本发明属于淡水养殖鱼类寄生虫性疾病防治的渔药快速筛选检测的前处理方法技术领域，特别是涉及一种用于淡水养殖鱼肉中阿维菌素和伊维菌素残留酶联免疫快速筛选检测的前处理方法。
背景技术：
阿维菌素(AVM)和伊维菌素(IVM)是一种广谱高效的大环内酯类抗生素杀虫剂，在淡水养殖方面应用较广。该类药物脂溶性好，在动物体内残效时间长，对鱼类具有神经和发育毒性，长期频繁使用，对养殖环境安全、水产品质量安全和人类健康安全会带来潜在风险，因此，加强阿维菌素和伊维菌素在水产养殖应用的安全风险监控是势在必行，水产品中该类药物残留检测技术特别是快速筛选检测技术研究，是实现水产品质量安全有效监管的重要技术支撑，对保障消费者身体健康具有及其重要意义。
目前，应用于淡水养殖鱼类的AVM和IVM残留检测方法主要有液-质法、液相色谱-荧光法和酶联免疫法，前两种方法仪器昂贵、使用要求高，相比于前两种方法，酶联免疫法特异性好、灵敏度高、分析容量大、更加适于快速筛选检测，易于推广应用。
由于样品前处理方法是仪器分析方法的重要组成部分，是否灵敏适用、简单快速直接决定分析检测结果的准确高效。因此除传统上应用较多的液液分配、固相萃取等污染重、消耗高、步骤复杂的前处理技术外，应研究运用新的前处理技术作为分析方法研究的重点，如基质固相分散萃取(MSPD)、分散固相萃取(d-SPE)、多功能杂质吸附逆向固相萃取(MAS)、分子印迹固相萃取等等。其中，分散固相萃取(d-SPE)是近年来刚刚发展起来的前处理技术，是将固相萃取吸附剂颗粒分散在样品的萃取液中，通过剧烈震荡、离心，以去除萃取液中脂类等杂质，净化一步完成，具有“快速、简易、廉价、有效、稳定、安全”特性，是一个快速、低成本、适于大量样品检测的多残留样品前处理方法。
我国现有水产品中AVM和IVM多残留检测的样品前处理方法均为较为传统的固相萃取(SPE)方法，操作复杂，成本高，对实验装置要求较高，掌握难度大，因此研发灵敏、稳定、简单快速、成本低廉、易于掌握的适用于酶联免疫快速筛选检测前处理方法尤为重要。
综上所述，在现有技术当中亟需要以酶联免疫吸附法为检测手段，重点研究将分散固相萃取技术应用于水产品中阿维菌素和伊维菌素残留检测的样品前处理方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题：针对现有技术的不足和缺陷，本发明提供一种鱼肉中阿维菌素和伊维菌素残留检测的前处理方法，该方法采用更适宜高容量、低成本、净化一步完成的d-SPE净化技术，实现对水产品中残留AVM和IVM的提取净化，该前处理过程具有简单快速、易操作、低成本、高容量等特点，适合酶联免疫快速筛选检测。
鱼肉中阿维菌素和伊维菌素残留检测的前处理方法，其特征是：该前处理方法包括如下步骤：
步骤一、称取鱼糜样品2g置于50mL离心管中；
步骤二、向所述离心管中加入6mL乙腈，在漩涡混合振荡仪上以2000r/min涡旋混合振荡2min，在离心机上以4000r/min离心5min，取上清液待用；
步骤三、分别称取1g氯化钠、2mL水、1.5g中性氧化铝，置于离心管中，混匀，获得混合液；
步骤四、将步骤二获得的上清液加入经步骤三获得的混合液中，再加入2mL乙腈饱和正己烷，旋涡混匀后，在离心机上以大于或等于4000r/min离心5min或静置至完全分出液面层，其中，中间层为乙腈溶液层；
步骤五、通过步骤一到步骤四，取400μL乙腈层溶液氮吹至干，用于酶联免疫测定；
步骤六、鱼肉中阿维菌素和伊维菌素残留检测的前处理方法完毕。
所述步骤一中的称取鱼糜样品2g准确至0.01g。
所述步骤三中1.5g中性氧化铝，以中性氧化铝为分散固相萃取吸附剂，采用标准添加实验酶联免疫测定法，利用酶联免疫测定仪测定鱼肉中残留的阿维菌素和伊维菌素的空白值和回收率。
