一种低共熔溶剂萃取液相色谱法快速测定罗丹明B的方法与流程

本发明属于食品中非食用色素检测技术领域，尤其涉及一种低共熔溶剂萃取液相色谱法快速测定罗丹明B的方法。

背景技术：

罗丹明B又名碱性玫瑰精、花粉红，是一种人工合成的氧杂蒽类荧光染料，主要用于造纸工业染蜡光纸、打字纸、有光纸等，在有色玻璃、特色烟花爆竹等行业也有应用。由于罗丹明B比其它食用水溶性染料更易于在火锅底料、辣椒粉、调味油等上染色，且不易褪色、成本低，因此一些不法商贩用罗丹明染料对这些食品进行染色，以次充好。国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)化学品致癌风险评价表明：摄取、吸入以及皮肤接触罗丹明B，均会造成急性或慢性的中毒伤害。动物实验表明，罗丹明B有致癌作用，可能引起诱变或致畸。中国卫生部将其列于《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单(第1批)》中，禁止其在食品中使用，欧美等国家已明令禁止罗丹明B用于食品加工中。然而，近年来，在政府加大对非法食品添加色素苏丹红的打击力度之后，食品中违法添加罗丹明B的情况更加突出。目前，我国尚无检测食品中罗丹明B的国家标准，常用的检测方法则是2010年颁布的出入境检验检疫行业标准SN/T 2430-2010，但该方法在检测辣椒油的过程中，需要凝胶色谱净化系统进行样品前处理，过程复杂，成本高，耗时长。

技术实现要素：

针对以上技术问题，本发明公开了一种低共熔溶剂萃取液相色谱法快速测定罗丹明B的方法，该方法操作简单，检测快速、成本低廉。

对此，本发明采用的技术方案为：

一种低共熔溶剂萃取液相色谱法快速测定罗丹明B的方法，其包括以下步骤：

步骤S1：配制罗丹明B的溶液，并稀释成不同浓度的罗丹明B标准工作液，分别采用液相色谱仪进行检测得到不同浓度的罗丹明B标准工作液的液相色谱图；根据液相色谱图的峰面积和对应的浓度制作校正曲线；

步骤S2：制备低共熔溶剂，所述低共熔溶剂包括氢键受体化合物和氢键供体化合物；

步骤S3：称取调味油样品，加入步骤S2中所述低共熔溶剂和烷烃试剂，进行萃取，离心后去除上面的油层，剩余物用烷烃洗涤后采用液相色谱仪进行检测得到样品的色谱图；其中，所述低共熔溶剂和烷烃试剂的体积比大于0.0025；

步骤S4：将样品的色谱图与标准工作液的色谱图进行比较确定是否含有罗丹明B，再根据样品的色谱图峰面积所对应的标准曲线上的浓度确定样品中罗丹明B的含量。

采用此技术方案，利用低共熔溶剂提取调味油样品中的罗丹明B，烷烃类试剂除油除杂，再将低共熔溶剂上机检测，实现了快速检测，步骤简单，无需复杂的样品前处理过程，减少了溶剂的使用，同时又除去了调味油中复杂基质的干扰，保证了检测结果的准确性。

作为本发明的进一步改进，所述氢键受体化合物为季胺盐，所述氢键供体化合物为丙三醇和乙二醇中的至少一种，所述氢键受体化合物与氢键供体化合物的摩尔比为1：(1～3)。

所述低共熔溶剂的用量按照每克调味油样品0.05～5.0mL。

作为本发明的进一步改进，所述季胺盐为氯化胆碱，所述氯化胆碱与所述氢键供体化合物的摩尔比为1:1、1:2或1:3。

作为本发明的进一步改进，所述氢键供体化合物为丙三醇。

作为本发明的进一步改进，所述烷烃试剂为脂肪族试剂；进一步的，所述烷烃试剂包括正己烷、环己烷、辛烷、庚烷中的至少一种。

作为本发明的进一步改进，所述低共熔溶剂和烷烃试剂的体积比为0.5～5。

作为本发明的进一步改进，所述烷烃试剂为正己烷或正庚烷。

作为本发明的进一步改进，步骤S3中，所述萃取的方式为摇床震荡提取或超声波提取，所述提取温度为10-50℃。进一步优选的，所述萃取的方式为摇床震荡提取。

作为本发明的进一步改进，步骤S3中，剩余物用烷烃洗涤除去残留的油，然后将低共熔溶剂直接上机或者定容到所需要的体积后上机检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

