头孢美唑酸的中间体S-氰甲基异硫脲的分析方法与流程

本发明属于药物分析领域，具体而言，本发明涉及一种采用HPLC（高效液相色谱）测定头孢美唑酸化合物中间体S-氰甲基异硫脲及其有关物质的化学分析方法。
背景技术：
：S-氰甲基异硫脲为合成的化学中间体，可用于合成头孢美唑酸等化合物。其合成路线为由硫脲（i）和氯乙腈（ii）反应制得S-氰甲基异硫脲（iii），经结晶提纯后制得S-氰甲基异硫脲成品，并进一步用于其他用途，例如可作为合成头孢美唑酸的中间体等。S-氰甲基异硫脲的合成路线如下所示。其中，2,4-二氨基噻唑（iv）为反应副产物，同时也是S-氰甲基异硫脲的主要降解产物。在头孢美唑酸合成过程中，需要测定S-氰甲基异硫脲的准确含量，以提高投料的准确性。S-氰甲基异硫脲、起始物料硫脲及2,4-二氨基噻唑极性较强，难以进行分离，S-氰甲基异硫脲与2,4-二氨基噻唑色谱行为相似，一般的反相色谱难以对其进行分离测定。此外，S-氰甲基异硫脲、硫脲及2,4-二氨基噻唑在有机溶剂中的溶解性较差，在水溶液中的溶解性较好，但在水溶液中S-氰甲基异硫脲会快速转变为2,4-二氨基噻唑，稳定性很差。目前，尚无文献报道S-氰甲基异硫脲的质量控制情况，对其测定分析亦无文献资料可循。为解决上述问题，发明人提供了一种测定方法，可以同时准确测定上述三种化合物。此法既解决了三者的色谱分离问题，也解决了S-氰甲基异硫脲在水溶液中的不稳定的问题，可用于测定合成S-氰甲基异硫脲时反应液中S-氰甲基异硫脲、硫脲和2,4-二氨基噻唑的含量，以判断合成S-氰甲基异硫脲时的反应进程，也可以用来测定S-氰甲基异硫脲成品中的硫脲及2,4-二氨基噻唑的含量，以及除硫脲及2,4-二氨基噻唑以外的其他杂质，进而评估所制备的S-氰甲基异硫脲的质量。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种检测S-氰甲基异硫脲的方法，该方法可同时测定反应液中的S-氰甲基异硫脲、硫脲和2,4-二氨基噻唑的含量，以及测定S-氰甲基异硫脲成品的含量和有关物质。本发明的目的可以通过以下技术方案实现，具体如下：（1）检测条件色谱柱以辛烷基键合硅胶为填充剂；以pH为2.0~3.0的磷酸盐缓冲液（磷酸二氢钾浓度为0.1mol/L，离子对试剂浓度为0.005mol/L~0.015mol/L，用磷酸调节pH）为流动相A，以乙腈、甲醇或二者的混合物为流动相B；流动相A与流动相B的体积比为85~95∶5~15；流速为0.7ml~1.3ml/min；柱温为20-40℃；检测波长为200nm~240nm。其中，所述离子对试剂选自戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠。（2）溶液的配制1）供试品溶液1：取制备S-氰甲基异硫脲的反应液适量，用稀释剂溶解并稀释制成每1ml含S-氰甲基异硫脲约0.01mg~1mg的溶液，即得。2）供试品溶液2：取S-氰甲基异硫脲供试品适量，用稀释剂溶解并稀释制成每1ml含S-氰甲基异硫脲约0.01mg~1mg的溶液，即得。3）对照品溶液：取S-氰甲基异硫脲、硫脲及2,4-二氨基噻唑对照品适量，用稀释剂溶解并稀释制成每1ml含各组分约0.01mg~1mg的溶液，即得。其中，所述稀释剂选自pH不大于3的缓冲液或酸溶液，优选为流动相或0.01mol/L~1mol/L的盐酸溶液。优选地，所述的高效液相色谱法的色谱条件为：以辛烷基键合硅胶为填充剂；以pH2.5的磷酸盐缓冲液（取庚烷磺酸钠2.2g，磷酸二氢钾13.6g，加水稀释至1000ml，混匀，用磷酸调节pH至2.5，抽滤，即得）-乙腈（90:10）为流动相；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为210nm；进样量为10μl；稀释剂为流动相，进行有关物质检查时供试品溶液的浓度以S-氰甲基异硫脲计为1mg/ml，进行含量测定时供试品溶液的浓度为0.1mg/ml。本发明人经过大量的实验研究，开发出了本发明提供的检测方法，其优点在于：（1）专属性好，灵敏度高。选用等度洗脱，色谱峰信号的基线良好；在选定的流动相条件下，各色谱峰得到良好的分离，专属性良好；在选定的波长下，各组分紫外吸收强，响应高，检测灵敏度高。（2）分析时间短，分离度好。由于多氨基的存在，硫脲、S-氰甲基异硫脲及2,4-二氨基噻唑极性很强，其色谱分离亦存在较大困难。