通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：基于分散固相萃取去除杂质原理，以NaCl—H2O—AL-N—乙腈饱和正己烷d-SPE净化体系与乙腈的鱼肉提取液混匀，同时净化除脂，取乙腈溶液层用于后续酶免测定。
1、首次将d-SPE净化技术应用于水产品中AVM和IVM残留的酶联免疫检测，该前处理过程具有简单快速、易操作、低成本、高容量特点，适合酶联免疫快速筛选检测。
2、首次提出并优化NaCl—H2O—AL-N—乙腈饱和正己烷—乙腈提取液的d-SPE净化体系。
3、本发明提供的前处理方法，简化了样品前处理过程，实现净化、去脂过程一步完成。
4、采用中性氧化铝为分散固相萃取吸附剂去除杂质，实现水产品中AVM和IVM的多残留检测。
5、本方法的d-SPE混合溶液中，仅乙腈溶液层用于后续试验，如何保持乙腈溶液与其他溶液彻底分开，是影响方法准确度和灵敏度的关键因素。本方法加样顺序合理，首先将上清液加入由氯化钠、水、中性氧化铝制得的混合溶液中，再加入2mL乙腈饱和正己烷，旋涡混匀后，在离心机上以大于或等于4000r/min离心5min或静置至分层完全，清晰透明，取乙腈溶液层用于后续操作，来保证d-SPE操作准确可靠。
6、基于d-SPE的水产品中AVM和IVM残留的酶联免疫检测法与现有酶联免疫检测法相比，操作简单，成本低，多残留检测，灵敏度高，前处理方法不同，检测时间缩短。
附图说明
下面结合附图说明和具体实施方式对本发明作进一步说明：
图1为本发明鱼肉中阿维菌素和伊维菌素残留检测的前处理方法的操作流程图。
具体实施方式
如图1所示，本方法主要原理：基于分散固相萃取去除杂质原理，以NaCl—H2O—AL-N—乙腈饱和正己烷d-SPE净化体系与乙腈的鱼肉提取液混匀，同时净化除脂，取乙腈溶液层用于后续酶免测定。
鱼肉中阿维菌素和伊维菌素残留检测的前处理方法，其特征是：该前处理方法包括如下步骤：
步骤一、称取鱼糜样品2g置于50mL离心管中；
步骤二、向所述离心管中加入6mL乙腈，在漩涡混合振荡仪上以2000r/min涡旋混合振荡2min，在离心机上以4000r/min离心5min，取上清液待用；
步骤三、分别称取1g氯化钠、2mL水、1.5g中性氧化铝，置于离心管中，混匀，获得混合液；
步骤四、将步骤二获得的上清液加入经步骤三获得的混合液中，再加入2mL乙腈饱和正己烷，旋涡混匀后，在离心机上以大于或等于4000r/min离心5min或静置至完全分出液面层，其中，中间层为乙腈溶液层；
步骤五、通过步骤一到步骤四，取400μL乙腈层溶液氮吹至干，用于酶联免疫测定；
步骤六、鱼肉中阿维菌素和伊维菌素残留检测的前处理方法完毕。
所述步骤一中的称取鱼糜样品2g准确至0.01g。
所述步骤三中1.5g中性氧化铝，以中性氧化铝为分散固相萃取吸附剂，采用标准添加实验酶联免疫测定法，利用酶联免疫测定仪测定鱼肉中残留的阿维菌素和伊维菌素的空白值和回收率。
下面结合现有技术对本发明提供的前处理方法的先进性作详细说明：
一、现有国家标准和文献报道有关水产品中阿维菌素和伊维菌素残留检测方法和前处理技术对比见表1。
表1现有水产品中AVM、IVM残留检测方法和前处理技术对比
上表看出，无论是检测仪器采用液-质联用仪、液相色谱还是酶联免疫测定仪，水产品中阿维菌素和伊维菌素残留检测的样品前处理均采用乙腈提取，固相萃取(SPE)法净化，杂质吸附模式，收集全部流出液，且乙腈为SPE唯一操作溶剂，其中唯一不同是SPE小柱有AL-N和AL-B。其净化模式和SPE操作方式，说明SPE小柱的主要作用是去除杂质。该方法虽然应用广泛，但商品化的SPE小柱成本高，SPE操作要经过活化-上样-淋洗-洗脱等步骤，易造成样品损失，对操作人员要求较高，需借助固相萃取仪等专用设备才能完成。
