一种基于MoS2-PA-FA检测癌细胞上FR的方法技术领域本发明涉及癌细胞上FR检测的技术领域，更具体的说是一种基于MoS2-PA-FA检测癌细胞上FR的方法，本发明还涉及所述的MoS2-PA的合成方法。
背景技术：
一直以来，恶性肿瘤也就是癌症，是人类健康和生命安全的一个严重威胁。癌症细胞，是指一些拥有分裂潜能的细胞在致癌因素的作用下发生了恶性转化和克隆性增生而产生的一种新生物。并且癌细胞除了自身的生长失控外，还会侵入周围正常组织甚至可以经由体内的循环系统或者淋巴系统转移到身体的其他部分，从而引起身体病变甚至死亡。所以，癌症早期的诊断和及早的治疗具有重要的意义。但是癌症早期的抗原含量较低很难被发现，因此寻求另外的癌变物质至关重要，这也成为分析人员的重要追求。叶酸受体(folatereceptor,FR)就是一种很重要的量变物质，和癌症息息相关。叶酸受体是一种糖基磷脂酰肌醇偶联蛋白。除个别组织外,叶酸受体在正常组织上表达水平很低,而在许多肿瘤细胞表面过表达。叶酸受体与叶酸及其衍生物有高度的亲和性,基于这种特性,可将显像剂、治疗药物等与叶酸偶联,靶向给予肿瘤细胞,从而应用于肿瘤的影像诊断如核医学显像、核磁共振显像、荧光显像和肿瘤治疗如化疗、同位素治疗、免疫治疗、反义核苷酸治疗及基因治疗中。叶酸受体在许多上皮源性和非上皮源性恶性肿瘤细胞显著高表达，其表达水平大大高于正常细胞，具有组织特异性。FR是细胞摄取叶酸的重要途径，其机制为受体介导的内吞效应，这种机制具有亲和力高、特异性强的特点，有良好的物质转运应用潜能。大量研究结果显示，连接叶酸分子的核素、荧光素以及磁共振成像对比剂等靶向诊断试剂通过与FR特异结合，能够检测出阳性表达FR的肿瘤组织，而正常组织无此效应，提示FR靶向的肿瘤诊断策略的可行性和应用前景。FR的定量测定一直是人们关注的焦点，其中标记性分析技术包括放毛细管电泳化学发光分析、高效液相色谱化学发光分析、微流控芯片化学发光分析、电化学分析、电致发光分析、荧光技术和拉曼光谱分析等。但是这些分析方法一般耗时较长并且拥有繁琐的加样、温育、洗涤等操作过程，而且操作人员和癌细胞的接触较多，可能对操作的人员的身体健康造成危害。而且有些测定速度快、灵敏度高、检测限低的检测手段需要仪器昂贵，不能在发展中国家普及。基于以上技术，我们需要找一种廉价简单的操作方法，高灵敏度、低检测限、高选择性检测细胞上FR的含量，达到及时控制疾病的目的。不难发现叶酸和叶酸受体具有特异性是别的作用，当叶酸上同事连接有荧光基团和猝灭基团时没有荧光，但是当FR和叶酸结合后，猝灭基团会和荧光基团分离，从而荧光恢复，从而达到检测目的。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供了一种基于MoS2-PA-FA检测癌细胞上FR的方法。