一种特女贞苷对照品的制备方法与流程

本发明属于中药现代化技术领域，涉及一种中药化学对照品的制备方法，具体而言，本发明涉及一种从中药材女贞子中快速分离特女贞苷对照品的方法。

背景技术：

女贞子又名冬青子，为木犀科植物女贞Ligustrum lucidumAit.的干燥成熟果实，是我国传统的扶正固体药物。《神农本草经》列之为上品，谓其“味苦平，主补中，安五脏，养精神，除百病”。具有滋补肝肾、明目乌发之功效，用于肝肾阴虚、头昏目眩、耳鸣、腰膝疲软、须发早白等症。现代药理学研究表明，女贞子具有提高机体免疫功能、增加白细胞、降血脂降血糖、抗菌消炎、降低眼压、抗氧化作用、保肝护肾和抗癌，对心血管疾病也有较好的疗效。临床上常用语治疗骨质疏松、结肠癌、肺癌等疾病。

特女贞苷(Specnuezhenide)，分子式为C₃₁H₄₂O₁₇，结构式如下：

女贞子的主要活性成分有三萜类、环烯醚萜类、苯乙醇类和黄酮类等成分，而特女贞苷是女贞子中含量最高环烯醚萜苷类化合物，因此2010版《中国药典》选择特女贞苷作为女贞子的鉴别和含量测定用对照品，用以控制女贞子的药材质量。所以特女贞苷对照品的需求量越来越大，而目前国内关于特女贞苷分离纯化的文献报道较少，即使有少量专利文献报道了特女贞苷的分离纯化，方法，所得的特女贞苷纯度也并不高，比如申请号为201110337108.6的专利申请公开了“一种特女贞苷的制备方法”和申请号为200910093290.8的专利申请公开了“一种女贞子专属性成分特女贞苷的分离纯化工艺”，两篇专利中所得的特女贞苷的纯度仅在98％以上。如申请号为201010186867.2的专利申请公开了“一种特女贞苷的制备方法”，该方法采用甲醇或乙醇作为重结晶所用的溶剂，所得的特女贞苷的纯度为98.1％。

因此制备高纯度的特女贞苷对照品方法显得非常必要，通过本发明所涉及的制备方法得到的特女贞苷对照品纯度高于全部现有技术方案所得的特女贞苷的纯度，本制备方法具有广泛的应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种从女贞子药材中分离特女贞苷对照品的制备方法。该方法简便易行、消耗溶剂少、得率高，适于工业化生产。

本发明的第一方面提供了一种特女贞苷对照品的制备方法，所述的方法包括以下步骤：

(i)提供特女贞苷醇提物；

(ii)所述的特女贞苷醇提物与溶剂混合，得到第一混合物，并利用中压制备柱对所述的第一混合物进行过柱分离，从而获得特女贞苷粗品；

(iii)利用纯水对所述的特女贞苷粗品进行重结晶；和

(iv)分离并干燥步骤(iii)中所得的结晶物，即获得特女贞苷对照品。

在另一优选例中，所述的纯水的电导率≤18.2μs/cm。

在另一优选例中，所述步骤(ii)中的中压制备柱的柱压下限选自下组：0MPa、0.1MPa、0.2MPa、0.3MPa、0.4MPa、或0.5MPa。

在另一优选例中，所述步骤(ii)中的中压制备柱的柱压上限选自下组：2MPa、2.1MPa、2.2MPa、2.3MPa、2.4MPa、或2.5MPa。

在另一优选例中，所述步骤(ii)中的中压制备柱设有柱压0-2MPa,较佳地为0.5-2MPa。

此处，当中压制备柱的柱压为0MPa时，是指中压制备柱处于标准大气压状态。

在另一优选例中，所述步骤(ii)中的中压制备柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶。

在另一优选例中，所述步骤(ii)中的中压制备柱的填料粒径为40-60μm。

在另一优选例中，所述步骤(ii)的中压制备柱中使用的洗脱剂为体积比20-50％(v/v)的甲醇溶液。

在另一优选例中，所述步骤(ii)的中压制备柱中洗脱剂流速为50-70ml/min。

在另一优选例中，步骤(ii)中选择甲醇为溶剂与所述的特女贞苷醇提物混合，用以溶解所述的特女贞苷醇提物。

在另一优选例中，所述的特女贞苷粗品纯度≥95.0％

在另一优选例中，所述的特女贞苷醇提物由包括以下步骤的方法制备得到：

(i-1)混合女贞子药材和乙醇溶液，在50-80℃下进行醇提，固液分离后浓缩液体部分，从而获得第一浓缩液；

(i-2)使用大孔树脂吸附所述的第一浓缩液，然后分别用2-3倍量柱体积的水和1-3倍量柱体积的15-25％乙醇溶液洗脱杂质，再用1-3倍量柱体积的35-50％(v/v)乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱液，浓缩以获得第二浓缩液；和

(i-3)使用硅胶柱层析分离所述的第二浓缩液采用乙酸乙酯:甲醇:水洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩以获得步骤(i)中所述的特女贞苷醇提物。