基于以上原因，为适应酶联免疫法特异性好、快速筛选检测要求，在达到同样去除杂质目的并保证方法灵敏度前提下，我们采用更适宜高容量、低成本、净化一步完成的d-SPE净化技术，研究开发低成本、操作简单、适于大量样品检测的多残留样品前处理方法。
本发明提供的前处理方法将d-SPE前处理技术应用于水产品中AVM、IVM残留的酶联免疫快速筛选检测目前尚未见诸报道，与现有前处理技术相比，不同之处有以下几点：
1、首次将d-SPE净化技术应用于水产品中AVM和IVM残留的酶联免疫检测。
通过比较发现，本方法以d-SPE代替SPE，实现对水产品中残留AVM和IVM的提取净化，突出前处理过程的简单快速、易操作、低成本、高容量特点，适合酶联免疫快速筛选检测。
2、首次提出并优化NaCl—H2O—AL-N—乙腈饱和正己烷—乙腈提取液的d-SPE净化体系。
d-SPE净化以分散固相萃取吸附剂吸附杂质原理为基础，在选择d-SPE净化体系时，为保证前处理方法的回收率应同时考虑以下因素：一是尽量减少乙腈提取液中AVM和IVM在Al-N的吸附作用；二是保证AL-N对乙腈提取液的净化作用，特别是水产品基质复杂，乙腈提取液中的蛋白质、脂肪和其他脂类等干扰酶联免疫测定物质的去除。本方法借助H2O的加入改善d-SPE净化体系的极性破坏乙腈溶液中Al-N对AVM和IVM的吸附，NaCl的加入有助于净化液的分层除杂，H2O与NaCl协同作用共同保证了前处理过程的回收率。另外，乙腈饱和正己烷的加入在保证回收率的前提下，大大降低了样品提取液中脂肪对酶联免疫测定的干扰。
3、本发明提供的前处理方法，简化了样品前处理过程，实现净化、去脂过程一步完成。
本方法以d-SPE一个步骤代替现有SPE净化的活化、上样、淋洗、洗脱过程四个步骤，并在分散固相萃取过程同时进行正己烷除脂，实现了净化、去脂过程一步完成，在保证回收率的前提下，简化操作，降低成本，与酶联免疫法的高选择性相辅相成，实现了水产品中阿维菌素和伊维菌素残留的高灵敏度检测。
4、采用Al-N分散固相萃取吸附剂去除杂质，实现水产品中AVM和IVM的多残留检测。
实验证明，AL-B在d-SPE净化体系中对AVM和IVM吸附作用强于Al-N，会降低前处理过程回收率，故与现有酶联免疫吸附检测方法采用AL-B SPE柱的单一残留检测不同，本方法采用Al-N分散固相萃取剂均匀分散在具有一定极性的乙腈溶液中实现AVM和IVM的多残留检测。
5、实现关键点控制，保证方法有效性、稳定性。
本方法的d-SPE混合溶液中，仅乙腈溶液层用于后续试验，如何保持乙腈溶液与其他溶液彻底分开，是影响方法准确度和灵敏度的关键因素。本方法总结出关键控制要素来保证d-SPE操作准确可靠，即合理控制加样顺序，混匀时间，分层清晰透明，使用乙腈饱和正己烷，取乙腈层用于后续操作。
6、基于d-SPE的水产品中AVM和IVM残留的酶联免疫检测法与现有酶联免疫检测法相比，操作简单，成本低，多残留检测，灵敏度高，前处理方法不同，检测时间缩短，不同点详见表2。
表2 d-SPE净化水产品中AVM和IVM残留的酶免检测法与现有酶免检测法不同之处
二、本发明的方法实验分析
1、方法技术参数确定
本发明提供的淡水养殖鱼肉中阿维菌素和伊维菌素残留检测的前处理方法，主要适用于酶联免疫快速筛选检测，主要包括提取和净化。提取：主要采用乙腈涡旋提取；净化：采用分散固相萃取法一步完成；浓缩：采用氮吹或真空减压蒸馏；溶解：采用酶联免疫试剂盒提供的复溶工作液充分涡旋溶解，用于酶联免疫测定。
