亚微米氧化碳球作为基质在MALDI-MS中的应用的制作方法

本发明涉及激光解吸离子化质谱检测的辅助基质材料，具体地说是亚微米氧化碳球作为基质在激光解吸离子化质谱(MALDI-MS)中的应用。

背景技术：

自1988年Tanaka和Hillenkamp各自提出采用基质辅助激光解吸离子化(MALDI)技术，这一技术与飞行时间质谱(MALDI-MS)联用，已成为基因、蛋白组学等生命科学研究中的重要工具。(Rapid Commun Mass Sp 1988,2(8),151-153；Nature 2003,422(6928),198-207)

在MALDI-MS技术中，基质起着吸收及传递激光能量、使样品离子化的作用。MALDI-MS技术中常用的基质都是小分子有机化合物，如α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、2,5-二羟基苯甲酸(DHB)、芥子酸(SA)、3-氨基喹啉(3-AQ)等。但是常规有机基质的引入在低分子量范围内(〈500Da)带来大量基质峰，产生严重的背景干扰，限制了该方法在小分子分析中的应用。

近年来，研究者提出使用无机材料(如表面修饰的硅、碳基材料等)作为基质，克服传统有机基质带来的背景干扰。(Nature 1999,399(6733),243-246；Anal Chem 2003,75(22),6191-6195)然而，早期的石墨、碳纳米管通常水溶性差，作为基质在金属靶上分布不均匀，严重影响信号重复性；而且碳纳米管作为基质时形成的基质层较疏松，激光辐射时容易飞离靶板，污染离子源。邹汉法和邓春晖等人先后提出对碳纳米管进行强酸氧化处理或者多巴胺后修饰得到水溶性碳纳米管。改善碳纳米管作为基质的弊端。(J Am Soc Mass Spectr 2005,16(6),883-8922005,16(6),883-892；ACS Appl Mater Inter 2013,5(16),7770-6)张静等人对石墨烯进行改性，克服了石墨烯自身作为基质时易发生聚合的缺陷，也可实现对小分子化合物的检测。(张静.一种具有选择性的用于小分子MALDI-TOF MS检测的基质及其应用[P].中国专利:103776892A,2014-05-07)

然而，碳纳米管或石墨烯等碳材料的尺度控制较难，开发改性的水溶性碳基材料作为基质制备工艺复杂，成本高，难为MALDI-MS提供尺寸稳定的基质材料，影响质谱检测的稳定性和可重复性，限制了碳基纳米材料作为基质的MALDI-MS应用的适用性。为了弥补已报道碳基材料作为基质在MALDI-MS应用的局限性，本发明提供了一种亚微米级(sub-micrometer)氧化碳球为激光解吸离子化辅助基质的MALDI-MS应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种将亚微米氧化碳球用于MALDI-MS的激光解吸离子化辅助基质的应用。提供的亚微米氧化碳球制备方法简单可控，形貌规整， 尺寸均匀，成本低廉、水溶性好，此亚微米氧化碳球作为MALDI基质可避免使用传统有机基质检测小分子化合物的基质干扰问题，也使得碳基材料作为激光解吸离子化辅助基质时质谱检测的可操作性强、重复性好，实现了MALDI-MS对小分子化合物的高通量、高灵敏分析。

本发明的目的通过如下技术方案实施：

提供一种将亚微米氧化碳球用于MALDI-MS的激光解吸离子化辅助基质的应用。其特征在于：具体应用过程如下，

1)称取亚微米氧化碳球10mg，加入5-20mL乙醇水溶剂，乙醇与水的体积比为1:5～5:1，超声分散均匀，制得亚微米氧化碳球基质溶液；

2)取样品溶液点于不锈钢靶表面，自然干燥形成均匀样品层；

3)取亚微米氧化碳球基质溶液点于不锈钢靶表面样品层上，自然干燥后，进行激光解吸离子化MALDI-MS质谱分析。

所述亚微米氧化碳球为直径70-1000nm之间的规整圆球形氧化碳材料，可按如下改进后方法制备获得，(Angewandte Chemie 2011,50(26),5947-51；Journal of Materials Chemistry 2012,22(25),12636)