为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：一种基于MoS2-PA-FA检测癌细胞上FR的方法，其包括以下步骤：(1)将实验所需要的有机试剂进行蒸馏纯化；(2)将2.76g1,4-二甲氧基苯、20mL乙酸、2mL蒸馏水、1mL浓硫酸、9.22g高碘酸钠和10.22g碘混匀，加热到70℃，冷凝回流36h，然后过滤，用二氯甲烷洗涤溶解固体，饱和亚硫酸钠溶液洗至二氯甲烷颜色不变，再用氯化钠洗涤有机相，干燥、过滤、旋蒸、重结晶得到产品2；(3)将1.17g步骤(2)所得产品2与5mL甲醇、5mL四氢呋喃、0.79g碳酸钾混合，70℃冷凝回流10h，旋蒸，二氯甲烷洗涤旋蒸后得到的液体，分液，氯化钠洗涤分液，再用无水硫酸钠干燥洗涤后得分液，过滤、旋蒸、过硅胶柱子，得到产品3；(4)将0.58g步骤(3)所得产品3与5mL三乙胺、15mL四氢呋喃、0.02gPd(pph3)2Cl2、0.023g碘化亚铜混匀，用恒压漏斗加入0.9mL三甲基硅基乙炔，加热到75℃冷凝回流10h，饱和氯化铵洗涤反应液，无水硫酸钠除水，然后旋蒸除杂，乙醚洗涤旋蒸液，再进行旋蒸，得到产品4；(5)将1.16g步骤(4)所得产品4与5mL三乙胺、15mL四氢呋喃、0.02gPd(pph3)2Cl2、3.27g4-碘苯甲酸甲酯混匀，70℃冷凝回流3h，过夜，用饱和氯化铵溶液洗涤，分液去水，然后用饱和氯化钠洗涤，二氯甲烷洗涤分液，将得到的液体用无水硫酸钠干燥过滤，加入2药匙硅胶粉，旋蒸，得到产品5；(6)将0.1g步骤(5)所得产品5与8mL甲醇、15mL四氢呋喃、1.0g氢氧化钾混合，75℃冷凝回流5h，冷却后向反应液中加入10mL10％的盐酸、50mL蒸馏水，三氯甲烷洗涤旋蒸干燥后得到产品6，即荧光苯炔有机物PA，分子式为C26H18O6；(7)合成MoS2纳米片；(8)将合成的苯炔有机物PA和MoS2纳米片用连接剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺混合液进行复合，然后在得到的复合物上修饰上叶酸FA，得到复合物MoS2-PA-FA；(9)将MoS2-PA-FA和癌细胞共同培养一段时间后，检测荧光强度，根据荧光恢复值测得FR的含量。一种基于MoS2-PA-FA检测癌细胞上FR的方法，其特征是，所述方法包括如下步骤：(1)MoS2纳米片的合成步骤：0.242g的Na2MoO4·2H2O和0.381g硫脲溶解到60mL蒸馏水中，将已经溶解的很均匀的溶液转移到洗净的高压釜中，在温度为210℃时保持24个小时；然后经过多次的离心之后收集到黑色沉淀物，最后用水和乙醇洗涤沉淀至少三次，在80℃下干燥了12小时后，便可以得到干燥的MoS2纳米片；(2)取1mg权利要求1步骤(6)得到的荧光苯炔有机物PA和1mg权利要求2步骤(1)得到的MoS2纳米片于1mL含有连接剂的磷酸盐缓冲溶液中，向其中加入0.1mL0.1％的叶酸FA溶液，在室温下反应5h，得到MoS2-PA-FA；(3)将0.5mL权利要求2步骤(2)得到的MoS2-PA-FA混合液加入到培养好的癌细胞上，培养30min，然后利用荧光分光光度计测定其荧光值，根据荧光恢复值测得FR的含量。本发明的有益效果：(1)利用MoS2-PA-FA与FR的特异性结合来定量检测癌细胞上FR的含量，选择性好、灵敏度高、检测限低；(2)本发明所合成的MoS2-PA-FA操作简单、可批量生产、可用于癌细胞上FR的实时监测；(3)本发明利用荧光分光光度计的方法进行测定操作快速简单，反应及结果均由仪器自动完成和记录，避免了主观因素的影响，并保证有很好的重复性，便于现场检测。