发明领域
本发明涉及一种用于归一化光学传感器表面上的质量传输性质的方法。更具体地，本发明涉及用于免校准浓度分析的免标记系统的归一化以及一种用于确定分析物浓度的方法。本发明同样涉及一种对于执行方法步骤有用的试剂盒。
发明背景
能够实时监测分子相互作用的分析传感器系统(即，免标记系统)获得了日益兴趣。这些系统经常是基于光学生物传感器，并且通常被称为相互作用分析传感器或者生物特异性相互作用分析传感器。一种有代表性的生物传感器系统是由ge医疗保健生命科学公司出售的biacore®仪器，其利用表面等离子体共振(spr)检测样品中的分子间的相互作用以及固定在感测表面上的分子结构。利用biacore®系统，有可能不使用标记而实时确定样品中特定分子的存在和浓度，而且实时确定附加的相互作用参数，诸如例如分子相互作用的结合速率和分解速率常数。文献中全面地描述了装置和理论背景(例如参见jonsson，u.，等，biotechniques11：620-627(1991))。正常地，技术涉及将配体固定至传感器芯片(流动池)的特定光学传感器表面，将传感器芯片接触包含感兴趣的分析物的样品流，并且随后测量传感器芯片的表面光学特性的变化，该变化起因于配体和分析物之间的结合。对于关于spr的进一步细节，同样参照了美国专利no.5313264，美国专利no.5573956和美国专利no.5641640。
免校准浓度分析(cfca)从测量的质量传输性质以及扩散系数和分子量的数值中计算分析物浓度，当试验运行时，这些作为评估变量而被提供。评估是基于将传感图数据拟合到包含质量传输分量的相互作用动力学模型。从供应的扩散系数、流动池特性和分子量中计算质量传输参数。采用作为全局拟合的变量的分析物浓度集，能够确定分析物的未知浓度。对于cfca，流动池特性可以在个体之间改变，这能够通过利用固定的配体和具有已知浓度的分析物之间的相互作用而被校正。不同芯片个体中的差异在理论上能够单独导致显著的变化。由于校正将消耗芯片，这种变化可能难以被校正。
因此，需要一种通用的结合规程，该规程改进过程并且通过校正减小了不同芯片间的变化而没有耗尽芯片。
技术实现要素：
这里公开的内容包括用于归一化流动池中的光学感测表面的质量传输性质的静电结合的一种新用途。所述方法利用了带正电荷的大分子粒子的静电结合到例如biacore传感器芯片(cm5、cm7、cm4、cm3和c1)的光学感测表面的羧基葡聚糖表面，这发生在低于pi的ph和低离子强度下，以表征流动池的质量传输性质。当具有生理离子强度的缓冲液在芯片上流动时，静电结合的大分子粒子被洗掉。这种静电结合同样可以用于测定分析物的浓度。此外，由于该方法的测量不依赖于分析物的活性浓度，它也可以结合光谱学的或者其它非活性相关的浓度确定方法用来测量或设定cfca的精度。
因此，本发明的第一方面是提供一种用于归一化用于免校准浓度分析的免标记系统的方法，包括下面顺序的步骤：
(1)提供在低于大分子粒子蛋白质的pi的ph和低离子强度的包含已知浓度的对照大分子粒子的溶液；
(2)将所述溶液以第一流速与带负电荷的光学传感器表面接触，以便允许所述大分子粒子到所述表面的静电结合，并且获得第一传感图；
(3)将所述溶液以第二流速与所述光学传感器表面接触，以便允许所述大分子粒子到所述表面的静电结合，并且获得第二传感图；以及
(4)将所述传感图拟合到结合方程，以确定所述对照大分子粒子的测量浓度；
其中所述光学传感器表面不固定有用于所述对照大分子粒子的配体，并且其中在质量传输限制下执行所述接触步骤。
在某些实施例中，所述对照大分子粒子以浓度系列提供，并且通过测量样品浓度系列和光学传感器表面之间的静电结合而实现归一化。
在某些实施例中，所述光学传感器表面是基于倏逝波感测的检测器的一部分。优选地，所述光学传感器表面是基于表面等离子体共振的检测器的一部分。
在某些实施例中，所述大分子粒子是蛋白质。
本发明的第二方面是提供一种用于确定分析物浓度的方法，包括：
