本发明属于食品安全检测和分析
技术领域：
，涉及一种可用于有机磷农药残留量检测的电化学检测传感器及其检测方法。
背景技术：
：我国是个人口大国、农业大国，每年进出口的农产品产量居世界首位，有机磷农药具有杀虫谱较宽、杀虫方式多样化、品种多、药效高、易降解、残留时间短、针对性强等特点，已成为了我国使用范围最广、使用量最大的一类杀虫剂，给我国带来了巨大的经济效益。但在另一方面，也给食品安全、生态系统等带来了巨大的危害。据最近报道的几宗有机磷中毒事件，忠县发生有机磷农药中毒事件导致3人死亡，11人入院；青岛出现的甲拌磷严重超标毒韭菜事件，导致11人中毒；武汉5.23有机磷事件导致多位患者出现急性中毒；江门市的甲胺磷急性中毒事件；安徽省祁门县某中学的18名学生因食用含有有机磷农药的青菜而中毒。近年来有机磷农药中毒事件频繁发生，带来了严重的社会影响，国家对有机磷农药使用的监管和要求已日益严格。国家对每种农药都规定了其最大残留限量(MRL)，这是各级检验检疫部门判定农产品是否合格的最基础的标准，然而在农药使用过程中广泛存在着“鸡尾酒”法，即同时使用多种作用相近的农药达到同一目的。这种方法既可以达到较好的实用效果，同时又可以避免采用单一一种农药而使其含量超过MRL而被判为不合格产品。但是，作用相近的多种农药虽然每一种都未超标，但其总量却有可能是超标的，从对人体和环境的影响效果来看，仍然是有一定危害并且需要引起重视的。有机磷类农药的危害性主要是由于有机磷容易与人体中的乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性中心结合，抑制AChE的催化活性，失去催化乙酰胆碱(Ach)水解的能力，从而使胆碱在人体内聚集，引起神经传导功能的絮乱，出现一系列中毒症状。如果农作物中存在多种有机磷类农药，虽然其中每一种的含量都低于国家规定的MRL值，但由于对AChE的抑制作用是可以加和的，因此仍然会有引起中毒的危险。目前用于有机磷残留检测的方法主要有气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法以及酶抑制法等。色谱类分析方法需要大型分析仪器，过程操作繁琐，不能实现现场检测；酶抑制法则由于仪器小型化、检测时间短等优势在有机磷快速检测领域占有一席之地。然而，由于所使用的酶来源多样，其选择性和活性都大有差异，给实际检测的重复性和可靠性带来了不利的影响。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种有机磷农药残留量的电化学检测传感器。所述的传感器可用于有机磷农药残留量的单独检测和总量检测。本发明的另一目的在于提供一种有机磷农药残留量检测的电化学方法。所述检测方法快速、高效、灵敏度高、稳定性好。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：一种有机磷农药残留量检测的电化学传感器，包括基底电极，其特征在于，所述电化学传感器的基底电极表面沉积有纳米金颗粒，巯基乙甲胺磷酰胺通过Au-S修饰在基底电极表面沉积的纳米金颗粒上。优选地，所述基底电极为玻碳电极。所述电化学传感器采用如下方法制备：首先将经过打磨、抛光和超声清洗的基底电极浸入氯金酸溶液中，采用恒电位法将氯金酸电化学还原为纳米金颗粒，并沉积于基底电极表面；再将巯基乙甲胺磷酰胺(TMA)溶液滴涂在基底电极表面、晾干，通过自组装巯基乙甲胺磷酰胺以Au-S键修饰到电极表面沉积的纳米金颗粒上；最后用巯基己醇溶液封闭纳米金颗粒表面的剩余活性位点。所述巯基乙甲胺磷酰胺(TMA)结构如下式所示，本发明实施例中采用以下方法制备：将N-溴代琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于磷酸缓冲溶液(PBS)室温搅拌，然后加入到巯基乙酸溶液中搅拌，最后再加入甲胺磷的盐酸溶液中搅拌反应；旋蒸溶剂后析出固体，即制得所述的TMA。