附图说明下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细描述。【图1】检测FR原理图。具体实施方式一种基于MoS2-PA-FA检测癌细胞上FR的方法，其包括以下步骤：(1)将实验所需要的有机试剂进行蒸馏纯化；(2)将2.76g1,4-二甲氧基苯、20mL乙酸、2mL蒸馏水、1mL浓硫酸、9.22g高碘酸钠和10.22g碘混匀，加热到70℃，冷凝回流36h，然后过滤，用二氯甲烷洗涤溶解固体，饱和亚硫酸钠溶液洗至二氯甲烷颜色不变，再用氯化钠洗涤有机相，干燥、过滤、旋蒸、重结晶得到产品2；(3)将1.17g步骤(2)所得产品2与5mL甲醇、5mL四氢呋喃、0.79g碳酸钾混合，70℃冷凝回流10h，旋蒸，二氯甲烷洗涤旋蒸后得到的液体，分液，氯化钠洗涤分液，再用无水硫酸钠干燥洗涤后得分液，过滤、旋蒸、过硅胶柱子，得到产品3；(4)将0.58g步骤(3)所得产品3与5mL三乙胺、15mL四氢呋喃、0.02gPd(pph3)2Cl2、0.023g碘化亚铜混匀，用恒压漏斗加入0.9mL三甲基硅基乙炔，加热到75℃冷凝回流10h，饱和氯化铵洗涤反应液，无水硫酸钠除水，然后旋蒸除杂，乙醚洗涤旋蒸液，再进行旋蒸，得到产品4；(5)将1.16g步骤(4)所得产品4与5mL三乙胺、15mL四氢呋喃、0.02gPd(pph3)2Cl2、3.27g4-碘苯甲酸甲酯混匀，70℃冷凝回流3h，过夜，用饱和氯化铵溶液洗涤，分液去水，然后用饱和氯化钠洗涤，二氯甲烷洗涤分液，将得到的液体用无水硫酸钠干燥过滤，加入2药匙硅胶粉，旋蒸，得到产品5；(6)将0.1g步骤(5)所得产品5与8mL甲醇、15mL四氢呋喃、1.0g氢氧化钾混合，75℃冷凝回流5h，冷却后向反应液中加入10mL10％的盐酸、50mL蒸馏水，三氯甲烷洗涤旋蒸干燥后得到产品6，即荧光苯炔有机物PA，分子式为C26H18O6；(7)合成MoS2纳米片；(8)将合成的苯炔有机物PA和MoS2纳米片用连接剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺混合液进行复合，然后在得到的复合物上修饰上叶酸FA，得到复合物MoS2-PA-FA；(9)将MoS2-PA-FA和癌细胞共同培养一段时间后，检测荧光强度，根据荧光恢复值测得FR的含量。一种基于MoS2-PA-FA检测癌细胞上FR的方法，其特征是，所述方法包括如下步骤：(1)MoS2纳米片的合成步骤：0.242g的Na2MoO4·2H2O和0.381g硫脲溶解到60mL蒸馏水中，将已经溶解的很均匀的溶液转移到洗净的高压釜中，在温度为210℃时保持24个小时；然后经过多次的离心之后收集到黑色沉淀物，最后用水和乙醇洗涤沉淀至少三次，在80℃下干燥了12小时后，便可以得到干燥的MoS2纳米片；(2)取1mg权利要求1步骤(6)得到的荧光苯炔有机物PA和1mg权利要求2步骤(1)得到的MoS2纳米片于1mL含有连接剂的磷酸盐缓冲溶液中，向其中加入0.1mL0.1％的叶酸FA溶液，在室温下反应5h，得到MoS2-PA-FA；(3)将0.5mL权利要求2步骤(2)得到的MoS2-PA-FA混合液加入到培养好的癌细胞上，培养30min，然后利用荧光分光光度计测定其荧光值，根据荧光恢复值测得FR的含量。