单粒子束散射光强分布的测量装置及测量方法与流程

本发明涉及光学与测量领域，具体地涉及一种单粒子束散射光强分布的测量装置及测量方法。

背景技术：

液体中微粒计数和粒径测量在临床诊断、工业和环境检测中有重要作用。其中，流式细胞术是生物临床快速诊断和细胞分析领域常用的多参数测量方法。待测样品悬液在鞘液的约束下通过喷嘴，形成单细胞液流，并被入射激光照射。光电倍增管接收样品微粒的散射光或荧光信号，由计算机对检测数据进行分析处理。与粒子群整体测量相比，流式细胞术能获得更加精确的结果。然而，流式细胞术需要的样本量较大、仪器复杂、使用和维护不便。

由于使用微流控芯片进行微粒计数和粒径测量的方法相比传统的计数和测量方法具有很低的样本消耗量、可以大大缩短测量时间、简化操作且易于做成便携设备应用于现场测试等优点，已有研究人员提出基于微流控芯片技术的流式细胞术测量装置及方法。在测量过程中，通过流体将样品微粒限制在微流通道中心流动，使样品形成单粒子流，从而避免了通道阻塞、样品被通道壁粘黏或吸收、样品重叠等问题。

然而，现有的基于微流控芯片的流式细胞术测量装置大多只是通过鞘液在二维平面上对样品流进行限制，因而不能使样品流成为圆柱形流体，且样品微粒容易偏离样品流的中心轴线，影响了测量精确度。另外，由于采用了光电倍增管作为光接收器件，从而限制了散射光的测量角度，不能实现散射光强分布的测量。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的缺陷，提供了一种基于微流控芯片的单粒子束散射测量装置及其测量方法，其可实时测量流经微通道的单粒子束中单个微粒的散射光强分布，且测量速度快、精度高。

为实现上述目的，本发明提供了一种单粒子束散射光强分布的测量装置，它包括光源、分光光路、光接收和探测组件以及微流控芯片组件，所述光源包括主测量光源、辅助测量光源和系统调整光源；所述分光光路包括分光镜和PIN管；所述光接收和探测组件包括90°离轴抛物面反射镜、望远镜镜组、光阑、滤光片、ICCD探测器、信号探测及发生电路、复合滤光片、PMT探测器、示波器和计算机；所述微流控芯片组件包括微流控芯片、光屏、三轴调节具和微流泵；其中，所述主测量光源、所述分光镜、所述90°离轴抛物面反射镜和所述三轴调节具依次设置在同一第一直线上，所述分光镜将所述主测量光源发射的激光分为主光路和参考光路，所述主光路与所述第一直线重合，所述参考光路与所述主光路垂直，所述PIN管位于所述参考光路上，所述系统调整光源、所述望远镜镜组、所述光阑、所述滤光片和所述ICCD探测器依次设置在同一第二直线上，所述系统调整光源与所述90°离轴抛物面反射镜的抛物面相对，所述光屏设置在所述三轴调节具上且位于所述90°离轴抛物面反射镜的焦点处，所述微流控芯片设置在所述三轴调节具中，所述微流泵与所述微流控芯片连接，所述辅助测量光源位于所述微流控芯片的左侧，所述复合滤光片和所述PMT探测器依次设于所述微流控芯片的右侧，所述PIN管、所述示波器、所述PMT探测器、所述信号探测及发生电路、所述ICCD探测器和所述计算机依次连接。

进一步地，所述微流控芯片包括圆环形鞘液输入流道、直线形样品液输入流道和直线形主流道，所述直线形样品液输入流道和所述直线形主流道位于同一第三直线上，所述圆环形鞘液输入流道关于所述第三直线对称，所述圆环形鞘液输入流道的一端设有鞘液输入孔，所述圆环形鞘液输入流道的另一端与所述直线形主流道连通，所述样品液输入流道被所述鞘液输入流道包围且与所述主流道连通，所述样品液输入流道上设有样品液输入孔，所述主流道上设有输出孔。

进一步地，所述样品液输入流道和所述鞘液输入流道的直径均小于所述主流道的直径。

进一步地，所述主流道的中部为所述微流控芯片的观测区，所述微流控芯片的观测面为圆柱面，所述圆柱面位于所述观测区内且所述圆柱面的轴线与所述主流道的轴线重合，所述微流控芯片的底面为平面。