在发明人选定的色谱条件下，仅采用等度洗脱，运行时间约10min，即可使难分离的化合物得到分离。（3）解决了待测组分在有机溶剂中溶解性不佳，在水溶液中稳定性较差的问题，使各组分可以得到准确测定。（4）可用于合成S-氰甲基异硫脲时的反应液中各组分的测定。在该法下，可定量检测反应液中起始物料硫脲含量，以判断反应进程。（5）可用于S-氰甲基异硫脲的质量控制。在本法下，可以检测S-氰甲基异硫脲的含量及有关物质，进而评估其质量。（6）此外，本方法还可用于检测头孢美唑酸、头孢美唑钠或注射用头孢美唑钠中的杂质硫脲、S-氰甲基异硫脲及2,4-二氨基噻唑的含量，可以更好的控制药品质量，保证用药安全。附图说明附图1发明实施例5硫脲、S-氰甲基异硫脲、2,4-二氨基噻唑对照品溶液色谱图附图2发明实施例6制备S-氰甲基异硫脲的反应液的色谱图附图3发明实施例7S-氰甲基异硫脲有关物质测定供试品溶液色谱图具体实施方式以下通过对本发明具体实施方式的描述说明，但不限制本发明。实施例1色谱条件的选择检测波长：210nm流动相流速：1ml/min柱温：30℃pH2.5的磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钾13.6g，加水稀释至1000ml，混匀，用磷酸调节pH至2.5，抽滤，即得。pH2.5的磷酸盐缓冲液-0.01mol/L庚烷磺酸钠：取庚烷磺酸钠2.2g，磷酸二氢钾13.6g，加水稀释至1000ml，混匀，用磷酸调节pH至2.5，抽滤，即得。供试品溶液：取硫脲、S-氰甲基异硫脲、2,4-二氨基噻唑适量，用0.5mol/L盐酸溶液配制成含各组分约为0.1mg/ml的混合溶液，即得。精密量取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，对色谱条件进行初步筛选，以S-氰甲基异硫脲与2,4-二氨基噻唑的分离情况为判断指标。结果见表1。表1色谱分离体系的初筛结果上述结果表明，使用不含离子对试剂的流动相体系，即使水相比例达到99%，各目标物仍难以分离。而当在流动相中添加阴离子离子对试剂庚烷磺酸钠后，待测组分可得到分离。基于表1所取得的结果，确定基本的色谱分离条件如下：色谱柱为C8柱，流动相为pH2.5的磷酸盐缓冲液（含0.01mol/L庚烷磺酸钠）-乙腈（90:10）；柱温为30℃；流速为1ml/min；进样量为10μl；检测波长为210nm。在基本的色谱条件下，对色谱条件的参数调整范围进行试验，结果如下。（1）其他色谱条件不变，调整缓冲盐与乙腈的比例为85:15、90:10和95:5，观察分离度，结果表明S-氰甲基异硫脲、2,4-二氨基噻唑、硫脲分离良好，与其他未知杂质峰的分离度也符合要求，分离度均大于1.5。（2）其他色谱条件不变，调整水相pH分别为2.0、2.5、和3.0，流动相比例为缓冲盐-有机相（90:10），观察分离度，结果表明S-氰甲基异硫脲、2,4-二氨基噻唑、硫脲分离良好，与其他未知杂质峰的分离度也符合要求，分离度均大于1.5。（3）其他色谱条件不变，调整庚烷磺酸钠的浓度为0.005mol/L、0.008mol/L、0.01mol/L、0.012和0.015mol/L，观察分离度，结果表明S-氰甲基异硫脲、2,4-二氨基噻唑、硫脲分离良好，与其他未知杂质峰的分离度也符合要求，分离度均大于1.5。（4）其他色谱条件不变，调整离子对试剂的类型，分别为戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠和辛烷磺酸钠作为离子对试剂，观察分离度，结果表明S-氰甲基异硫脲、2,4-二氨基噻唑、硫脲分离良好，与其他未知杂质峰的分离度也符合要求，分离度均大于1.5。根据上述考察结果，缓冲盐-有机相比例在85~95∶5~15之间、水相pH范围在2.0~3.0之间、离子对试剂浓度在0.005mol/L~0.015mol/L范围内、采用特定的阴离子离子对试剂，均可得到满意的分离效果，S-氰甲基异硫脲、2,4-二氨基噻唑、硫脲分离良好，与其他未知杂质峰的分离度也符合要求，分离度均大于1.5。