一种有机磷农药残留量的电化学检测方法，包括以下步骤：(1)电化学传感器的制备：先将经过打磨、抛光和超声清洗的玻碳电极浸入氯金酸溶液中，以恒电位电化学还原法将氯金酸还原为纳米金颗粒，并沉积于玻碳电极表面，使用PBS缓冲溶液清洗玻碳电极并晾干；再将巯基乙甲胺磷酰胺(TMA)溶液滴涂在玻碳电极表面、晾干；最后用巯基己醇溶液封闭玻碳电极表面纳米金颗粒表面的剩余活性位点；制得电化学传感器；(2)标准溶液的配制：配制一组包括空白标样在内的含有不同已知浓度的有机磷农药样品的PBS缓冲溶液为标准溶液，其中含有相同浓度的乙酰胆碱酯酶(AChE)；(3)工作曲线的建立：将步骤(1)中制备的电化学检测传感器分别浸入步骤(2)中配制的标准溶液中孵育，孵育后用PBS缓冲溶液冲洗电化学检测传感器，再将冲洗后的电化学检测传感器置于含有K3[Fe(CN)6]的PBS缓冲溶液中进行方波伏安法(SWV)扫描，记录响应电流；空白标样的响应电流为I0，含有有机磷标准样品的响应电流为Ix，响应电流的增加值ΔI等于Ix与I0之差的绝对值；将所述ΔI与标准溶液中有机磷农药的浓度C绘制成ΔI-C工作曲线，采用线性回归法得到ΔI-C线性回归方程；(4)有机磷农药残留量的检测：将待测样品配制为含有与步骤(2)相同浓度的乙酰胆碱酯酶(AChE)的PBS缓冲溶液，按照与步骤(3)相同的方法对所述电化学传感器进行孵育和方波伏安法(SWV)扫描，记录响应电流；根据响应电流的增加值ΔI和ΔI-C线性回归方程，计算得到有机磷化合物残留量。所述有机磷农药残留量电化学检测方法，还可以对有机磷残留量的总量进行检测，进一步包括以下步骤：(5)有机磷农药残留总量检测：将步骤(3)中得到的不同有机磷检测对应的ΔI-C线性回归方程行进拟合(对步骤(3)中得到的不同有机磷对应的ΔI-C线性回归方程的斜率、截距分别求取平均值)，得到有机磷残留量总量检测的工作曲线；将待测样品配制为含有与步骤(2)相同浓度的乙酰胆碱酯酶(AChE)的PBS缓冲溶液，按照与步骤(3)相同的方法对所述电化学传感器进行孵育和方波伏安法(SWV)扫描，记录响应电流；根据响应电流的增加值与有机磷残留总量之间的工作曲线，计算得到有机磷农药残留总量。所述的有机磷农药包括但不限于倍硫磷、敌百虫、敌敌畏、毒死蜱、对硫磷、二嗪磷、甲胺磷、甲基嘧啶磷、乐果、辛硫磷和氧化乐果。本发明基于乙酰胆碱酯酶(AchE)和有机磷农药发生强烈的相互作用的原理，被结合到所述的电化学传感器上，从而改变电化学传感器的电化学响应信号，实现有机磷残留的检测。本发明的电化学传感器及其检测方法，无需酶促反应、检测时间短，可用于有机磷单独检测和总量检测。本发明所述的电化学传感器及检测方法可用于植物源性食品如蔬菜、水果，以及环境中的有机磷残留量的单独检测和总量检测。本发明提供的电化学传感器单独检测一种有机磷农药时的检测限为0.19～0.77ng/mL，线性范围为1～1500ng/mL；用于不同种类有机磷农药总量检测时，线性范围在50～1000ng/mL范围内，总量检测结果的相对误差小于10％。有益效果：本发明利用乙酰胆碱酯酶能够和有机磷类农药发生强烈结合作用的原理，提供了一种无需酶促反应、检测时间短、可用于有机磷单独检测和总量检测的电化学传感器及其检测方法。本发明所述电化学传感器采用化学修饰法制备，大大增强了传感器的稳定性及重复性，使得不同种类有机磷农药单独检测时的工作曲线极为接近，因而降低了总量检测工作曲线拟合时带来的误差，提高了总量检测结果的可靠性和准确性；同时，本发明与其他利用酶抑制法进行有机磷快速检测的方法所不同的是，本发明提供的电化学传感器和检测方法无需进行酶促反应，大大节省了检测时间，同时也避免了因为采用不同来源的酶所导致检测结果重复性差的问题。下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。本发明的保护范围并不以具体实施方式为限，而是由权利要求加以限定。附图说明图1为巯基乙甲胺磷酰胺(TMA)的氢核磁共振谱(1H-NMR)。