进一步地，所述主测量光源和所述辅助测量光源均为激光器，所述系统调整光源为平行光管。

另外，本发明还提供了一种单粒子束散射光强分布的测量方法，该方法包括如下步骤：

(1)配置系统调整光源、90°离轴抛物面反射镜、光屏和三轴调节具，所述90°离轴抛物面反射镜和所述三轴调节具位于同一直线上，所述系统调整光源与所述90°离轴抛物面反射镜的光轴平行，所述光屏安装在所述三轴调节具上且位于所述90°离轴抛物面反射镜的焦点处；

(2)配置PMT探测器和示波器，所述PMT探测器位于所述三轴调节具的右侧，将所述PMT探测器与所述示波器连接，根据所述示波器的读数调节所述PMT探测器的位置和方向，使所述PMT探测器对准所述90°离轴抛物面反射镜的焦点；

(3)撤去所述光屏，在所述三轴调节具上安装微流控芯片，所述微流控芯片的观测面朝向所述90°离轴抛物面反射镜，所述微流控芯片的观测区与所述90°离轴抛物面反射镜的光轴在同一高度，通过所述三轴调节具调节所述微流控芯片的X轴、Y轴和Z轴的位置，根据所述示波器的读数，使所述PMT探测器的输出信号达到极大值，调节完成后，所述微流控芯片位于所述90°离轴抛物面反射镜的焦点处；

(4)撤去所述系统调整光源并配置主测量光源和分光镜，所述分光镜位于所述主测量光源和所述90°离轴抛物面反射镜之间，所述分光镜将所述主测量光源发射的激光分为主光路和参考光路，所述主光路、所述主测量光源、所述90°离轴抛物面反射镜和所述三轴调节具位于同一直线上，所述参考光路与所述主光路垂直；

(5)根据所述示波器的读数调节所述主测量光源的位置和方向，使所述PMT探测器的输出信号达到极大值，完成所述主测量光源与所述90°离轴抛物面反射镜和所述微流控芯片的对准调节；

(6)配置PIN管，所述PIN管位于所述分光镜的所述参考光路上，同时将所述PIN管与所述示波器连接，以实时监测所述主测量光源发射的主激光的光强波动；

(7)配置辅助测量光源，所述辅助测量光源位于所述三轴调节具的左侧，调节所述辅助测量光源的位置和方向，使其发射的辅助激光照射到所述微流控芯片的观测区上，且照射点略高于所述主测量光源的照射点，从而使所述PMT探测器接收到由所述微流控芯片散射的由所述辅助测量光源发射的辅助激光；

(8)在所述PMT探测器和所述三轴调节具之间配置复合滤光片，调节所述复合滤光片的位置及所述辅助测量光源的高度，使所述PMT探测器同时接收到由所述微流孔芯片散射的由所述主测量光源发射的所述主激光和所述辅助测量光源发射的所述辅助激光；

(9)配置微流泵，将所述微流泵与所述微流控芯片连接，鞘液通过所述微流泵经由所述微流控芯片的鞘液输入孔泵入所述微流控芯片，样品液通过所述微流泵经由所述微流控芯片的样品液输入孔泵入所述微流控芯片中，所述鞘液包围所述样品液，并限制所述样品液的流动，从而使所述样品液成为单粒子束；

(10)当所述样品液流过所述微流控芯片的观测区时，根据所述示波器上显示的两个相邻峰值的时间差和所述复合滤光片的通光孔的距离计算出所述样品液的流速；

(11)配置信号探测及发生电路和ICCD探测器，依次将所述PMT探测器、所述信号探测及发生电路和所述ICCD探测器连接，所述ICCD探测器的接收面与所述90°离轴抛物面反射镜的光轴垂直，所述PMT探测器发送光强信号至所述信号探测及发生电路，所述信号探测及发生电路发送探测触发信号至所述ICCD探测器，用以启动所述ICCD探测器，且所述信号探测及发生电路从接收所述光强信号到发送所述探测触发信号之间的时间差由所述样品液的流速决定；

(12)配置望远镜镜组、光阑和滤光片，所述望远镜镜组、所述光阑、所述滤光片和所述ICCD探测器依次位于同一直线上，所述望远镜镜组与所述90°离轴抛物面反射镜的光轴平行且面向所述90°离轴抛物面反射镜，将所述ICCD探测器与计算机连接，所述ICCD探测器获取所述样品液中样品微粒的散射图案，并将所述样品微粒的散射图案发送至所述计算机；