1)提供在低于所述分析物的pi的ph和低离子强度的包含分析物的溶液；
2)将所述溶液以第一流速与带负电荷的光学传感器表面接触，以便允许所述分析物到所述表面的静电结合，并且获得第一传感图；
3)将所述溶液以第二流速与所述带负电荷的光学传感器表面接触，以便允许所述分析物到所述表面的静电结合，并且获得第二传感图；以及
4)通过将所述传感图拟合到结合方程而确定分析物的浓度；
其中所述光学传感器表面不固定有用于所述对照大分子粒子的配体，并且其中在质量传输限制下执行所述接触步骤。
在某些实施例中，所述分析物是感兴趣的蛋白质。在某些实施例中，以浓度系列提供蛋白质分析物，并且通过测量系列稀释样品中的一些和所述光学传感器表面之间的静电结合而实现浓度测量。
在某些实施例中，所述光学传感器表面是基于倏逝波感测的检测器的一部分。优选地，所述光学传感器表面是基于表面等离子体共振的检测器的一部分。
本发明的第三方面是提供一种试剂盒，包括在已知浓度的已知大分子粒子的溶液；低ph和低离子强度的缓冲液，用于稀释所述大分子粒子溶液；以及指导手册；其中所述试剂盒适合在免标记系统中，用于归一化用于分析物的免校准浓度分析的所述光学传感器表面。
在某些实施例中，所述试剂盒还包括较高离子强度的缓冲液，用于洗掉附着于所述光学传感器表面的任何大分子粒子。
在某些实施例中，所述试剂盒中的大分子粒子溶液具有低于所述大分子粒子的pi的ph。
在某些实施例中，已知的大分子粒子是蛋白质。
通过下面的描述和权利要求书，本发明的进一步细节和优势将会是显而易见的。
附图说明
图1示出了从抗-β2μ在biacore光学传感器表面上的静电结合得到的传感图，在单独的循环中，以5和100μl/min的流速运行。
发明的详细描述
为了评价分析传感器系统的流动池中的质量传输性质，不得不记录在各种流速下至表面的最初分析物结合速度。结合速度依赖于质量传输限制条件下的流速。本发明利用了具有已知浓度的分析物和传感器芯片的光学传感器表面之间的质量传输限制结合，以便归一化免标记检测系统或者测量具有未知浓度的分析物的浓度。通过阳离子分析物静电吸引到传感器芯片上的阴离子带负电荷的基质实现这种结合。当缓冲液的ph低于它们的等电点时，大多数的大分子粒子(例如，蛋白质)变为阳离子的。如果样品溶液中的离子强度低(~10mm)到不足以掩蔽蛋白质和芯片基质的电荷，则蛋白质结合到光学传感器表面。在严格的质量传输限制条件下实时跟踪静电结合，以表征流动池中当前的质量传输性质。
在某些实施例中，在严格的质量传输限制条件下的静电结合被用于归一化例如不同的流动池之间或者在其外的测量的浓度精度。在良好表征的条件下(ph、离子强度、浓度)被良好表征的大分子粒子(例如，蛋白质)用来利用了正确的软件工具归一化用于cfca的分析传感器系统。此外，由于测量不依赖于分析物的活性浓度，它可以结合光谱学的或者其它非活性相关的浓度确定方法用于测量或者设定cfca的精度。对于多通道系统，该方法对于使cfca可行并且准确是非常重要的，因为在这种系统中所有的通道不得不被归一化，以实现高精度。
在一种实施例中，提供了一种用于归一化用于免校准浓度分析的免标记系统的方法，包括以下顺序的步骤：
(1)提供在低于大分子粒子的pi的ph和低离子强度的包含已知浓度的对照大分子粒子的溶液；
(2)将所述溶液以第一流速与带负电荷的光学传感器表面接触，以便允许所述大分子粒子到所述表面的静电结合，并且获得第一传感图；
(3)将所述溶液以第二流速与所述光学传感器表面接触，以便允许所述大分子粒子到所述表面的静电结合，并且获得第二传感图；以及
(4)将所述传感图拟合到结合方程，以确定所述对照大分子粒子的测量浓度；
其中所述光学传感器表面不固定有用于所述对照大分子粒子的配体，并且其中在质量传输限制下执行所述接触步骤。
