苦瓜叶中总皂苷含量的检测方法与流程

本发明涉及药材质量的检测方法，具体涉及苦瓜叶中总皂苷含量的检测方法。

背景技术：

苦瓜叶为葫芦科苦瓜属一年生蔓性草本植物苦瓜(Momordica charantia L.)的干燥叶。性凉、味苦。具清热解毒、杀菌、止痢、止痛的功效，能治疗胃痛，痢疾，疔疮肿毒。苦瓜叶作为常用民间药，使用广泛，常用于治疗蚊虫叮咬后皮肤的红肿热痛、小儿痱子、热毒疮肿、杨梅疮、狗咬和鹅掌风。

苦瓜叶资源丰富，疗效确切，民间使用广泛，认可度高且方便易得，具有较好的开发价值。但是目前，国内外多对苦瓜果实进行多角度研究而其叶研究甚少，尚缺乏对苦瓜叶的质量评价方法和标准。

因此，为了确保苦瓜叶的质量和安全，需要一种检测方法，用于评估苦瓜叶的质量。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种苦瓜叶中总皂苷含量的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)标准曲线的建立：

a、对照品溶液的制备：

取人参皂苷Rg₁对照品，加甲醇配制成对照品溶液；

b、对照品溶液的测定：

取对照品溶液，除去溶剂，加入5％香草醛冰醋酸溶液，再加入的高氯酸溶液，混匀，密塞，于50℃～90℃下加热，冷却，加冰醋酸，在紫外分光光度仪中于558nm下测定吸光度，根据检测结果得到标准曲线；

其中，所述5％香草醛冰醋酸溶液与对照品溶液的体积比为3：1～6：1，高氯酸溶液与对照品溶液的体积比为15：1；

(2)待测样品中总皂苷含量的测定：

c、供试品溶液的制备：

取待测苦瓜叶样品，60℃～90℃的石油醚回流提取，过滤，弃去滤液，重复一次，取残渣，60％～90％的乙醇超声或回流提取，过滤，用相应浓度的乙醇补足所失重量，得供试品溶液；

d、供试品溶液的测定：

取供试品溶液，以步骤b的方法进行测定，根据步骤(1)的标准曲线得到待测样品中总皂苷的含量。

进一步地，所述步骤b中，5％香草醛冰醋酸溶液与对照品溶液的体积比为4：1。

进一步地，所述步骤b的加热为60℃下加热。

进一步地，所述步骤b的加热时间不少于20分钟。

进一步地，所述步骤b中，冰醋酸与对照品溶液的体积比为25：1。

进一步地，步骤c中，所述乙醇为70％的乙醇。

进一步地，步骤c中，所述乙醇提取为回流提取。

进一步地，所述乙醇回流提取的温度为60℃。

进一步地，所述乙醇回流提取的时间为0.5～1.5小时，优选1小时。

进一步地，所述乙醇与待测苦瓜叶样品的体积质量比为100mL：1g～160mL：1g。

本发明苦瓜叶中总皂苷含量的检测方法，通过多个工艺的筛选，可以准确、可靠、简便地检测苦瓜叶中总皂苷的含量，从而有效监控苦瓜叶药材的质量，为苦瓜叶的临床疗效提供了有效保障。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为苦瓜叶总皂苷紫外测定标准曲线。

图2为不同产地苦瓜叶总皂苷测定结果。

具体实施方式

下述实施例所用实验材料如下：

不同采收地点的样品于2011年8月前后分别采自四川省成都市、彭州市、简阳市、内江市、自贡市、宜宾市及河北保定，浙江嘉兴，广东佛山等地。采集新鲜叶，除去杂质，阴干即得。以上实验样品均经成都中医药大学药学院蒋桂华教授鉴定为葫芦科植物苦瓜Momordica charantia L.的干燥叶。样品采集地点、时间及生长环境见表1。

于2011年8月20日对口采于四川省彭州市敖平镇，经成都中医药大学药学院蒋桂华教授鉴定为葫芦科苦瓜属植物苦瓜Momordica charantia L.的干燥叶，作为对照药材；所用试剂均为分析纯。

表1不同产地苦瓜叶样品

仪器如下：

十万分之一电子天平(德国SartoriusBP211D)，紫外分光光度计(日本岛津UV-1600型)，真空干燥箱(上海森信实验仪器有限公司，DZG-6090型)，电子天平(上海YP601N)，超声波清洗器，电子恒温水浴锅等。

试药与试剂如下

人参皂苷Rg₁(中国食品药品检定研究院110703-201128)；石油醚，乙醇，冰醋酸，高氯酸等均为分析纯试剂。

实施例1

(1)总皂苷含量测定方法的考查

1对照品溶液

对照品溶液：取干燥至恒重的人参皂苷Rg₁对照品适量，精密称定，置于10mL容量瓶，加入甲醇，定容，制成0.5mg/mL的人参皂苷Rg₁溶液。

2测定波长考查

精密量取0.125mL人参皂苷Rg₁对照品溶液于10mL的具塞刻度试管中，水浴挥干溶剂，加新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.2mL、高氯酸2.0mL，摇匀，密塞，结果显示，在558nm处人参皂苷Rg₁对照品溶液有最大吸收。