(1)向30～50mL醇水溶剂(V_乙醇:V_水＝1:1～1:2)中加入阳离子表面活性剂CTAB(0～0.928g)和嵌段醚聚合物F127(0～0.96g)，室温磁力搅拌20min得透明溶液。

(2)向步骤(1)溶液中加入46mg～186mg间苯二酚，85μL～171μL(质量浓度25％)氨水。0.5h后加入126μL甲醛，30～70℃磁力搅拌，反应过夜。

(3)离心步骤(2)反应液，得土黄色固体，用乙醇水溶剂(体积比1:1)清洗3次，真空干燥，得碳球前躯体。

(4)步骤(3)中所得碳球前躯体在氮气氛围下高温碳化，碳化温度为500～1000℃，得亚微米碳球。

(5)称取20mg步骤(4)中所得亚微米碳球，加入20mL稀硝酸溶液(质量浓度26％)，电磁搅拌，90℃回流2h，自然降温。反应液水洗至中性，真空干燥即得亚微米氧化碳球。

所述亚微米氧化碳球作为激光解吸离子化辅助基质在MALDI-MS中的应用，其特征在于：所述MALDI-MS检测对象为分子量小于1000Dalton的氨基酸、脂类化合物、肽、糖类、核苷酸、香豆素类、黄酮类、酚类、抗癌药、兽残、激素类、食品添加剂中任一种化合物或二种以上混合物。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

本发明所涉及的亚微米氧化碳球作为MALDI基质，能有效消除传统有机基质自身的背景干扰，辅助MALDI-MS实现对小分子化合物的快速、准确分析。亚微米氧化碳球作为MALDI基质形貌规整、粒径在70nm-1000nm之间均匀可调，水溶性好，可在MALDI靶上形成均匀的基质层，克服了碳纳米管或石墨烯等碳纳米材料的大小尺度控制较难及影响MALDI质谱检测的稳定性的不足，提高了 信号的重复性。本发明涉及的亚微米氧化碳球MALDI基质是一种制备简单，成本低廉的碳基材料，具有更广泛的MALDI-MS质谱分析的可操作性，已成功应用于分子量小于1000Dalton的氨基酸、脂类、肽、糖类、核苷、激素、药物等小分子化合物的高灵敏高通量分析。

附图说明

图1为实例1中所制得直径为180nm-250nm的氧化碳球透射电子显微镜照片；

图2为实例2中所制得直径为600nm-800nm的氧化碳球透射电子显微镜照片；

图3为实施例3中外径180nm-250nm的氧化碳球作为基质分析D-木糖的质谱图；

图4为实施例4中外径600nm-800nm的氧化碳球作为基质分析D-半乳糖的质谱图；

图5为实施例5中碳球(左侧CS)和氧化碳球(右侧OCS)的水溶性对比图；

图6为实施例6中不同基质所形成的基质层形态图；

图7为实施例7中使用不同基质MALDI-TOF MS分析脂肪酸混合物的质谱图；

图7中A为使用传统CHCA作为基质分析脂肪酸混合物的质谱图；

图7中B为亚微米氧化碳球作为基质分析脂肪酸混合物的质谱图；

图7中C为微米级不规整氧化碳球作为基质分析脂肪酸混合物的质谱图；

图7中D为氧化碳纳米管作为基质分析脂肪酸混合物的质谱图；

图7中E为氧化石墨烯作为基质分析脂肪酸混合物的质谱图。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但本发明并不限于下述实施例。

下述实施例中所用的容器、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：直径为180nm-250nm的氧化碳球的制备

(1)将0.029g CTAB和0.96g F127分散于乙醇/水(7mL/14mL)溶液中，室温磁力搅拌20min，形成无色透明溶液。

(2)向步骤(1)加入0.093g(30mmoL)间苯二酚，0.171mL氨水(质量浓度25％)，60℃下电磁搅拌。

(3)半小时后，向步骤(2)中加入0.126μL甲醛，继续电磁搅拌16h。

(4)将步骤(3)中所得反应液离心，水洗三次，乙醇洗两次。真空干燥过夜，得土黄色碳球前躯体。

(5)步骤(4)中所得土黄色碳球前躯体在氮气气氛中600℃碳化4h，自然降温得外径为180nm-250nm的碳球。

(6)取20mg步骤(5)中所得碳球，加入20mL稀HNO₃(质量分数26％)溶液，电磁搅拌，90℃回流2h，水洗至中性，真空干燥得外径为180nm-250nm 的氧化碳球。