主要操作步骤如下：称取均匀的鱼糜样品2g(准确至0.01g)于50mL离心管，加入6mL乙腈，2000r/min涡旋混合震荡2min，4000r/min离心5min，上清液加入已混匀的1g氯化钠、2mL水、1.5g中性氧化铝混合液的离心管中，再加入2mL乙腈饱和正己烷，旋涡混匀后，以大于或等于4000r/min离心5min或静置至分层清晰透明，取400μL中间乙腈层溶液氮吹至干，用于酶联免疫测定。
本发明实现了水产品中阿维菌素和伊维菌素的多残留酶联免疫快速筛选检测，具有简单、快速、灵敏、稳定等特点。
本发明比较了分散固相萃取d-SPE、多功能杂质吸附逆向固相萃取(MAS)和传统的液-液分配萃取(LLE)等样品净化方法，鱼肉加标实验酶联免疫测定结果，发现多功能杂质吸附逆向固相萃取净化法回收率均低于60％，液-液分配萃取净化法回收率均为未检出，说明前者操作损失多，后者杂质较多干扰酶免法测定，净化效果不好，而分散固相萃取净化法回收率均在60％～120％之间，符合酶联免疫快速筛选检测要求，为最优前处理净化方法。
本发明还比较了不同分散固相萃取剂酸性氧化铝(AL-A)、中性氧化铝(AL-N)和碱性氧化铝(AL-B)的净化效果，标准添加实验酶联免疫测定结果表明，以中性氧化铝为分散固相萃取吸附剂的空白测定值较低且回收率最接近100％，是最适宜的净化萃取吸附剂。改变中性氧化铝的不同用量(1.0g，1.5g，2.0g)进行标准添加实验酶联免疫测定，1.5g中性氧化铝为最佳用量，其净化效果和回收率为最好。
本发明为进一步提高回收率，优化了Al-N-乙腈分散固相萃取d-SPE体系，依据及实验结果如下。一方面，引入2mL极性溶剂H2O，通过增加乙腈溶液环境的极性减少中性氧化铝在乙腈中对阿维菌素和伊维菌素的吸附，在一定程度上提高回收率。另一方面，由于H2O与乙腈混溶，增加了浓缩的难度，借助加入NaCl促进乙腈相与水相的分层，同时盐析效应更有利于AVM和IVM更易于分配在乙腈相中，亦可提高回收率。第三，对于高脂肪样品，加入2ml乙腈饱和正己烷至上述分散SPE体系中，即可有效去除样品脂肪，又能降低正己烷对AVM和IVM的溶解损失，保证回收率。加标实验酶免测定结果表明，正己烷(乙腈饱和)—NaCl—H2O—AL-N—乙腈分散固相萃取净化体系优于AL-N—乙腈分散固相萃取净化体系，其空白值最低，检出限2μg/kg，且2μg/kg、4μg/kg标准添加的回收率和精密度均在60％～120％和30％以内，符合相关标准要求。
2、方法性能指标
本前处理方法性能指标检出限、准确度和精密度借助商品化酶联免疫试剂盒进行酶联免疫测定，结果如下。
2.1检出限：以空白鱼肉样本20份平行处理测定及计算结果见表3，检出限为1.183μg/kg。
定量限：分别以2μg/kg浓度的AVM和IVM对空白鱼肉进行标准添加试验，分别进行六平行实验，计算回收率及变异系数。实验结果，AVM和IVM分别在1.258μg/kg～1.720μg/kg和1.210μg/kg～1.672μg/kg，回收率为62.9％～86％和60.5％～83.6％，异系数均小于30％。故无论是AVM还是IVM，本方法对标准添加样品的定量限均为2μg/kg。
表3空白样本测定及计算结果统计表(μg/kg)
2.2准确度和精密度
分别以2μg/kg、4μg/kg浓度AVM和IVM对空白鱼肉进行标准添加试验，并分别进行六平行，计算回收率及变异系数见表4。
表4准确度、精密度实验数据
综上所述，用上述d-SPE前处理方法提取净化水产品中残留的AVM和IVM，经酶联免疫实验测定，AVM和IVM的检出限均为2μg/kg，在2μg/kg、4μg/kg添加浓度水平上的回收率均为60％～120％，批内变异系数≤30％，批间变异系数≤40％。结果表明，基于d-SPE的水产品中AVM和IVM残留样品前处理方法符合国家关于酶联免疫快速筛选检测要求。