因此，将测定波长定为558nm。

3显色方法考查

3.1香草醛用量考查

精密量取人参皂苷Rg₁对照品溶液0.2mL，6份，于10mL的具塞刻度试管中，水浴挥干溶剂，分别加入新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，再加高氯酸0.8mL，摇匀，密塞，于60℃水浴加热15min，冷却，加冰醋酸5.0mL，于紫外分光光度仪中测定吸光度。结果见表2。

表2 5％香草醛冰醋酸用量考查

结果显示：当5％香草醛冰醋酸溶液加入量为0.6～1.2mL时，吸光度均较大。其中，0.8mL的加入量为最佳。

因此，将5％香草醛冰醋酸溶液用量定为0.8mL。

3.2高氯酸用量考查

精密量取人参皂苷Rg₁对照品溶液0.2mL，6份，于10mL的具塞刻度试管中，水浴挥干溶剂，加新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.8mL，再分别加高氯酸2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL，摇匀，密塞，于60℃水浴加热15min,冷却，加冰醋酸5mL，于紫外分光光度仪中测定吸光度。结果见表3。

表3高氯酸用量考查

结果显示：高氯酸加入量为3.0mL时，供试品的吸光度值最大为0.348。

因此，将高氯酸用量定为3.0mL。

3.3显色温度考查

精密量取人参皂苷Rg₁对照品溶液0.2mL，6份，于10mL的具塞刻度试管中，水浴挥干溶剂，加入新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.8mL、高氯酸3mL，摇匀，密塞，分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴加热15min，冷却，加冰醋酸5mL，于紫外分光光度仪中测定吸光度。结果见表4。

表4显色温度考查

结果显示：当显色温度为60℃时已能充分显色，故选择显色温度为60℃。

3.4显色时间考查

精密量取人参皂苷Rg₁对照品溶液0.2mL，6份，于10mL的具塞刻度试管中，水浴挥干溶剂，加入新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.8mL、高氯酸3mL，摇匀，密塞，60℃水浴加热5min、10min、15min、20min、25min、30min，冷却，加冰醋酸5mL，于紫外分光光度仪中测定吸光度。结果见表5。

表5显色时间考查

结果显示：吸光度值A在供试品溶液显色20min后趋于稳定，因此，将显色时间定为20min。

小结：最佳显色方法为：量取供试品溶液适量，于10mL的具塞刻度试管中，水浴挥干溶剂，加入新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.8mL、高氯酸3mL，摇匀，密塞，60℃水浴加热20min。

(2)线性关系考查

分别精密移取人参皂苷Rg₁对照品溶液50μL、100μL、150μL、200μL、250μL、300μL、350μL、400μL于10mL的具塞刻度试管中，水浴挥干溶剂，加新配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.8mL、高氯酸3.0mL，摇匀，密塞，于60℃水浴加热20min，冷却，加冰醋酸5.0mL，测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，人参皂苷Rg₁含量为横坐标，绘制标准曲线。得线性方程A＝4.7599x-0.0139，R₂＝0.9970。在0.0252～0.2021mg范围内，吸光度值A与人参皂苷Rg₁含量呈良好的线性关系。结果见表6、图1。

表6线性关系考察

(3)仪器精密度考查

精密量取人参皂苷Rg₁对照品溶液适量，于10mL具塞试管中，照前述最佳显色条件显色，测定其吸光度A。结果见表7。

表7仪器精密度考查

实验结果显示，人参皂苷Rg₁溶液的吸光度值A稳定，计算其RSD值，为0.12％，说明该仪器精密度良好，可进行人参皂苷Rg₁溶液的吸光度值A的测定。

(4)苦瓜叶供试品溶液制备方法考查

1提取方法考查

取同一批次(表1中6号样)苦瓜叶样品粉末0.5g，6份，精密称定，置于250mL锥形瓶中，加石油醚(60～90℃)50mL，水浴回流1h，滤过，弃去滤液。重复一次。残渣加入不同提取溶剂50mL，称重，采用不同提取方法下提取1小时，用相应提取溶剂补至原重，过滤，取滤液250μL于10mL具塞试管中，水浴挥干溶剂，显色，定容，测定吸光度，结果见表8.