图2a)-图2d)依次为电化学传感器分别对倍硫磷、敌百虫、敌敌畏和毒死蜱进行单独检测的SWV曲线图，其中每幅图中从上到下浓度依次为0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、600ng/mL、800ng/mL、1200ng/mL和1500ng/mL。图3a)-图3d)依次为电化学传感器分别对对硫磷、二嗪磷、甲胺磷和甲基嘧啶磷进行单独检测的SWV曲线图；其中每幅图中从上到下浓度依次为0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、600ng/mL、800ng/mL、1200ng/mL和1500ng/mL。图4a)-图4c)依次为电化学传感器分别对乐果、辛硫磷和氧化乐果进行单独检测的SWV曲线图；其中每幅图中从上到下浓度依次为0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、600ng/mL、800ng/mL、1200ng/mL和1500ng/mL。图5为对倍硫磷单独检测的ΔI-C工作曲线。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对
发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。实施例1有机磷农药残留量电化学检测传感器的制备(1)巯基乙甲胺磷酰胺(TMA)的制备将甲胺磷(0.1g)溶于10mL盐酸(0.1mol/L)中，在冰浴条件下搅拌1h，配制甲胺磷的盐酸溶液；将N-溴代琥珀酰亚胺(NHS，0.542g)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，0.254g)溶于磷酸盐缓冲溶于中在室温下搅拌3小时，再缓慢加入巯基乙酸(用碳酸氢钠溶液调节PH至中性)溶液中，继续搅拌2小时，将所得反应物加入到甲胺磷的盐酸溶液中继续室温下搅拌10小时后，室温下旋转蒸发出大部分溶剂，析出大量白色固体。减压抽滤，用少量冰水洗涤，制得TMA。其氢核磁共振谱(1H-NMR)见图1。(2)传感器的制备：将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉打磨至镜面，依次用无水乙醇-蒸馏水、蒸馏水超声清洗5min，再用蒸馏水冲洗干净；将处理好的玻碳电极浸入氯金酸溶液(质量百分比浓度为1％)中，以恒定电位(-0.2V)电化学沉积纳米金(持续时间为60s)；将上述电极用PBS缓冲溶液冲洗干净，晾干后将巯基乙甲胺磷酰胺水溶液(10μL，0.1mol/L)滴涂在电极上，置于37℃真空干燥箱内晾干；将共价修饰TMA后的电极置于的巯基己醇水溶液(质量百分比浓度为1％)中孵育30min，用以封闭纳米金表面的剩余活性位点，最后用PBS缓冲溶液将电极冲洗干净备用。实施例2有机磷标准样品的单独检测本实施例分别对有机磷标准样品进行单独检测，有机磷农药样品选自倍硫磷、敌百虫、敌敌畏、毒死蜱、对硫磷、二嗪磷、甲胺磷、甲基嘧啶磷、乐果、辛硫磷和氧化乐果。将实施例1中制备的电化学传感器分别浸入有机磷浓度依次为0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、600ng/mL、800ng/mL、1200ng/mL和1500ng/mL的PBS缓冲溶液(其中均含有浓度为10μg/mL的AchE)中进行孵育，用PBS缓冲溶液冲洗干净后置于含有K3[Fe(CN)6]的PBS缓冲溶液中进行方波伏安法(SWV)扫描，记录响应电流；空白标样的响应电流为I0，含有有机磷标样的响应电流为Ix，响应电流的增加值ΔI等于Ix与I0的差值；将ΔI与孵育液中有机磷的浓度C绘制成ΔI-C工作曲线，采用线性回归法得到ΔI-C线性回归方程。将待测样品在同样条件下采用相同方法对所述电化学传感器进行孵育和SWV扫描，记录响应电流；将响应电流的增加值ΔI代入ΔI-C线性回归方程，即可得到待测样品中相应有机磷的残留量。