“对照大分子粒子”可以是任何带正电荷的大分子粒子，其具有如蛋白质的已知的扩散系数，并且在低ph的测量期间是稳定的。所述大分子粒子可以是但不局限于蛋白质、合成的分子、多糖、适配子或者核酸分子。优选地，所述对照大分子粒子具有大约5000道尔顿至大约500000道尔顿的分子量。优选地，所述对照大分子粒子是蛋白质。作为示例，对照蛋白质可以是单克隆抗体。
大分子粒子具有已知的浓度。在某些实施例中，已知的浓度处于0.1-20nm的范围中。在更优选的实施例中，已知的浓度处于1-20nm的范围中。在某些实施例中，大分子粒子可以是来自于浓缩的样品，并且在使用之前被稀释。大分子粒子的适当浓度确保了静电结合达到正确的初始结合速度和qc比，并且对于不同的大分子粒子而改变。
当大分子粒子例如蛋白质处于具有低于蛋白质的pi的ph的溶液中时，蛋白质被带正电。pi是蛋白质具有零净电荷的ph。在高于pi的ph下，蛋白质上的酸性基团变为去质子化的，导致蛋白质上的净负电荷。当ph低于pi时，蛋白质上的碱基变为去质子化的，导致蛋白质上的净正电荷。
在某些实施例中，所述对照大分子粒子处于具有低离子强度的溶液中。通过低离子强度意味着离子强度处于大约0-50mm之间，优选地处于大约5-20mm之间，并且更优选地为大约10mm。
在某些实施例中，所述光学传感器表面被带负电荷。所述光学传感器表面可以例如采用羧基进行功能化(functionalized)。在低离子强度处，带正电荷的大分子粒子(例如，蛋白质)将结合到羧基功能化的表面，因为羧基是负的并且蛋白质是正的，从而它们吸引，并且周围不存在足够的其它离子来屏蔽吸引。优选地，所述光学传感器表面利用羧基葡聚糖进行功能化。更优选地，所述光学传感器表面利用羧甲基修饰的葡聚糖进行功能化。
在非常低的ph下，酸性离子将开始使光学传感器表面上的负电荷质子化，并且降低表面的容量。因此，优选的ph是低于对照大分子粒子(或分析物)的pi，而不能太低，以至于引起传感器表面损失容量。在某些实施例中，优选的ph是ph3-7之间。
在某些实施例中，用于归一化用于免校准浓度分析的免标记系统的方法进一步包括通过将测量的浓度和已知的浓度进行对比而为传感器表面计算校正因子，用于随后的相同的光学传感器表面上的分析物的免校准浓度分析。在某些实施例中，校正因子是已知的浓度与测量的浓度之比。因此，可以利用校正因子调节任何分析物的随后测量的浓度，以便达到真实的浓度。
在某些实施例中，用于归一化用于免校准浓度分析的免标记系统的方法在步骤2和3之间进一步包括利用较高离子强度的缓冲液清洗光学传感器表面，以便从所述表面去除结合的大分子粒子。在某些其它的实施例中，所述方法在步骤3之后进一步包括采用较高离子强度的缓冲液清洗光学传感器表面，以便从所述表面去除结合的大分子粒子。较高离子强度的缓冲液具有高于对照大分子粒子溶液的离子强度的离子强度。因此，在某些实施例中，较高的离子强度可以是大约50-500mm。优选地，缓冲液的离子强度可以是大约100-200mm，诸如150-180mm。
在某些实施例中，第一和第二流速是不同的。在某些实施例中，第一流速可以是大约5-20ul/min，并且第二流速可以是大约50-100ul/min。在其它的实施例中，第一流速可以是大约50-100ul/min，并且第二流速可以是大约5-20ul/min。优选地，第一流速可以是大约5ul/min，并且第二流速可以是大约100ul/min。
在某些实施例中，在严格的质量传输限制条件下，静电结合被用来测量感兴趣的分析物的浓度。这种浓度在良好表征的条件下(ph，离子强度，浓度稀释)可以利用分析传感器系统通过采用适当软件工具的免校准浓度分析而获得。不同于在光学传感器表面上存在配体的情况下获得的浓度测量，这种测量不要求分析物和配体之间的结合。因此，这种测量不区分“活性的”分析物(即，能够结合到配体)和那些非活性的分析物。与“活性的”浓度相比，它是测量的总浓度。
因此，在一种实施例中，提供了一种用于确定分析物的浓度的方法，包括：
(1)提供在低于分析物的pi的ph和低离子强度的包含所述分析物的溶液；