第一，本发明的技术方案，实用性强，对于辣椒油、番椒油、胭脂树橙油等粘度大，基质复杂的调味油样品，均可以进行罗丹明B的准确检测。

第二，本发明的技术方案操作简单、成本低，本发明仅需要简单的样品提取过程，不需要复杂的前处理过程，提取所用的低共熔溶剂可以节省有机溶剂的使用，大大降低了实验成本。

第三，本发明的技术方案检测快速，由于本方法可以节省样品前处理时间，大大缩短了调味油中罗丹明B检测所需要的时间。

第四，加标回收率高，检出限低，低共熔溶剂可以有效的从调味油中提取罗丹明B，同时烷烃类试剂可以除去复杂的油基质，避免杂质干扰，因此能够保证足够高的回收率和较低的检出限，回收率在75.2％-105％，检出限可达2.5μg/kg。

附图说明

图1是本发明一种实施例的罗丹明B含量为5.0μg/L的标准溶液的荧光色谱图。

图2是本发明一种实施例罗丹明B标准工作液校正曲线。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的材料、试剂、仪器设备等，如无特殊说明，均为商业可得。

甲醇：色谱纯，购于默克公司；正己烷：色谱纯，购于默克公司；正庚烷：色谱纯，购于默克公司；氯化胆碱：分析纯，阿拉丁；丙三醇：分析纯，上海凌峰；水为超纯水。

罗丹明B标准品：纯度95.00％，购自Dr.Ehrenstorfer。

超高效液相色谱仪：配备四元梯度泵，脱气装置，微量进样器，荧光检测器。

液相色谱条件参数如下：

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm，2.1×50mm

柱温：25℃

检测器激发波长：550nm

检测器发射波长：580nm

流动相的具体情况如表1所示。

表1

按照以下步骤进行检测：

步骤S1：先配制罗丹明B的溶液，并稀释成不同浓度的罗丹明B标准工作液，分别采用液相色谱仪进行检测得到不同浓度的罗丹明B标准工作液的液相色谱图；根据液相色谱图的峰面积和对应的浓度制作校正曲线；罗丹明B含量为5.0μg/L的标准溶液的荧光色谱图如图1所示；罗丹明B标准工作液校正曲线如图2所示。

步骤S2：低共熔溶剂DES-1的制备：称取20g氯化胆碱和13.19g的丙三醇于100mL反应瓶中，升温到90℃并搅拌至澄清为止，冷却至室温备用。

低共熔溶剂DES-2的制备：称取20g氯化胆碱和26.38g的丙三醇于100mL反应瓶中，升温到90℃并搅拌至澄清为止，冷却至室温备用。

低共熔溶剂DES-3的制备：称取20g氯化胆碱和39.57g的丙三醇于100mL反应瓶中，升温到90℃并搅拌至澄清为止，冷却至室温备用。

步骤S3：称取调味油样品，加入步骤S2中所述低共熔溶剂和烷烃试剂，进行萃取，离心后去除上面的油层，剩余物用烷烃洗涤后采用液相色谱仪进行检测得到样品的色谱图；其中，所述低共熔溶剂和烷烃试剂的体积比大于0.0025；

步骤S4：将样品的色谱图与标准工作液的色谱图进行比较确定是否含有罗丹明B，再根据样品的色谱图峰面积所对应的标准曲线上的浓度确定样品中罗丹明B的含量。

实施例1

样品：称取辣椒油1g于15mL离心管中，加入1.0mL低共熔溶剂DES-1和5mL正己烷，摇床震荡提取10分钟，7500r/min离心2分钟，用塑料吸管吸取上面的油层弃去，再加入5mL正己烷，震荡洗涤1分钟，7500r/min离心2分钟，上面的油层用塑料吸管吸走弃去。残留的低共熔溶剂DES-1部分用甲醇定容至5.0mL，涡旋混匀，过0.22μm有机滤膜，上机测试。

