本发明属于粮食原料中糖苷腈含量的测定方法，涉及一种分光光度法测定氰化物含量的方法，属于生物化学分析领域。
背景技术：
：粮食是人类必需的食物来源，同时也是酿酒、饲料、生物燃料等应用的主要原料。粮食的种类很多，常见的包括大麦、小麦、大豆、水稻、玉米、高粱、木薯类等。由于粮食的品种繁多，质量良莠不齐，因此解决食品安全问题也成为保障人民身体健康的重大课题。糖苷腈，又名生氰糖苷、氰苷，是由氰醇衍生物的羟基和D-葡萄糖缩合形成的糖苷，广泛存在于豆科，蔷薇科，稻科等的10000余种粮食中。糖苷腈具有生氰作用，可水解生成高毒性的氢氰酸，从而对人体造成危害。糖苷腈的毒性甚强，对人的致死量为18mg/kg体重。糖苷腈的毒性主要是氢氰酸和醛类化合物的毒性。氢氰酸被吸收后，随血液循环进入组织细胞，并透过细胞膜进入线粒体，氰化物通过与线粒体中细胞色素氧化酶的铁离子结合，导致细胞的呼吸链中断。因此挑选低糖苷腈含量的粮食品种是保证人民身体健康的重要途径。目前并没有针对粮食中糖苷腈含量有效准确的测定方法。常用的方法是直接对粮食样品进行蒸馏后，利用化学滴定法和离子色谱法对氰化物含量进行测定。而对粮食样品的直接蒸馏处理会致使粮食中的糖苷腈不能完全分解，使得后续得到的实验数据不准确，降低了粮食中的糖苷腈含量，加大了食品安全隐患。并且利用化学滴定法及离子色谱法操作繁琐，实验耗时较长，由于氢氰酸易分解，因此将较低实验结果的准确性。因此建立针对粮食原料中糖苷腈含量的测量方法是非常有必要的。技术实现要素：1.本发明的目的，旨在提供一种针对于粮食原料的，快速、准确、简便的糖苷腈含量的测定方法。2.本发明采用以下技术方案来实现上述目的，步骤如下：(1)将粮食原料中的糖苷腈转化为可测定氰化物：使用研磨机将粮食原料（约51g）研磨成0.2mm规格的粉末。准确称取50.0±0.0005g的粉末样品，转移到烧杯中。加100mlβ-葡萄糖苷酶到烧杯中，混合均匀再转移到500ml中颈圆底烧瓶中，再用100ml酶溶液润洗。用铝箔将圆底烧瓶的颈部覆盖，防止蒸发热损失。60℃水浴1小时，期间震荡混匀数次。利用加热器对样品混合溶液进行蒸馏，收集100ml蒸馏液至一个200ml棕色容量瓶中，避免光照分解（称量100ml蒸馏水在容量瓶中，收集蒸馏液直到刻度线）。(2)分光光度法测量样品中糖苷腈浓度：取20ml蒸馏液加入到三口烧瓶中，加入1ml氯胺T溶液，完全混匀后，立即加入1ml巴比妥酸/吡啶溶液1ml（溶解3g的1,3-二甲基巴比妥酸在10ml蒸馏水中，加入15ml吡啶，最后加入蒸馏水定容50ml并储存在棕色试剂瓶中）。试剂必须按顺序加入，否则将不会显色。将溶液充分混合均匀后，在水浴25℃条件下孵育5分钟。之后利用分光光度计在室温下590nm波长处读取样品吸光值。(3)配置标准溶液及制作标准曲线：通过稀释氰化物储备液到0~200ppb浓度来准备氰化物标准溶液。从下表的稀释梯度中选取足够的点来构建标准曲线（最小数量是5）。稀释0.5ml的氰化物储备液（1000ppm=1000000ppb）在500ml的蒸馏水中，得到一个1000ppb的中间浓度标准液。表1稀释梯度表母液/中间标准溶液浓度（ppb）取液体积（ml）最终体积（ml）新标准溶液浓度（ppb）母液10000000.55001000中间标准标准液100020100200中间标准标准液100018100180中间标准标准液100016100160中间标准标准液100014100140中间标准标准液100012100120中间标准标准液100010100100中间标准标准液1000810080中间标准标准液1000610060中间标准标准液1000410040中间标准标准液1000210020（4）通过换算得出该批粮食每吨所含的糖苷腈含量：通过结合样品的吸光值读数与标准曲线来确定样品中糖苷腈的含量，以ppb表示。