(2)将所述溶液以第一流速与带负电荷的光学传感器表面接触，以便允许所述分析物到所述表面的静电结合，并且获得第一传感图；
(3)将所述溶液以第二流速与所述带负电荷的光学传感器表面接触，以便允许所述分析物到所述表面的静电结合，并且获得第二传感图；以及
(4)通过将所述传感图拟合到结合方程来确定分析物的浓度；
其中所述光学传感器表面不固定有用于所述对照大分子粒子的配体，并且其中在质量传输限制下执行所述接触步骤。
在某些实施例中，所述方法在步骤2和3之间进一步包括利用较高离子强度的缓冲液清洗所述光学传感器表面以便从所述表面去除结合的分析物的步骤。
在某些实施例中，所述方法在步骤3之后进一步包括利用较高离子强度的缓冲液清洗所述光学传感器表面以便从所述表面去除结合的分析物的可选步骤。
在某些实施例中，第一和第二流速是不同的。在某些实施例中，第一流速可以是大约5-20ul/min，并且第二流速可以是大约50-100ul/min。在其它的实施例中，第一流速可以是大约50-100ul/min，并且第二流速可以是大约5-20ul/min。优选地，第一流速可以是大约5ul/min，并且第二流速可以是大约100ul/min。
在某些实施例中，所述方法还包括用一种备选测量而测量分析物的浓度，并且对比测量的浓度。在某些实施例中，用于分析物浓度的备选测量是传统的方法，诸如对于蛋白质利用分光光度计的在280nm的吸光度。
在某些实施例中，分析物可以是任何大分子粒子，诸如在溶液中被带正电的化合物或者生物分子。所述大分子粒子例如可以是蛋白质、多糖、核酸分子。在某些优选的实施例中，所述分析物是蛋白质，诸如抗体或者病毒粒子。
大分子粒子溶液在使用前被连续地稀释。大分子粒子的适当浓度确保了静电结合达到正确的初始结合速度和qc比，并且对于不同的大分子粒子而改变。通过将传感图拟合到1：1相互作用动力学模型(参见下面)而确定适当的稀释。
在某些实施例中，在严格的质量传输限制条件下，静电结合被用来评估蛋白质制备的活性。在如上所述地那样测量总浓度之后，在固定配体的存在的情况下(例如，在平行的流动池中)采用cfca测量分析物的活性浓度。通过这种组合，能够确定制备中的活性程度。
下面的通用原理适用于本发明的所有方面。
利用许多种不同的相互作用分析技术可以表征表面结合相互作用。市售的生物传感器包括上面提到的biacore®系统仪器，其基于表面等离子体共振(spr)并且允许实时监测表面相互作用。
spr现象是公知的。当光在某些条件下在不同折射率的两种媒体之间的界面处被反射时发生spr，并且界面被金属膜通常是银或金涂覆。在biacore®仪器中，媒体是样品和通过微流控流动系统与样品接触的传感器芯片的玻璃。金属膜是芯片表面上的金薄层。在特定的反射角下，spr导致反射光的强度降低。该最小反射的光强度的角度随着靠近biacore®系统样品侧中与反射光相对的侧面上的表面的折射率而改变。
当样品中的分子结合到传感器芯片表面时，浓度并且因此表面处的折射率改变，而且spr响应被检测。将相互作用过程期间的响应相对于时间绘图将提供相互作用进度的定量测量。这种图通常被称为传感图。在biacore®系统中，spr响应值用共振单位(ru)来表示。一个ru代表最小反射的光强度的角度的0.00001°的改变，对于大多数的蛋白质而言，其粗略地等同于传感器表面上的浓度大约1pg/mm2的改变。当包含分析物的样品接触传感器表面时，传感器表面与分析物在被称为“结合”的步骤中发生反应。当样品最初开始接触传感器表面时，该步骤通过ru增加而被指示在传感图上。相反地，“分解”通常发生在当样品流例如被缓冲液流替代时。当分析物从表面结合的配体中分解时，该步骤通过ru随着时间下降而被指示在传感图上。
免校准浓度分析从测量的质量传输性质以及扩散系数和分子量的数值中计算分析物浓度，当进行试验时，这些作为评价变量而被提供。在一个示例中，评价是基于将传感图数据拟合到1：1相互作用动力学模型，其中质量传输参数从供应的扩散系数、流动池特性和分子量中计算，并且其中分析物浓度集作为全局拟合的变量。