表8提取方法的选择

实验结果显示：回流提取所测定的吸光度A略高于超声提取；随着乙醇浓度的升高，所测定的吸光度A也随之升高，在乙醇浓度为70％时达到峰值，随后略有下降。70％乙醇回流提取时所测得的吸光度A最大，为0.899。因此，将苦瓜叶总皂苷的提取方法定为70％乙醇回流提取。

2回流提取温度考查

取同一批次(表1中6号样)苦瓜叶样品粉末0.5g，6份，精密称定，置于250mL锥形瓶中，加石油醚(60～90℃)50mL，水浴回流1h，滤过，弃去滤液。重复一次。残渣加70％乙醇50mL，称重，在不同温度下提取1h，用70％乙醇补至原重，过滤，取滤液250μL于10mL具塞试管中，水浴挥干溶剂，显色，定容，测定吸光度。结果如表9。

表9回流提取温度考查

结果显示：60℃回流提取时吸光度最大，故选择提取温度为60℃。

3提取时间考查

取同一批次(表1中6号样)苦瓜叶样品粉末0.5g，6份，精密称定，置于250mL锥形瓶中，加石油醚(60～90℃)50mL，水浴回流1h，滤过，弃去滤液。重复一次。残渣加70％乙醇50mL，称重，60℃回流提取不同时间，用70％乙醇补至原重，过滤，取滤液250μL于10mL具塞试管中，水浴挥干溶剂，显色，定容，测定吸光度。结果如表10。

表10提取时间考查

结果显示：以70％乙醇为溶剂回流提取1h，所测定的吸光度最大。故选择提取时间为1h。4料液比考查

取同一批次(表1中6号样)苦瓜叶样品粉末0.5g，6份，精密称定，置于250mL锥形瓶中，加石油醚(60～90℃)50mL，水浴回流1h，滤过，弃去滤液。重复一次。残渣加70％乙醇不同体积，称重，60℃回流提取1h，用70％乙醇补至原重，过滤，取滤液250μL于10mL具塞试管中，水浴挥干溶剂，显色，定容，测定吸光度。结果如表11。

表11料液比考查

结果显示：提取溶剂为50mL时已能充分提取苦瓜叶中的总皂苷，当提取溶剂为70mL时提取效率最高；综合考虑0.5g苦瓜叶以80％乙醇50mL提取最佳。故选择提取体积为50mL，即料液比为1:100。

小结：供试品溶液的最佳制备方法为：取苦瓜叶粉末0.5g，精密称定，置于250mL锥形瓶中，加石油醚(60～90℃)50mL，水浴回流1h，滤过，弃去滤液。重复一次。残渣加70％乙醇50mL，称重，60℃回流提取1h，用70％乙醇补至原重，过滤。即得供试品溶液。

(5)稳定性实验

平行精密量取供试品溶液250μL共6份，置于10mL具塞试管中，水浴挥干溶剂，显色，定容，计时，每间隔10min测定一次吸光度值A。结果如表12。

表12苦瓜叶总皂苷测定稳定性试验

实验结果显示：60min内吸光度A无明显变化，在0.900～0.904之间。计算得RSD值为0.16％，说明在本实验条件下，供试品溶液显色60min内吸光度值A稳定，说明本实验方法稳定性良好。

(6)重复性试验

取同一批次(表1中6号样)苦瓜叶样品粉末0.5g，6份，精密称定，按前述最佳的供试品溶液制备方法制备供试品溶液。精密量取供试品溶液250μL于10mL具塞试管中，照前述最佳的显色条件显色，测定吸光度。计算苦瓜叶药材中总皂苷含量。结果如表13。

表13苦瓜叶总皂苷测定重复性试验

结果显示：1～6平行供试品溶液的吸光度为0.893～0.903，通过标准曲线方程计算得出1～6平行供试品总皂苷含量为7.70％～7.72％，平均含量为7.71％，计算得出其RSD值为0.18％，说明本实验方法重复性较好。

(7)回收率实验

取同一批次(表1中6号样)苦瓜叶样品粉末0.5g，6份，精密称定，加入人参皂苷Rg₁对照品1mg，按前述最佳的苦瓜叶总皂苷含量测定供试品溶液制备方法制备供试品溶液。量取供试品溶液250μL，置于10mL具塞试管中，水浴挥干溶剂，按前述最佳的显色条件显色，测定吸光度。按线性方程计算苦瓜叶总皂苷含量，结果见表14。

表14苦瓜叶总皂苷测定回收率考查

实验结果显示：1～6号供试品的加样回收率为99.92％～100.04％，均值为99.97％，计算其RSD为0.38％，说明本实验方法加样回收良好。

(8)苦瓜叶总皂苷含量测定

取苦瓜叶粉末各0.5g，精密称定，前述最佳的苦瓜叶总皂苷含量测定供试品溶液制备方法制备供试品溶液：量取供试品溶液100μL，置于10mL具塞试管中，水浴挥干溶剂，按前述最佳的显色条件显色，测定吸光度。按线性方程计算苦瓜叶总皂苷含量。结果见表15、图2。

表15苦瓜叶总皂苷含量测定结果(n＝2)

综上所述，本发明苦瓜叶中总皂苷含量的检测方法，通过多个工艺的筛选，可以准确、可靠、简便地检测苦瓜叶中总皂苷的含量，从而有效监控苦瓜叶药材的质量，为苦瓜叶的临床疗效提供了有效保障。