图1为实施例1中所制得直径为180nm-250nm的氧化碳球透射电子显微镜照片。

实施例2：直径为600nm-800nm的氧化碳球的制备

实验操作步骤同实施例1中步骤(1)-(6)所述，以下特殊说明步骤除外。

步骤(1)中所用CTAB量为0.232g。

步骤(5)中自然降温得外径为600nm-800nm的碳球。

步骤(6)中真空干燥得外径为600nm-800nm的氧化碳球。

图2为实施例2中所制得直径为600nm-800nm的氧化碳球透射电子显微镜照片；

本发明涉及的亚微米氧化碳球制备方法简单，所用原料价格低廉，制得材料为形貌规整的圆球形，粒径可在70nm-1000nm之间调整。所得氧化碳球单分散性好，避免氧化碳球作为基质时发生自身团聚，能与分析化合物充分接触，并传递激光能量，大大提高样品分析时的离子化效率。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明下述实施例中所用的检测仪器为：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)，仪器型号为AB SCIEX TOF 5800。脉冲为Nd:YAG激光器，发射波长为355nm。

实施例3：180nm-250nm的氧化碳球作为基质MALDI-TOF MS检测糖类化合物以不易离子化的糖化合物D-木糖(MW＝150.13)为检测对象。

1、配制10Mm的D-木糖母液(水溶液)，采用梯度稀释的方法得到1Mm的稀释液。可4℃冰箱保存。

2、配制2mg/Ml实施例1中180nm-250nm的氧化碳球基质溶液(所用溶剂为乙醇水混合溶液，V_乙醇:V_水＝1:1)。超声5min分散均匀待用。可4℃冰箱保存。

3、取0.5μL步骤1中1Mm稀释液，悬滴到384孔不锈钢MALDI样品靶上，自然晾干形成均匀样品层。

4、取0.5μL步骤2中基质溶液，点到样品层上，自然风干。

5、送入MALDI-TOF MS进行分析。质谱数据在正离子反射模式下采集，每张谱图为1000次测量平均图，m/z范围50-1000。

图3为实施例3中外径180nm-250nm的氧化碳球作为基质分析D-木糖的质谱图。

实施例4：600nm-800nm的氧化碳球作为基质MALDI-TOF MS检测糖类化合物

操作步骤同实施例3中所述步骤，特殊说明的步骤除外。

检测对象为D-半乳糖(MW＝180.16)，其为又一不易离子化的化合物代表。图4为实施例4中外径600nm-800nm的氧化碳球作为基质分析D-半乳糖的质谱图。

尺寸为180nm-250nm和600nm-800nm的亚微米氧化碳球作为基质时，MALDI-TOF MS分析不易离子化的糖类化合物，在低浓度下都表现出很高的灵敏度和高信噪比，而且在低分子量区域几乎很少出现背景干扰，显示出亚微米氧化碳球优良的基质辅助效果。

实施例5：氧化碳球与碳球水溶性比较

具体过程如下：

分别取20mg实施例1步骤(5)中的碳球(CS)、步骤(6)中的氧化碳球(OCS)，分别加入10Ml去离子水，超声5min后，静置48h；

图5为碳球(左侧CS)和氧化碳球(右侧OCS)的水溶性对比图。

可以看出，亚微米碳球在水中分散性较差，很容易沉降。而对其经过温和的氧化处理后所得亚微米氧化碳球水溶性大大提高，其分散状态可在水中保持长久的稳定性，使得亚微米氧化碳球作为基质溶液的均匀性好、可操作性强。

实施例6：氧化碳球与其他形状碳材料作为基质靶板分布形态比较

具体过程如下：

1、分别取10mg亚微米氧化碳球、微米级不规整氧化碳球、氧化碳纳米管、氧化石墨烯，分别加入5Ml乙醇水(V_乙醇：V_水＝1：1)，超声分散5min，得2mg/Ml基质溶液。