加标样品：称取辣椒油1g于15mL离心管中，添加罗丹明B的浓度水平为5.0μg/kg，分别制作6个加标样品。在加标样品中分别加入1.0mL低共熔溶剂DES-1和5mL正己烷，摇床震荡提取10分钟，提取温度10℃，7500r/min离心2分钟，用塑料吸管吸取上面的油层弃去，再加入5mL正己烷，震荡洗涤1分钟，7500r/min离心2分钟，上面的油层用塑料吸管吸走弃去。残留的低共熔溶剂DES-1部分用甲醇定容至5.0mL，涡旋混匀，过0.22μm有机滤膜，上机测试。

将样品的色谱图与标准工作液的色谱图进行比较确定是否含有罗丹明B，再根据样品的色谱图峰面积所对应的标准曲线上的浓度确定样品中罗丹明B的含量，得到的结果如表2所示。

表2实施例1的检测结果表

其中，RSD为相对标准偏差(relative standard deviation)。

实施例2

样品：称取番椒油1g于15mL离心管中，加入0.6mL低共熔溶剂DES-2和6mL正庚烷，摇床震荡提取15分钟，7500r/min离心3分钟，用塑料吸管吸取上面的油层弃去，再加入5mL正庚烷，震荡洗涤1分钟，7500r/min离心2分钟，上面的油层用塑料吸管吸走弃去。残留的低共熔溶剂DES-2部分用甲醇定容至5.0mL，涡旋混匀，过0.22μm有机滤膜，上机测试。

加标样品：称取番椒油1g于15mL离心管中，添加罗丹明B的浓度水平为5.0μg/kg，分别制作6个加标样品。在加标样品中分别加入0.6mL低共熔溶剂DES-2和6mL正庚烷，摇床震荡提取15分钟，提取温度30℃，7500r/min离心3分钟，用塑料吸管吸取上面的油层弃去，再加入5mL正庚烷，震荡洗涤1分钟，7500r/min离心2分钟，上面的油层用塑料吸管吸走弃去。残留的低共熔溶剂DES-2部分用甲醇定容至5.0mL，涡旋混匀，过0.22μm有机滤膜，上机测试。

将样品的色谱图与标准工作液的色谱图进行比较确定是否含有罗丹明B，再根据样品的色谱图峰面积所对应的标准曲线上的浓度确定样品中罗丹明B的含量，得到的结果如表3所示。

表3实施例2的检测结果表

实施例3

样品：称取胭脂树橙油1g于15mL离心管中，加入0.5mL低共熔溶剂DES-3和10mL正庚烷，摇床震荡提取20分钟，7500r/min离心2分钟，用塑料吸管吸取上面的油层弃去，再加入6mL正庚烷，震荡洗涤1分钟，7500r/min离心2分钟，上面的油层用塑料吸管吸走弃去。残留的低共熔溶剂DES-3部分用甲醇定容至5.0mL，涡旋混匀，过0.22μm有机滤膜，上机测试。

加标样品：称取胭脂树橙油1g于15mL离心管中，添加罗丹明B的浓度水平为5.0μg/kg，分别制作6个加标样品。在加标样品中分别加入0.5mL低共熔溶剂DES-3和10mL正庚烷，摇床震荡提取20分钟，提取温度50℃，7500r/min离心2分钟，用塑料吸管吸取上面的油层弃去，再加入6mL正庚烷，震荡洗涤1分钟，7500r/min离心2分钟，上面的油层用塑料吸管吸走弃去。残留的低共熔溶剂DES-3部分用甲醇定容至5.0mL，涡旋混匀，过0.22μm有机滤膜，上机测试。

将样品的色谱图与标准工作液的色谱图进行比较确定是否含有罗丹明B，再根据样品的色谱图峰面积所对应的标准曲线上的浓度确定样品中罗丹明B的含量，得到的结果如表4所示。

表4实施例3的检测结果表

而通过实验发现，其他低共熔溶剂，如氯化胆碱和金属盐组成的低共熔溶剂，粘度太大，不适用于液液萃取的样品前处理操作。通过反复试验得出，加标回收率在75.2％-105％，检出限可达2.5μg/kg。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。