(13)人工给入触发信号以启动所述ICCD探测器，从而获得背景图案并将所述背景图案发送至所述计算机；

(14)所述计算机用所述样品微粒的散射图案的强度减去所述背景图案的强度，得到单粒子束的散射光强分布。

进一步地，所述微流控芯片包括圆环形鞘液输入流道、直线形样品液输入流道和直线形主流道，所述直线形样品液输入流道和所述直线形主流道位于同一直线上，所述圆环形鞘液输入流道关于所述直线对称，所述圆环形鞘液输入流道的一端设有鞘液输入孔，所述圆环形鞘液输入流道的另一端与所述直线形主流道连通，所述样品液输入流道被所述鞘液输入流道包围且与所述主流道连通，所述样品液输入流道上设有样品液输入孔，所述主流道上设有输出孔。

进一步地，所述主流道的中部为所述微流控芯片的观测区，所述微流控芯片的观测面为圆柱面，所述圆柱面位于所述观测区内且所述圆柱面的轴线与所述主流道的轴线重合，所述微流控芯片的底面为平面。

进一步地，所述鞘液由硅油和石蜡油组成，所述鞘液的折射率等于所述微流控芯片的折射率，所述样品液由待测粒子样品溶液加去离子水稀释而成，稀释体积比为1:1000～1:10000，所述鞘液与所述样品液不互溶。

进一步地，所述微流控芯片的制作方法包括以下步骤：

(a)对所述微流控芯片的流道的结构进行仿真，以确定所述流道的尺寸；

(b)以硅单晶片为第一基底，将第一负光胶涂覆在所述第一基底上，对所述第一负光胶和所述第一基底通过两次光刻工艺制作所述微流控芯片的观测层的平面模板；

(c)用亚克力材料制作所述观测层的半圆柱面模板，用所述观测层的平面模板和半圆柱面模板对第一聚二甲基硅氧烷进行倒模，并进行烤制和固化且去除所述观测层的平面模板和半圆柱面模板，得到所述微流控芯片的观测层；

(d)以硅单晶片为第二基底，将第二负光胶涂覆在所述第二基底上，对所述第二负光胶和所述第二基底通过两次光刻工艺制作所述微流控芯片的底层的模板；

(e)用所述底层的模板对第二聚二甲基硅氧烷进行倒模，并进行烤制和固化且去除所述底层的模板，得到所述微流控芯片的底层；

(f)在紫外线的作用下对所述底层和所述观测层进行臭氧处理和封合，得到完整的所述微流控芯片。

本发明的有益效果在于：本发明的微流控芯片通过三维流体聚焦，使样品流成为圆柱形流体，实现了单粒子束环境的构建和精确定位；微流控芯片的观测面呈圆柱形，降低了光在芯片-空气界面折射对测量结果的影响。另外，由于本发明采用了由90°离轴抛物面反射镜、望远镜镜组、光阑和滤光片组成的光接收组件，因而包括了大范围的散射光测量角度；本发明采用了辅助测量光源、复合滤光片、PMT探测器、示波器从而实现了流经微流控芯片的单个微粒的散射光强分布的实时、准确测量。

附图说明

图1为在测量阶段，本发明单粒子束散射光强分布的测量装置的俯视示意图。

图2为在调整阶段，本发明粒子束散射光强分布的测量装置的俯视示意图。

图3为在测量阶段，本发明的复合滤光片、PMT探测器和示波器的连接示意图。

图4为本发明的微流控芯片的一个角度的结构示意图。

图5为本发明的微流控芯片的另一个角度的结构示意图。

图6为本发明的单粒子束散射光强分布的测量方法的流程图。

图7为本发明的微流控芯片的制作方法的流程图。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

参考图1-3，本实施例的单粒子束散射光强分布的测量装置包括：包括光源、分光光路、光接收和探测组件以及微流控芯片组件。

具体地，所述光源包括主测量光源10、辅助测量光源11和系统调整光源12。所述分光光路包括分光镜20和PIN管21。所述光接收和探测组件包括90°离轴抛物面反射镜30、望远镜镜组31、光阑32、滤光片33、ICCD探测器34、信号探测及发生电路35、复合滤光片36、PMT探测器37、示波器38和计算机39。所述微流控芯片组件包括微流控芯片40、光屏41、三轴调节具42和微流泵43。