2、步骤1中所述微米级不规整氧化碳球、氧化石墨烯、氧化碳纳米管制备方法见本实施例说明。亚微米氧化碳球为实施例1中所制180nm-250nm的氧化碳球。

3、分别取0.5μL步骤1中基质溶液点于不锈钢金属靶板表面，自然干燥后形成基质薄层。

说明：本实施例所述微米级不规整氧化碳球，氧化碳纳米管，氧化石墨烯的制备过程，具体如下，

A、所述微米级不规整氧化碳球的制备

(1)将0.232g CTAB和0.96g F127分散于乙醇/水(28mL/14mL)溶液中，室温磁力搅拌20min，形成无色透明溶液。

(2)向步骤(1)加入0.186g(60mmoL)间苯二酚，0.342mL氨水(质量浓度25％)，60℃下电磁搅拌。

(3)半小时后，向步骤(2)中加入0.126μL甲醛，继续电磁搅拌16h。

(4)将步骤(3)中所得反应液离心，水洗三次，乙醇洗两次。真空干燥过夜，得土黄色碳球前躯体。

(5)步骤(4)中所得土黄色碳球前躯体在氮气气氛中600℃碳化4h，自然降温得外径为1200nm-2500nm的球形不规整碳球。

(6)取20mg步骤(5)中所得碳球，加入20mL稀HNO₃(质量分数26％)溶液，电磁搅拌，90℃回流2h，水洗至中性，真空干燥得外径为1200nm-2500nm的球形不规整氧化碳球。

B、所述氧化碳纳米管的制备

1、取100mg多壁碳纳米管置于250mL烧瓶中，缓慢加入100mL浓硝酸；

2、磁力搅拌，加热到120℃回流2h；撤去加热，自然冷却至室温；

3、将烧瓶中溶液转移到盛有300mL冷水的烧杯中，搅拌冷却至室温；

4、将稀释后的溶液用0.45μm滤膜减压抽滤，用去离子水反复洗涤至pH接近中性，无水乙醇冲洗2次；

5、将步骤4中滤膜和膜上滤饼小心转移到真空干燥箱中，60℃真空干燥，得氧化碳纳米管。

所用多壁碳纳米管购于南京先锋纳米公司，外径为18-22nm，长度为5-20μm。

氧化后所得氧化碳纳米管壁结构受到部分破坏，长度在500nm-3μm之间不等。

C、所述氧化石墨烯的制备

(1)将石墨(1.5g，325目)加入到12mL浓H₂SO₄，2.5g K₂S₂O₈和2.5g P₂O₅的混合物中，加热上述混合体系至80℃，保持该温度，磁力搅拌5小时，随后冷却反应体系至室温；

(2)将混合物倾入500mL去离子水中，静置过夜；

(3)将上述静置物经0.2微米滤膜过滤，洗涤并自然晾干，得预氧化石墨；

(4)将该预氧化的石墨加入到0℃的浓H₂SO₄(120mL)中；

(5)随后缓慢加入15g KMnO₄，并控制反应温度在20℃搅拌，高锰酸钾加毕，控制反应体系在35℃搅拌4小时，随后，加入250mL去离子水，并通过外围冰浴控制温度在50℃以下，搅拌1.5小时后，再加入700mL去离子水，半小时后，逐滴滴入20mL 30％H₂O₂，反应体系迅速由棕色转变为棕黄色，撤去搅拌装置；

(6)过滤该棕黄混合物，用1:10HCl(1L)洗涤以除去金属离子，随后再用1L去离子水反复洗涤，得棕色固体，室温干燥后；

(7)将上述棕色固体制成水分散液(0.5％w/w)，连续透析一周，最后过滤，洗涤，重新分散超声1小时，过滤，60℃真空干燥24小时，即可制备得到氧化石墨烯。

所得氧化石墨烯为片层结构，尺寸分布在(1.5～4)μm×(1.5～8)μm，形状不规则。

图6为基质溶液干燥后所形成的基质层在MALDI-TOF-MS自配显微镜下形态图，亚微米氧化碳球(图中A)、微米级不规整氧化碳球(图中B)、氧化碳纳米管(图中C)、氧化石墨烯(图中D)。