表示形式为：Xppb糖苷腈。换算结果以g糖苷腈/t（吨）粮食原料来表示：Y为g糖苷腈/t（吨）粮食原料。换算公式为：Y=X×4×10-3。从样品蒸馏液中的ppb糖苷腈转换为g糖苷腈/t（吨）粮食原料的系数因子为4×10-3。该系数因子是用以下方法计算出来的：从ppb转化到mg糖苷腈/1000ml蒸馏液：ppb糖苷腈×10-3≡mg糖苷腈/1000ml蒸馏液计算200ml容量瓶中收集的全部糖苷腈含量：mg糖苷腈/1000ml蒸馏液×0.2≡mg糖苷腈/200ml蒸馏液因此，200ml的蒸馏液中含有50g粮食原料中的糖苷腈：mg糖苷腈/200ml蒸馏液≡mg糖苷腈/50g粮食原料将糖苷腈的单位从mg转化为g：mg糖苷腈/50g粮食原料×10-3≡g糖苷腈/50g粮食原料由于50g粮食原料=1/20000吨：g糖苷腈/50g粮食原料×20000≡g糖苷腈/t（吨）粮食原料因此，从蒸馏液中ppb糖苷腈到g糖苷腈/t(吨)粮食原料的系数因子转化过程为：ppb糖苷腈×1×10-3×0.2×10-3×20000=g糖苷腈/t（吨）粮食原料ppb糖苷腈×4×10-3=g糖苷腈/t（吨）粮食原料任何其它的稀释倍数在从样品吸光值应用到标准曲线线性范围时都应被计算在内。3.本发明的原理在于：β-葡萄糖苷酶可以将粮食中的糖苷腈转化为氰醇及葡萄糖，再经过蒸馏，将氰醇热转化为氢氰酸及异丁醛。CN-离子通过氧化剂氯胺T氧化后，与吡啶中间体结合后，可以与二甲基巴比妥酸产生显色反应。由于产生显色反应的化合物浓度与粮食样品中糖苷腈的含量成正比，因此结合样品溶液吸光值与标准曲线可以得出样品中所含的糖苷腈含量，再经过公式转换可以得出该批粮食原料每吨中的糖苷腈含量。而经过测量，测得分光光度计对其最大吸收波长为590nm，因此选取在室温条件下590nm波长处对样品及标准溶液进行读数。4.本发明的优点在于：本发明一种粮食原料中糖苷腈含量的测定方法，是针对于粮食原料中的糖苷腈含量的测定方法。相对于其它前处理方式，利用β-葡萄糖苷酶可以将粮食原料中的糖苷腈充分转化为氰醇，使得后续测量得到的结果更加的准确。另外，利用分光光度计进行测量，相对于化学滴定法及离子色谱法，操作更加简便，实验耗时更短，这样也更有利于实验精度的提高。因此，该方法是一种有效、准确、快速的粮食原料中糖苷腈含量的测定方法。具体实施方式一．所用样品：5种大麦麦芽（由中国食品发酵工业研究院收集）二．所用试剂及仪器试剂：无水醋酸钠（Sigma）CAS号：127-09-3；冰醋酸（Sigma）CAS号：64-19-7；β-葡萄糖苷酶(SigmaG-0395-50KU)CAS号：9001-22-3；氯胺T溶液（Sigma）CAS号：127-65-1；1,3-二甲基巴比妥酸（Greyhound）CAS号：769-42-6；氰化物标准溶液1000mg/l（Merck）CAS号：14244-62-3；吡啶(Simga)CAS号：110-86-1。仪器：容量瓶（包括200ml棕色容量瓶）；刻度移液管；中颈圆底烧瓶；防溅球管；冷凝管；量筒（1000，500，200和100ml）；28ml带盖三口烧瓶；涡旋振荡器；pH计；Buhler-Miag研磨机；加热器；水浴；4位分析天平；Cecil7200分光光度计。