附图2a)-2d)、图3a)-3d)、图4a)-4c)依次为倍硫磷、敌百虫、敌敌畏、毒死蜱、对硫磷、二嗪磷、甲胺磷、甲基嘧啶磷、乐果、辛硫磷和氧化乐果单独检测的SWV曲线。附图5为对倍硫磷单独检测的ΔI-C工作曲线。上述有机磷单独检测的ΔI-C线性回归方程、线性相关系数(R)、线性范围及最低检测限见表1。表1有机磷残留量单独检测结果实施例3苹果中敌敌畏的加标检测称取清洗干净的苹果样品(三份平行样品，每份质量为50±0.005g)放入烧杯中，加入敌敌畏标准溶液，然后加入50mL水和100mL丙酮，用绞碎机绞碎提取3min。过滤后取100mL滤液置于分液漏斗中，加入15g氯化钠，剧烈振荡3min后静置，待溶液分层后用50mL二氯甲烷萃取水相，将丙酮和二氯甲烷提取液合并。以无水硫酸钠干燥除去其中水分，旋蒸浓缩至约2mL，用氮气将剩余液体吹干，最后加入10mL乙醇-水溶液(V：V＝1：1)，震荡至溶解，低温遮光保存待用。按照上述方法配制不加入敌敌畏的空白样品，和3个加入不同敌敌畏浓度的加标样品(标准加入法)，并以实施例2中所述方法对所述电化学传感器进行孵育和SWV扫描，记录响应电流；根据实施例2中得到的敌敌畏对应的响应电流的增加值ΔI和浓度C之间的ΔI-C线性回归方程，得到敌敌畏的残留量。检测回收率结果见表2。表2苹果中敌敌畏的加标检测结果实施例4青菜中敌百虫的加标检测称取清洗干净的青菜样品(三份平行样品，每份质量为50±0.005g)放入烧杯中，加入敌百虫标准溶液，然后加入50mL水和100mL丙酮，用绞碎机绞碎提取3min。过滤后取100mL滤液置于分液漏斗中，加入15g氯化钠，剧烈振荡3min后静置，待溶液分层后用50mL二氯甲烷萃取水相，将丙酮和二氯甲烷提取液合并。以无水硫酸钠干燥除去其中水分，旋蒸浓缩至约2mL，用氮气将剩余液体吹干，最后加入10mL乙醇-水溶液(V：V＝1：1)，震荡至溶解，低温遮光保存待用。按照上述方法配制不加入敌百虫的空白样品，和3个加入不同敌百虫浓度的加标样品(标准加入法)，并以实施例2中所述方法对所述电化学传感器进行孵育和SWV扫描，记录响应电流；根据实施例2中得到的敌百虫对应的响应电流的增加值ΔI和敌百虫浓度C之间的ΔI-C线性回归方程，得到敌百虫的残留量。检测回收率结果见表3。表3青菜中敌百虫的加标检测结果实施例5有机磷标准样品的总量检测(1)有机磷总量检测线性方程的建立：由实施例2中所得十一种有机磷单独检测的工作曲线可知，不同有机磷单独检测时工作曲线的表达式极为接近，其中斜率的平均值为-0.022458，其相对标准偏差为8.44％；截距的平均值为-6.188，因此将有机磷农药总量与响应电流的增加值ΔI之间的检测线性方程拟合为ΔI＝-0.022458C-6.188；(2)有机磷标准样品的总量检测：将毒死蜱：敌敌畏：辛硫磷：对硫磷按不同摩尔比混合溶于PBS缓冲溶液中，配制成一系列总浓度不同的待测样品。以实施例2中所述方法进行孵育和SWV扫描，记录响应电流；将响应电流的增加值ΔI代入步骤(1)中拟合的线性方程中，得到有机磷总量测定值。测定值与添加值的比较见表4和表5。表4有机磷农药总量检测(毒死蜱：敌敌畏：辛硫磷：对硫磷摩尔比＝1：1：1：1)添加浓度(ng/mL)800600400300200100501检测浓度(ng/mL)822.27577.82385.90316.21196.22106.754.1310.91回收率(％)102.896.396.4105.498.1106.7108.31090相对误差(％)+2.8-3.7-3.5+5.4-1.9+6.7+8.3+990表5有机磷总量检测(毒死蜱：敌敌畏：辛硫磷：对硫磷摩尔比＝1：2：3：4)添加浓度(ng/mL)1000800600400200100501检测浓度(ng/mL)986.2814.8631.8418.5195.194.453.98.54回收率(％)98.6101.9105.3104.697.594.4107.8854相对误差(％)-1.4+1.9+5.3+4.6-2.5-5.6+7.8+854当前第1页1 2 3