合，张维冰，王风云，李形.聚合物整体固定相的 制备及条件优化[J].色谱，2005，23(4): 251-255.
[0076] [4]Hoegger D,Freitag R.Acrylamide-based monoliths as robust stationary phase for capillary e1ectrochromatography[J].J.Chromatogr.A,2009, 914:211-222.
[0077] [5]Hierten S,Mohammad J,Nakazato K.Improment in flow properties and ph stability of compressed,eontinuous polymer beds for high-performance[J] .J. Qiromatogr. A,2009,646:121-128.
[0078] [6]Jun邑bauer A,Hahn R.Polymethacrylate monoliths for preparative and industral separation of biomolecular assemblies!! J]. J. Chromatogr .A, 2008,1184: 62-79.
【主权项】
1. 一种阴离子交换在线净化固相萃取整体柱的制备方法，包括如下步骤： (1)以甲基丙烯酸二甲氨乙酯(DMAEMA)为单体，甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)为交联剂， 正丙醇和PEG-400为混合致孔剂，偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂； (2 )按反应物总体积1 . 2 5mL~2 . OmL计，取单体DMAEMA 3.7 %~6 . 1 %、交联剂 EDMA16.7 %~20.0 %、致孔剂70 %~80 %，AIBN 10mg，超声混合、脱气； (3) 将步骤(2)混合均匀的液体灌入一端密封的不锈钢管中，然后再将另一端密封;水 浴55 °C~65 °C反应20~30小时，得到po ly (DMAEMA-co-EDMA)整体柱； (4) 最后将步骤（3)合成的整体柱连接到高压栗上，用甲醇冲去致孔剂和未反应的单 体，制得所述的整体柱，待用。2. 权利要求1所述的阴离子交换在线净化固相萃取整体柱的用途，用于蔬菜水果中酸 性农药的残留检测分析。
【文档编号】G01N30/06GK105964310SQ201610278787
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】艾连峰, 王曼曼
【申请人】河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心