实施例1(Hela细胞)一种基于MoS2-PA-FA检测癌细胞上FR的方法，其特征是，所述方法包括如下步骤：(1)将2.76g1,4-二甲氧基苯、20mL乙酸、2mL蒸馏水、1mL浓硫酸、9.22g高碘酸钠和10.22g碘混匀，加热到70℃，冷凝回流36h，然后过滤，用二氯甲烷洗涤溶解固体，饱和亚硫酸钠溶液洗至二氯甲烷颜色不变，再用氯化钠洗涤有机相，干燥、过滤、旋蒸、重结晶得到产品2；(2)将1.17g(1)所得产品2与5mL甲醇、5mL四氢呋喃、0.79g碳酸钾混合，70℃冷凝回流10h，旋蒸，二氯甲烷洗涤旋蒸后得到的液体，分液，氯化钠洗涤分液，再用无水硫酸钠干燥洗涤后得分液，过滤、旋蒸、过硅胶柱子，得到产品3；(3)将0.58g(2)所得产品3与5mL三乙胺、15mL四氢呋喃、0.02gPd(pph3)2Cl2、0.023g碘化亚铜混匀，用恒压漏斗加入0.9mL三甲基硅基乙炔，加热到75℃冷凝回流10h，饱和氯化铵洗涤反应液，无水硫酸钠除水，然后旋蒸除杂，乙醚洗涤旋蒸液，再进行旋蒸，得到产品4；(4)将1.16g(3)所得产品4与5mL三乙胺、15mL四氢呋喃、0.02gPd(pph3)2Cl2、3.27g4-碘苯甲酸甲酯混匀，70℃冷凝回流3h，过夜，用饱和氯化铵溶液洗涤，分液去水，然后用饱和氯化钠洗涤，二氯甲烷洗涤分液，将得到的液体用无水硫酸钠干燥过滤，加入2药匙硅胶粉，旋蒸，得到产品5；(5)将0.1g(4)所得产品5与8mL甲醇、15mL四氢呋喃、1.0g氢氧化钾混合，75℃冷凝回流5h，冷却后向反应液中加入10mL10％的盐酸、50mL蒸馏水，三氯甲烷洗涤旋蒸干燥后得到产品6，即PA；(6)MoS2纳米片的合成步骤：0.242g的Na2MoO4·2H2O和0.381g硫脲溶解到60mL蒸馏水中，将已经溶解的很均匀的溶液转移到洗净的高压釜中，在温度为210℃时保持24个小时。然后经过多次的离心之后收集到黑色沉淀物，最后用水和乙醇洗涤沉淀至少三次，在80℃下干燥了12小时后，便可以得到干燥的MoS2纳米片；(7)取1mg(5)得到的PA和1mg(6)得到的MoS2纳米片于1mL含有连接剂的磷酸盐缓冲溶液中，向其中加入0.1mL0.1％的叶酸FA溶液，在室温下反应5h，得到MoS2-PA-FA；(8)将0.5mL(7)得到的MoS2-PA-FA混合液加入到培养好的Hela细胞上，培养30min，然后利用荧光分光光度计测定其荧光值，根据荧光恢复值测得FR的含量。实施例2(HepG2细胞)合成步骤同实施例1，不同的是(8)将0.5mL(7)得到的MoS2-PA-FA混合液加入到培养好的HepG2细胞上，培养30min，然后利用荧光分光光度计测定其荧光值，根据荧光恢复值测得FR的含量。实施例3(A549细胞)合成步骤同实施例1，不同的是(8)将0.5mL(7)得到的MoS2-PA-FA混合液加入到培养好的A549细胞上，培养30min，然后利用荧光分光光度计测定其荧光值，根据荧光恢复值测得FR的含量。实施例4(MCF-7细胞)合成步骤同实施例1，不同的是(8)将0.5mL(7)得到的MoS2-PA-FA混合液加入到培养好的MCF-7细胞上，培养30min，然后利用荧光分光光度计测定其荧光值，根据荧光恢复值测得FR的含量。