流动池中和传感器表面上的事件能够被描述如下：
大分子粒子例如体积(bulk)的蛋白质(abulk)结合到芯片表面(b)是一个两步式过程。在第一步中，将来自体积的蛋白质以质量传输系数km输送至表面(asurf)，并且在第二步中，asurf和b之间的结合以结合常数为kα和分解常数为kd发生，并且形成复合物ab。
如果abulk至传感器表面的输送慢于asurf至b的结合，则出现质量传输限制，并且能够测量分析物浓度。
实验规程包括监测至少两种分开很宽的流速上的响应，并且采用适当的模型进行评估。
从这种实验中获得的曲线的结合相(即，传感图)被拟合到带有质量传递项(kt)的双分子相互作用模型，其中分析物浓度(conc)是拟合的参数：
a(溶液)=conc
a[0]=0
da/dt=kt*(conc-a)-(ka*a*b-kd*ab)
b[0]=rmax
db/dt=-(ka*a*b-kd*ab)
ab[0]=0
dab/dt=(ka*a*b-kd*ab)
总响应：
ab+ri
在该模型中，质量传输常数kt的值作为常数被引入，其根据公式计算：
如果我们将该公式中的参数分组为蛋白质相关的和仪器相关的，则我们获得：
或者：
对于每个样品,对于免校准浓度分析的运行要求最少两个循环，并且以不同的流速运行。对于每种流速，空白循环是可选的。
重要的是在最低和最高流速(例如分别是5和100μl/min)下的传感图是充分分离的。如果曲线紧靠在一起或者重合，则这指示对于可靠的浓度测量在结合中不存在足够的质量传输限制。对于大约0.2或更高的qc比，足够的质量传输限制通常用值指示。具有低qc比的样品应当被慎重对待。
如下从商q计算qc比，其反映了质量传输限制的程度(初始结合由传感图的斜率测量，ru/秒)：
商q=(高流速下的初始结合/低流速下的初始结合)*(低流速/高流速)1/3。
在完全质量传输限制的条件下，结合速度正比于流速的立方根，因而商q具有的数值为1。当不存在质量传输限制时，结合速度独立于流速，从而q具有的数值等于流速比的立方根。对于q的可能的理论值范围将因此取决于所使用的流速(对于5和100μl/min的流速，数值是0.37)。从归一化到标度0-1的q的测量值中计算qc比：
qmax=1
qmin=(低流速/高流速)1/3
qc比=(qmeasured-qmin)/(qmax-qmin)。
偶尔，在较高流速下测定的结合速度可以是低的，导致qc比具有负值。如果当结合速度不受流速影响时(从而，结合速度在理论上应当是相同的，并且qc比应当是0),传感图受到干扰或者作为实验变化的结果,这可以发生。
测量的浓度是从拟合中计算的数值，并且实际的浓度通过将测量的浓度和稀释因子相乘而获得，以便给出原始样品中的浓度。在某些实施例中，根据本发明的实施例获得的校正因子被应用在计算分析物的实际浓度中。
尽管采用biacore®系统的一些方面进行了上面的描述，但是应当理解本发明可以结合众多的用于检测固态支撑表面处的结合相互作用的其它技术一起使用，包括例如依赖于标记的那些，诸如无线电标记、发色团、荧光团、散射光的标记、电化学活性标记(例如，基于场效应晶体管的电位测定法)、电场活性标记(电子受激发射)、磁活性标记、热活性标记、化学发光部分或过渡金属，以及所谓的免标记检测系统。然而，实时检测系统是优选的，尤其是基于化学传感器或生物传感器技术的那些。