其中，所述主测量光源10、所述分光镜20、所述90°离轴抛物面反射镜30和所述三轴调节具42依次设置在同一第一直线上，所述分光镜20将所述主测量光源10发射的激光分为主光路和参考光路，所述主光路与所述第一直线重合，所述参考光路与所述主光路垂直，所述PIN管21位于所述参考光路上，所述系统调整光源12、所述望远镜镜组31、所述光阑32、所述滤光片33和所述ICCD探测器34依次设置在同一第二直线上，所述系统调整光源12与所述90°离轴抛物面反射镜30的抛物面相对，所述光屏(未图示)设置在所述三轴调节具42上且位于所述90°离轴抛物面反射镜30的焦点处，所述微流控芯片40设置在所述三轴调节具42中，所述微流泵43与所述微流控芯片40连接，所述辅助测量光源11位于所述微流控芯片40的左侧，所述复合滤光片36和所述PMT探测器37依次设于所述微流控芯片40的右侧，所述PIN管21、所述示波器38、所述PMT探测器37、所述信号探测及发生电路35、所述ICCD探测器34和所述计算机39依次连接。

进一步地，所述主测量光源10和所述辅助测量光源11均为激光器，所述系统调整光源12为平行光管。所述主测量光源10和所述辅助测量光源11的波长不同。所述主测量光源10上设有主测量光源调节具10a，所述系统调整光源12设有系统调整光源调节具12a，所述PIN管21设有PIN管调节具21a，所述复合滤光片36设有复合滤光片调节具36a，所述PMT探测器37设有PMT探测器调节具37a。

详细地，参考图4-5，所述微流控芯片40包括圆环形鞘液输入流道401、直线形样品液输入流道402和直线形主流道403，所述直线形样品液输入流道402和所述直线形主流道403位于同一直线上，所述圆环形鞘液输入流道401关于所述直线对称，所述圆环形鞘液输入流道401的一端设有鞘液输入孔(未图示)，所述圆环形鞘液输入流道401的另一端与所述直线形主流道403连通，所述样品液输入流道402被所述鞘液输入流道401包围且与所述主流道403连通，所述样品液输入流道402上设有样品液输入孔(未图示)，所述主流道403上设有输出孔(未图示)。在优选的实施例中，所述样品液输入流道402的直径和所述鞘液输入流道401直径均小于所述主流道403的直径。其中，所述鞘液由硅油和石蜡油组成，所述鞘液的折射率等于所述微流控芯片40的折射率，所述样品液由待测粒子样品溶液加去离子水稀释而成，稀释体积比为1:1000～1:10000，所述鞘液与所述样品液不互溶。

进一步地，所述主流道403的中部为所述微流控芯片40的观测区C，所述微流控芯片的观测面为圆柱面，所述圆柱面位于所述观测区C中，所述圆柱面的轴线与所述主流道403的轴线重合，所述微流控芯片40的底面为平面。

参考图6-7，本实施例的单粒子束散射光强分布的测量方法包括：

步骤S1：配置系统调整光源12、90°离轴抛物面反射镜30、光屏(未图示)和三轴调节具42，所述90°离轴抛物面反射镜30和所述三轴调节具42位于同一直线上，所述系统调整光源12与所述90°离轴抛物面反射镜30的光轴平行，所述光屏安装在所述三轴调节具42上且位于所述90°离轴抛物面反射镜30的焦点处；

步骤S2：配置PMT探测器37和示波器38，所述PMT探测器37位于所述三轴调节具42的右侧，将所述PMT探测器37与所述示波器38连接，根据所述示波器38的读数调节所述PMT探测器37的位置和方向，使所述PMT探测器37对准所述90°离轴抛物面反射镜30的焦点；

步骤S3：撤去所述光屏，在所述三轴调节具42上安装微流控芯片40，所述微流控芯片40的观测面朝向所述90°离轴抛物面反射镜30，所述微流控芯片40的观测区C与所述90°离轴抛物面反射镜30的光轴在同一高度，通过所述三轴调节具42调节所述微流控芯片40的X轴、Y轴和Z轴的位置，根据所述示波器38的读数，使所述PMT探测器37的输出信号达到极大值，调节完成后，所述微流控芯片40位于所述90°离轴抛物面反射镜30的焦点处；

步骤S4：撤去所述系统调整光源12并配置主测量光源10和分光镜20，所述分光镜20位于所述主测量光源10和所述90°离轴抛物面反射镜30之间，所述分光镜20将所述主测量光源10发射的激光分为主光路和参考光路，所述主光路、所述主测量光源10、所述90°离轴抛物面反射镜30和所述三轴调节具42位于同一直线上，所述参考光路与所述主光路垂直；