该实验所使用的所有试剂纯度都为分析纯（纯度>99%）（1）醋酸钠缓冲液(0.1M,pH5.0)将8.204g无水醋酸钠溶解于500ml蒸馏水中，配置0.2M的醋酸钠溶液。稀释5.8ml的冰醋酸至500ml，配置0.2M的醋酸溶液。将500ml0.2M的醋酸钠溶液转移至1L的烧杯中，使用0.2M的醋酸调节pH值至5（约加200ml）在调节pH值后，加入足够的β-葡萄糖苷酶使最终的酶活达到2000-6000U/L。之后加入到1L容量瓶中，使用蒸馏水定容。（2）氯胺T溶液溶解0.25g氯胺T在蒸馏水中，定容50ml。溶液需在实验当天配置并储存在棕色试剂瓶中。（3）巴比妥酸/吡啶溶液溶解3g的1,3-二甲基巴比妥酸在10ml的蒸馏水中，加15ml吡啶。最后加入蒸馏水定容50ml并储存在棕色试剂瓶中。（4）氰化物储存溶液利用1000ppm的氰化物储备液配置氰化物标准液，并进行适当的稀释。三．实验方法分别称取5种麦芽（约51g），用研磨机将麦芽研磨成0.2mm规格的粉末。精确称取各样品50.0±0.0005g，转移至烧杯中。加入100mlβ-葡萄糖苷酶到烧杯中，混合均匀后再转移到500ml中颈圆底烧杯中，在使用100mlβ-葡萄糖苷酶溶液进行润洗。用铝箔将圆底烧瓶的颈部覆盖，防止蒸发热损失。60℃水浴1小时，期间震荡混匀数次。选取加热器合适档位对混合溶液进行蒸馏，避免防溅球管颈部产生任何样品的泡沫。收集100ml各样品蒸馏液至一个200ml棕色容量瓶中，避免光照分解(称量100ml蒸馏水在容量瓶中，收集蒸馏液直至刻度线)。选取氰化物浓度为0ppb，40ppb，100ppb，160ppb，200ppb的氰化物标准溶液来作为标液，绘制标准曲线。以上标准溶液为使用蒸馏水稀释浓度为1000ppb的氰化物中间浓度标准液而得到。分别将5个样品蒸馏液及5个浓度的氰化物标准液吸取20ml，各自加到三口烧瓶中。用移液器加入1ml氯胺T溶液，完全混匀后，立即加入1ml巴比妥酸/吡啶溶液。试剂必须按顺序加入，否则不会显色。将各溶液混合均匀后，在25℃水浴中孵育5分钟。之后利用Cecil7200分光光度计在室温下590nm波长处对全部溶液进行吸光值读取。利用5个氰化物标液的浓度及吸光值绘制标准曲线。结合5个样品的吸光值与标准曲线，确定5个样品中糖苷腈浓度ppb，再利用转化公式将浓度ppb转化为该批麦芽每吨中糖苷腈的含量。四．实验结果5个浓度梯度的氰化物标液的吸光值如表2。表2标准溶液吸光值C(CN-)（ppb）040100160200吸光值（A）00.1610.4120.7170.863如表2的数据建立的标准曲线的线性方程为Y=0.0044x-0.0093，线性相关系数为R2=0.9981,线性相关良好。5个麦芽样品的吸光值如表3，结合标准曲线可计算出蒸馏液中的糖苷腈浓度ppb及每种样品每吨所含糖苷腈含量。表3麦芽样品测量结果/1号样品2号样品3号样品4号样品5号样品吸光值0.3120.1820.6730.7090.092糖苷腈ppb73.0243.48155.07163.2523.02g糖苷腈/t（吨）麦芽0.2920.1740.6200.6530.092在同样的实验条件下对1号、4号样品平行测定6次，相对标准差（RSD）都在1%以下，结果如表4。表4平行实验结果每吨麦芽中糖苷腈含量平行实验结果表明，该测定方法结果稳定，重现性好。当前第1页1 2 3