生物传感器在广义上被定义为一种与固态物理化学换能器直接结合或者与和换能器结合的移动载体珠/粒子直接结合利用了用于分子识别的组件(例如，具有固定抗体的一层)的设备。尽管这类传感器通常基于免标记技术检测例如质量变化、折射率或者固定层的厚度，但是同样存在依赖于某种标记的传感器。典型的传感器检测技术包括但不局限于质量检测方法，诸如光学的、热光的和压电的或者声波(例如包括表面声波(saw)和石英晶体微天平(qcm))方法，以及电化学方法，诸如电势测定的、电导的、电流计的和电容/阻抗方法。关于光学检测方法，有代表性的方法包括检测质量表面浓度的那些，诸如反射光学方法，包括外部和内部的反射方法，其可以是角度、波长、极化或者相位分辨的，例如倏逝波椭圆偏振法和倏逝波光谱(ews，或者内反射光谱)，二者都可以包括经由表面等离子体共振(spr)的倏逝场增强，布儒斯特角量测折射法、临界角量测折射法、受抑全反射(ftr)、散射全内反射(stir)，其可以包括散射增强标记、光波导传感器；外部反射成像，基于倏逝波的成像，诸如临界角分辨的成像，布儒斯特角分辨的成像，spr角分辨的成像等。此外，可以提到例如基于表面增强拉曼光谱(sers)、表面增强共振拉曼光谱(serrs)、倏逝波荧光(tirf)和磷光现象的光度测定的和成像/显微镜方法本身或者与反射法组合，以及波导干涉计、波导漏模光谱、反射干涉光谱(rlfs)、透射干涉法、全息光谱法以及原子力显微镜(afr)。
当前市售的尤其是基于spr的生物传感器系统。示范性的这种spr-生物传感器包括上面提到的biacore®仪器。可以在美国专利no.5313264中发现biacore®仪器的技术方面和spr现象的详细讨论。例如，在美国专利no.5242828和5436161中给出了关于生物传感器感测表面的基质涂层的更详细信息。此外，在美国专利no.5492840中可以发现结合biacore®仪器一起使用的生物传感器芯片的技术方面的详细讨论。上面提到的美国专利的全部公开通过引用并入本文中。
在例如在上面提到的biacore®仪器中使用的类型的流动池中多次执行本发明的方法可以是方便的。可以用在本发明中的其它流动池对于本领域技术人员而言也是公知的，并且这里不需要进行描述。
将注意，本文中使用的术语“固态支撑”将被广义地解释，并且意味着包括任何固态的(柔性的或刚性的)衬底，衬底上的分子相互作用随后能够被选取的特定检测系统进行检测。衬底可以是生物的、非生物的、有机的、无机的或者其组合，并且可以是粒子、链、沉淀物、凝胶、片材、管、球体、容器、毛细管、垫、切片、膜、盘、载片等形式，具有任何方便的形状，包括圆盘、球体、圆形等。衬底表面可以具有任何二维的配置，并且可以包括例如台阶、脊线、扭结、阶地等，并且可以是一层不同于衬底其余部分的材料的表面。
示例
cfca被用于通过如下步骤进行抗β2μ抗体的浓度确定：
1、在ph5.0的10mm醋酸盐中将抗β2μ从lg/1的储备溶液稀释到10mg/1，经计算，这对应于67nm(稀释因子1)。
2、采用醋酸盐缓冲液将溶液进一步稀释5和25倍。
3、在监测至免配体传感器芯片cm5的结合的单独循环中，在5和100μl/min流速下，根据用于biacoret200的cfca标准biacore方法进行所有的稀释(参见biacoret200软件手册)。作为参照，运行仅采用醋酸盐缓冲液的循环，并且将其从对应的抗β2μ循环中减去。
4、输入d因子4578e-11(对于抗体是典型的)和分子量150000da，检查qc比。
5、进行拟合，以叠加来自每个稀释液的两种流速的传感图。利用了注射前基线和注射后的第一个15秒。
6、软件算法代表确定的浓度，其中考虑了输入的稀释因子。
在低流速下，对于所有的三种稀释，初始结合(传感图的斜率，ru/秒，注射开始后的第一个15秒)是充分的，并且两种流速之间的初始结合速度差异也是如此，如同从qc比中判断的。平均浓度被确定为26nm。
总之，结果显示方法给出了适合于cfca评估的数据质量(图1)。垂直轴(y-轴)指示响应(这里以响应单位ru表示)，并且水平轴(x-轴)指示时间(这里以秒s表示)。图表示出了来自稀释因子5的数据。
尽管已经显示并描述了本发明的特定实施例，但对本领域技术人员而言显而易见的是可以做出改变和修改，而不会偏离本发明的教导。在前述的说明书和附图中阐明的主题仅作为说明而被提供，并且不作为限制。当基于现有技术展望权利要求书的正确前景时，意图本发明的实际范围由以下的权利要求书进行限制。