本发明涉及一种转基因水稻、玉米、棉花、大豆等作物的谷物散粮及其粗加工产品中的蛋白BT-CrylAb/Ac的检测试纸中单克隆抗体的胶体碳标记方法，属于转基因检测领域。
背景技术：
随着各种各样的转基因食品大量涌入市场，转基因食品的安全性日益备受关注，世界各国对转基因食品的安全性存在较大的争议。欧盟，日本等地区已制定相关法规对转基因食品进行严格的管理。因此，快速检测转基因作物/植物中转基因蛋白的方法具有重要的意义。
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性菌，广泛存在于土壤、尘埃、水域、沙漠、植物、昆虫尸体中。二十世纪50年代，人们发现Bt菌的杀虫活性与其伴胞晶体有关，并证实这种伴胞晶体由蛋白质组成(包括CrylAb，CrylC等)，通常被称作杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)。这种蛋白亦成为如今抗虫转基因作物中最为常用的抗虫蛋白质之一。
在检测蛋白BT-CrylAb/Ac时，目前检测试纸采用胶体金标记，而胶体金制备比较困难，黑白信噪比更低，且红白对照不易辨别且易受全血检测的影响，易出现的HOOK效应，不稳定不易保存，且成本较高。
技术实现要素：
针对上述情况，本发明提供一种单克隆抗体的胶体碳标记方法，胶体碳较胶体金更易制备，胶体碳黑白信噪比更高，而红白对照易辨别且不易受全血检测的影响；检测动力学范围更广，大大降低了胶体金易出现的HOOK效应的可能性；较胶体金更稳定，可于室温下保存更久；固态碳对环境友好，避免了胶体金技术出现的环境重金属污染的情况；另外，碳来源广泛，价格低廉，而金属于稀有金属，来源受限，价格昂贵。采用单克隆抗体的胶体碳标记方法克服了胶体金技术的众多缺点，胶体碳可成为胶体金的完美替代。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种单克隆抗体的胶体碳标记方法，包括以下步骤：
A制备胶体碳纳米颗粒；
B胶体碳最适PH值确定；
C向800ul的0.02M硼酸缓冲液中加入100ul的抗Bt-CrylAb/Ac的单克隆抗体M03(购买于华葵金配公司，1mg/ml))，涡旋振荡(购买于其林贝尔公司，QL-901)1分钟混匀；
D向步骤C制得的混合液中加入20ul 1.5％(质量体积比)EDC溶液，于室温条件下盘旋式摇晃(购买于其林贝尔公司，KB-3-D型)20分钟；
E向步骤D制得的混合液中加入150～300ul的胶体碳纳米颗粒，于恒温摇床中300转，20～30℃放置1.5～3小时；
F向步骤E制得的混合液中加入100ul含20％BSA的硼酸缓冲液，继续于恒温摇床中300转，20～30℃放置4～8小时；
G将步骤F制得的混合液放于12000g的离心机离心20分钟，留取沉淀，用0.02M硼酸缓冲液反复重新悬浮、离心、洗涤3～6次；
H最终将1ml的0.02M硼酸盐缓冲液重悬沉淀并于超声破碎仪中，超声分散；即得胶体碳标记的Bt-CrylAb/Ac抗体。
优选的，步骤G中0.02M硼酸缓冲液反复重新悬浮、离心、洗涤4次。
优选的，步骤E中混合液中加入胶体碳纳米颗粒200ul。
优选的，步骤E中混合液在恒温摇床反应温度为25℃，放置2小时。
优选的，步骤F中混合液在恒温摇床反应温度为25℃，放置5小时。
优选的，步骤H中超声破碎仪采用宁波新芝超声波细胞粉碎机，设备型号Scientz-IID。
优选的，步骤H中超声分散超声波分散机采用超声变幅杆直径6毫米，输出功率60％，超声开时3秒，关时3秒，总时长5分钟。