可以看出本发明涉及的亚微米氧化碳球均匀铺展在金属靶板上形成致密的薄层，利于激光能量的传递和分析化合物的离子化；

而微米级不规整氧化碳球所形成基质层较厚，表面较为粗糙，不利于分析物的离子化；

氧化后的碳纳米管结构被破坏，长短不一，尺寸不均，在靶板上分布形态 差，薄厚不均匀，易导致信号重复性差；

氧化石墨烯在靶上分布较为均匀，但是由于片状的石墨烯自身易团聚折叠，分布呈褶皱形态，不利于激光能量的传递。

实施例7：亚微米氧化碳球作为基质分析四种脂肪酸混合物与现有技术比较

1、配制四种脂肪酸(MW_(C14)＝228.37、MW_(C16)＝256.43、MW_(C18)＝284.48、MW_(C20)＝312.54)的10mM混合液。分散溶液为无水乙醇，采用梯度稀释的方法得到20μM待上样液。4℃冰箱保存。

2、取10mg传统有机基质CHCA，加入2mL乙腈水溶液(V_乙腈:V_水＝1:1)。超声5min。得5mg/mL的CHCA基质溶液，备用。

3、分别取实施例6步骤(1)中所制2mg/mL亚微米氧化碳球、微米级不规整氧化碳球、氧化碳纳米管、氧化石墨烯的基质溶液，备用。

4、取0.5μL步骤1中20μM样品滴到不锈钢MALDI靶上，自然晾干形成样品层。

5、取0.5μL步骤2或步骤3中基质溶液点到样品层上，自然风干。

6、进行MALDI-TOF MS分析。质谱数据在负离子反射模式下采集，每张谱图为200次测量平均图，m/z范围50-1000。

图7为使用不同基质时MALDI-TOF MS分析同等浓度脂肪酸混合物的质谱图；

图中A为使用传统CHCA作为基质分析脂肪酸混合物的质谱图；

图中B为亚微米氧化碳球作为基质分析脂肪酸混合物的质谱图；

图中C为微米级不规整氧化碳球作为基质分析脂肪酸混合物的质谱图；

图中D为氧化碳纳米管作为基质分析脂肪酸混合物的质谱图；

图中E为氧化石墨烯作为基质分析脂肪酸混合物的质谱图。

可以看出，使用传统基质CHCA在负离子模式下质谱图(A)中仅出现基质本身的碎片峰，未观测到脂肪酸的信号峰；而使用亚微米的氧化碳球作为基质时，图谱中(B)几乎没有任何背景干扰，四种脂肪酸的信号峰都以[M-H]^-(m/z＝227.258,255.298,283.338,311.378)的特征峰出现，在非常低的浓度下仍表现出很高的灵敏度和信号强度。与之对比的使用微米级不规整氧化碳球作为基质时，图谱(C)也几乎没有背景干扰，四种脂肪酸的[M-H]^-也都能检测到，但信号强度远低于亚微米的氧化碳球，这是因为不规整的微米氧化碳球能量传递效率较低；同样的使用氧化碳纳米管(D)和氧化石墨烯(E)作为基质时，图谱中都能观测到四种脂肪酸的[M-H]^-信号峰，但是在信号峰附近还有很多干扰峰存在，掩盖了分析物的信号峰，样品信号强度也远低于B图谱，这可能由于基质本身尺度跨度范围大，加上石墨烯的片层结构易团聚致使所形成基质层分布不均匀，限制了激光能量传递效率和样品的离子化效率。

本发明与现有技术相比具有以下优异效果：

本发明所涉及的亚微米氧化碳球作为MALDI基质，能有效消除传统有机基质自身的背景干扰，辅助MALDI-MS实现对小分子化合物的快速、准确分析。亚微米氧化碳球作为MALDI基质形貌规整、粒径在70nm-1000nm之间均匀可调， 水溶性好，相比于微米的氧化碳球或不规整的球形材料，在MALDI靶上形成更为均匀的基质层，激光能量传递效率高，可以有效增强分析物的离子化效率，克服了已报道的碳纳米管或石墨烯等碳纳米材料的大小尺度控制较难及影响MALDI质谱检测的稳定性的不足，提高了信号的重复性。

本发明涉及的亚微米氧化碳球MALDI基质是一种制备简单，成本低廉的碳基材料，具有更广泛的MALDI-MS质谱分析的可操作性，已成功应用于分子量小于1000Dalton的氨基酸、脂类、肽、糖类、核苷、激素、药物等多种结构小分子化合物的高灵敏高通量分析。