步骤S5：根据所述示波器38的读数调节所述主测量光源10的位置和方向，使所述PMT探测器37的输出信号达到极大值，完成所述主测量光源10与所述90°离轴抛物面反射镜30和所述微流控芯片40的对准调节；

步骤S6：配置PIN管21，所述PIN管21位于所述分光镜20的所述参考光路上，同时将所述PIN管21与所述示波器38连接，以实时监测所述主测量光源10发射的主激光的光强波动；

步骤S7：配置辅助测量光源11，所述辅助测量光源11位于所述三轴调节具42的左侧，调节所述辅助测量光源11的位置和方向，使其发射的辅助激光照射到所述微流控芯片40的观测区C上，且照射点略高于所述主测量光源10的照射点，从而使所述PMT探测器37接收到由所述微流控芯片40散射的由所述辅助测量光源11发射的辅助激光；

步骤S8：在所述PMT探测器37和所述三轴调节具42之间配置复合滤光片36，调节所述复合滤光片36的位置及所述辅助测量光源11的高度，使所述PMT探测器37同时接收到由所述微流孔芯片40散射的由所述主测量光源10发射的所述主激光和所述辅助测量光源11发射的所述辅助激光；

步骤S9：配置微流泵43，将所述微流泵43与所述微流控芯片40连接，鞘液通过所述微流泵43经由所述微流控芯片40的鞘液输入孔泵入所述微流控芯片40，样品液通过所述微流泵43经由所述微流控芯片40的样品液输入孔泵入所述微流控芯片40中，所述鞘液包围所述样品液，并限制所述样品液的流动，从而使所述样品液成为单粒子束；

步骤S10：当所述样品液流过所述微流控芯片40的观测区时，根据所述示波器38上显示的两个相邻峰值的时间差和所述复合滤光片36的通光孔的距离计算出所述样品液的流速；

步骤S11：配置信号探测及发生电路35和ICCD探测器34，依次将所述PMT探测器37、所述信号探测及发生电路35和所述ICCD探测器34连接，所述ICCD探测器34的接收面与所述90°离轴抛物面反射镜30的光轴垂直，所述PMT探测器37发送光强信号至所述信号探测及发生电路35，所述信号探测及发生电路35发送探测触发信号至所述ICCD探测器34，用以启动所述ICCD探测器34，所述信号探测及发生电路35从接收所述光强信号到发送所述探测触发信号之间的时间差由所述样品液的流速决定；

步骤S12：配置望远镜镜组31、光阑32和滤光片33，所述望远镜镜组31、所述光阑32、所述滤光片33和所述ICCD探测器34依次位于同一直线上，所述望远镜镜组31与所述90°离轴抛物面反射镜30的光轴平行且面向所述90°离轴抛物面反射镜30，将所述ICCD探测器34与计算机39连接，所述ICCD探测器34获取所述样品液中样品微粒的散射图案，并将所述样品微粒的散射图案发送至所述计算机39；

步骤S13：人工给入触发信号以启动所述ICCD探测器34，从而获得背景图案并将所述背景图案发送至所述计算机39；

步骤S14：所述计算机39用所述样品微粒的散射图案的强度减去所述背景图案的强度，得到单粒子束的散射光强分布。

具体地，参考图7，所述微流控芯片40的制作方法包括以下步骤：

(a)对所述微流控芯片40的流道的结构进行仿真，以确定所述流道的尺寸；

(b)以硅单晶片为第一基底50，将第一负光胶51涂覆在所述第一基底51上，对所述第一负光胶51和所述第一基底50通过两次光刻工艺制作所述微流控芯片40的观测层53的平面模板；

(c)用亚克力材料制作所述观测层53的半圆柱面模板，用所述观测层53的平面模板和半圆柱面模板对第一聚二甲基硅氧烷52进行倒模，并进行烤制和固化且去除所述观测层53的平面模板和半圆柱面模板，得到所述微流控芯片40的观测层53；

(d)以硅单晶片为第二基底60，将第二负光胶61涂覆在所述第二基底60上，对所述第二负光胶61和所述第二基底60通过两次光刻工艺制作所述微流控芯片40的底层63的模板；

(e)用所述底层63的模板对第二聚二甲基硅氧烷62进行倒模，并进行烤制和固化且去除所述底层63的模板，得到所述微流控芯片40的底层63；

(f)在紫外线的作用下对所述观测层53和所述底层63进行臭氧处理和封合，得到完整的所述微流控芯片40。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。