本发明的优点是：相对胶体金标记的Bt-CrylAb/Ac抗体来说，胶体碳标记的Bt-CrylAb/Ac抗体在样本中的抗原在侧向移动的过程中与胶体碳标记的特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物，继续向前方流动和硝酸纤维素膜检测线上特异性抗体结合形成双抗体夹心复合物进而形成肉眼可见的条带而进 行结果的判定。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，进一步阐述本发明。
一种单克隆抗体的胶体碳标记方法，包括以下步骤：
A制备胶体碳纳米颗粒；
B胶体碳最适PH值确定；
C向800ul的0.02M硼酸缓冲液中加入100ul的抗Bt-CrylAb/Ac的单克隆抗体M03(购买于华葵金配公司，1mg/ml))，涡旋振荡(购买于其林贝尔公司，QL-901)1分钟混匀；
D向步骤C制得的混合液中加入20ul 1.5％(质量体积比)EDC溶液，于室温条件下盘旋式摇晃(购买于其林贝尔公司，KB-3-D型)20分钟；
E向步骤D制得的混合液中加入150～300ul的胶体碳纳米颗粒，于恒温摇床中300转，20～30℃放置1.5～3小时；
F向步骤E制得的混合液中加入100ul含20％BSA的硼酸缓冲液，继续于恒温摇床中300转，20～30℃放置4～8小时；
G将步骤F制得的混合液放于12000g的离心机离心20分钟，留取沉淀，用0.02M硼酸缓冲液反复重新悬浮、离心、洗涤3～6次；
H最终将1ml的0.02M硼酸盐缓冲液重悬沉淀并于超声破碎仪中，超声分散；即得胶体碳标记的Bt-CrylAb/Ac抗体。
优选的，步骤G中0.02M硼酸缓冲液反复重新悬浮、离心、洗涤4次。
优选的，步骤E中混合液中加入200ul胶体碳纳米颗粒200ul。
优选的，步骤E中混合液在恒温摇床反应温度为25℃，放置2小时。
优选的，步骤F中混合液在恒温摇床反应温度为25℃，放置5小时。
优选的，步骤H中超声破碎仪采用宁波新芝超声波细胞粉碎机，设备型号Scientz-IID。
优选的，步骤H中超声分散超声波分散机采用超声变幅杆直径6毫米，输出功率60％，超声开时3秒，关时3秒，总时长5分钟。
作为优选实施例，步骤A制备胶体碳纳米颗粒具体为：
1、向100g碳粉中加入超纯水，定容至500ml，搅拌溶解30分钟后离心(12000g，30分钟)，收集上清于干净的烧杯中；
2、向步骤1的溶液中加入0.5g十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)，并定容至500ml，即溶液中碳粉的终浓度(质量体积比)为20％，CTAB的终浓度(质量体积比)为0.1％；
3、将步骤2所得溶液进行超声破碎：超声变幅杆Φ6，输出功率60％，超声开时3秒，关时3秒，总时长5分钟(宁波新芝超声波细胞粉碎机，Scientz-IID)，使之成为悬浮状的胶体碳纳米颗粒溶液；电镜下观察，颗粒直径覆盖范围由数十纳米至数百纳米不等；
4、向步骤3所得溶液中加入100ml的无水乙醇，充分搅匀后，加入10ml硅烷化试剂(购于Thermo公司，货号48927)，搅拌速度200转/分钟，通入氮气情况下，55℃反应8小时；待反应结束后，用无水乙醇清洗3～5次，然后再用0.02M PBS(PH7.4)缓冲液洗涤3～5次，至此，制备完成表面带有游离氨基基团的胶体碳纳米颗粒。
作为优选实施例，胶体碳最适PH值确定方法：
向一系列不同PH值梯度的硼酸盐缓冲液中先后加入0.1％纳米碳悬液及0.1％TritonX-100。超声处理(300W，超声6秒停4秒，工作80个循环)上述混合液后，200rpm离心10分钟，收集上清并静置24小时后，观察无沉淀者即为最适PH值。本发明中，PH9时，胶体碳最为稳定，无沉淀，因此PH 9作为标记抗体最适PH值。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。