实施例2样品配制方式的确定（稀释剂，样品浓度）流动相：庚烷磺酸钠-磷酸盐缓冲液（取庚烷磺酸钠2.2g，磷酸二氢钾13.6g，加水稀释至1000ml，混匀，用磷酸调节pH至2.5，抽滤，即得）-乙腈（90:10）色谱柱：AgilentXDBC8，4.6×250mm，5μm流速：1.0ml/min；进样量：10μl；检测波长：210nm；柱温：30℃稀释剂：水、0.001mol/L盐酸溶液、1mol/L盐酸溶液，流动相（缓冲盐：乙腈=90:10）分别取硫脲、S-氰甲基异硫脲、2,4-二氨基噻唑适量，分别以上述稀释剂配制成硫脲对照品溶液（约0.1mg/ml）、S-氰甲基异硫脲对照品溶液（约0.1mg/ml）和2,4-二氨基噻唑对照品溶液（约0.1mg/ml），分别于0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h进样分析，以各时间点的峰面积与0h峰面积的比值（%）作为稳定性数据，考察溶液的稳定性。结果见表2。表2稳定性结果*：转化为2,4-二氨基噻唑上述结果表明，S-氰甲基异硫脲在水溶液中不稳定，快速转化为2,4-二氨基噻唑，而在pH不大于3.0的范围内可以保持稳定，优选采用流动相为稀释剂。实施例3检测波长的选择色谱条件同实施例2。稀释剂：流动相分别取硫脲、2,4-二氨基噻唑、S-氰甲基异硫脲对照品适量，以流动相溶解并制成含各组分0.1mg/ml的混合溶液，作为供试品溶液，进样分析，采用二极管陈列检测器（PDA）进行检测，并在190nm~400nm内做紫外光谱扫描，得到各组分的紫外吸收光谱，结果如表3所示。根据各组分紫外吸收光谱，选择检测波长范围为200nm~240nm，兼顾各个组分的吸收情况及溶剂的截止波长，波长优选为210nm。表3各组分吸收峰硫脲2,4-二氨基噻唑S-氰甲基异硫脲吸收峰197nm，237nm231nm，261nm208nm实施例4灵敏度试验色谱条件同实施例2。溶液的配制：取硫脲、2,4-二氨基噻唑、S-氰甲基异硫脲对照品适量，用流动相配制成含各组分约0.1μg/ml和0.3μg/ml的溶液，分别作为检测限溶液和定量限溶液，进样分析，记录色谱图，记录峰面积，计算各组份的信噪比。结果见表4。表4灵敏度试验结果结果表明，本法灵敏度良好。实施例5线性试验色谱条件同实施例2。溶液的配制：取硫脲、2,4-二氨基噻唑、S-氰甲基异硫脲对照品适量，用流动相配制成含各组分约0.3μg/ml~1.0mg/ml的溶液，作为线性溶液，进样分析，记录色谱图，记录峰面积，以峰面积对浓度作图，结果见表5。表5线性试验结果表明，各组分在0.3μg/ml~1mg/ml范围内线性良好。实施例6反应液中的含量测定制备S-氰甲基异硫脲的反应液：取硫脲10g，氯乙腈12g，置1000ml丙酮中，加入盐酸1ml，室温搅拌，即得反应液。色谱条件同实施例2。溶液的配制：取反应液1ml，置10ml量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。另取硫脲及S-氰甲基异硫脲对照品各约10mg，精密称定，至10ml量瓶中，用流动相溶解并定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液。取上述溶液进样分析，按外标法计算供试品溶液中硫脲及S-氰甲基异硫脲的浓度，计算转化率。其中，上述各浓度按供试品溶液中的浓度计算。结果见表6。表6反应液中硫脲测得浓度由表6数据可以看出，本方法可用于合成S-氰甲基异硫脲时的反应监控，以控制反应进程。实施例7S-氰甲基异硫脲有关物质测定S-氰甲基异硫脲的制备：取硫脲10g，氯乙腈12g，置1000ml丙酮中，加入盐酸1ml，室温搅拌，将得到的固体过滤，并用丙酮洗涤，真空干燥，抽去有机试剂，即得。色谱条件同实施例2。溶液的配制：取本品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，用流动相溶解并定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液，精密移取1ml置100ml量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，即得对照溶液。另取硫脲对照品及2,4-二氨基噻唑对照品适量，以流动相溶解并定量配制成含各组分浓度约为0.01mg/ml的溶液，即得杂质对照溶液。取上述溶液进样分析，参照中国药典2010年版二部附录VD，按外标法计算硫脲及2,4-二氨基噻唑的含量，按自身对照法计算其他未知杂质的量及其他杂质的总量。结果见表7。表7S-氰甲基异硫脲有关物质测定结果由表7可以看出，本方法可以用来检测S-氰甲基异硫脲中间体中已知杂质与未知杂质的含量，以控制中间体的质量。当前第1页1 2 3