在另一优选例中，所述的乙酸乙酯:甲醇:水洗脱剂中各组分的体积比为20:1:0-10:1:0.1。

在另一优选例中，所述的乙醇溶液与女贞子药材以体积质量比(L/kg)为10-20倍量混合。

在另一优选例中，所述步骤(i-1)中的乙醇溶液的体积百分比浓度为45-55％(v/v)。

在另一优选例中，所述的大孔树脂的原料包括苯乙烯型非极性共聚体。

在另一优选例中，所述的大孔树脂的粒径为0.3-1.25mm。

在另一优选例中，所述的大孔树脂的孔隙率≥90％。

本发明的第二方面提供了一种特女贞苷对照品，所述的特女贞苷对照品由如本发明第一方面所述的方法制备所得。

在另一优选例中，所述的特女贞苷对照品纯度≥99.0％，较佳地，纯度≥99.3％，更佳地，纯度≥99.4％。

在另一优选例中，所述的特女贞苷对照品含有≤0.077％的新女贞苷。

在另一优选例中，所述的特女贞苷对照品含有≤0.55％的女贞苷杂质。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为实施例1所得特女贞苷对照品的HPLC检测图谱。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次研发出一种高纯度特女贞苷对照品的制备方法。本制备方法采用中压制备柱分离纯化特女贞苷醇提物，在一定的压强下，分离效率大大提高。通过纯水重结晶特女贞苷，进一步提高特女贞苷的纯度。在此基础上，完成了本发明。

本发明一种优选的技术方案如下：

A.原料提取：将女贞子药材粉碎，按照体积质量比L/Kg加入10倍量的乙醇溶液，所使用的乙醇溶液的体积百分比浓度为45-55％；将女贞子药材和乙醇溶液在60℃下热提取至少2次，每次大约2小时，冷却至室温，抽滤，合并滤液，浓缩至无醇味；

B.大孔树脂富集：将步骤A的浓缩液用大孔树脂静态吸附过夜，所使用的大孔树脂为D101型。然后分别用2-3倍量柱体积的水和1-3倍量柱体积的20％乙醇溶液洗脱杂质，再用1-3倍量柱体积的40％乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱液，浓缩至原体积的1/10；

C.硅胶柱层析：将步骤B的浓缩液用100-200目硅胶拌样，烘干后碾碎，取200-300目硅胶，乙酸乙酯湿法装柱。上样后，采用乙酸乙酯：甲醇：水洗脱剂，并按20:1:0-10:1:0.1的体积比由高到低梯度洗脱，TLC跟踪检测，收集洗脱液，浓缩得特女贞苷半成品；

D.中压制备：将步骤C的特女贞苷粗品用甲醇溶解上中压制备柱，用35％甲醇洗脱，浓缩得到纯度为95％左右的特女贞苷粗品。中压制备柱设有柱压0-2MPa,较佳地为0.5-2MPa，此处，当中压制备柱的柱压为0MPa时，是指中压制备柱处于标准大气压状态；

产品回收：将步骤D得到95％左右的特女贞苷粗品加纯水超声溶解，转移至4℃冰箱中冷藏结晶，等晶体析出后，抽滤固体，再重新用纯水加热溶解后重结晶，重复操作2次，冷冻干燥后得纯度为99.3％以上特女贞苷对照品。

本发明的主要优点

1、工艺步骤少，耗时短，得率高，操作简便，易于工业化生产；

2、溶剂消耗少，工艺过程中的溶剂均可回收再利用；

3、绿色环保，所有有机试剂均回收，无排放，无环境污染。

4、具有较高的学术价值。目前国内关于特女贞苷分离纯化的文献报道较少，用纯水重结晶用于特女贞苷对照品的分离纯化属首次。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

A.原料提取：将女贞子药材1kg粉碎成粗粉，加入10L体积分数为50％的乙醇溶液，在60℃下热提取2次，每次2小时，冷却至室温，抽滤，合并滤液，浓缩至无醇味，共1000ml；

B.大孔树脂富集：称取3KgD101大孔吸附树脂装柱，将步骤A的浓缩液用大孔树脂静态吸附过夜16个小时，然后分别用3L的水和2L柱体积的20％乙醇溶液洗脱杂质，再用3L的40％乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱液，浓缩至100ml；

C.硅胶柱层析：将步骤B的100ml浓缩液用100-200目硅胶150g拌样，烘干后碾碎，取200-300目硅胶2kg，用乙酸乙酯湿法装柱。上样后，采用乙酸乙酯：甲醇：水洗脱剂，并按20:1:0-10:1:0.1的体积比由高到低梯度洗脱，TLC跟踪检测，收集洗脱液，浓缩得特女贞苷半成品60g；

D.中压制备：将步骤C的特女贞苷粗品60g用20ml的甲醇溶解上中压制备柱，用35％甲醇洗脱，浓缩得到纯度为95％左右的特女贞苷粗品50g；

E.产品回收：将步骤D得到95％左右的特女贞苷粗品50g加40ml纯水超声溶解，转移至4℃冰箱中冷藏6小时，等晶体析出后，抽滤固体，再重新用纯水加热溶解后重结晶，重复操作2次，冷冻干燥后得特女贞苷对照品43g。

图1为所得特女贞苷对照品的HPLC检测图谱。经HPLC分析，所得特女贞苷对照品的纯度为99.3％。

实施例2

A.原料提取：将女贞子药材5kg粉碎成粗粉，加入50L体积分数为55％的乙醇溶液，在60℃下热提取2次，每次2小时，冷却至室温，抽滤，合并滤液，浓缩至无醇味，共5000ml；

B.大孔树脂富集：称取18KgD101大孔吸附树脂装柱，将步骤A的浓缩液用大孔树脂静态吸附过夜18个小时，然后分别用15L的水和10L柱体积的20％乙醇溶液洗脱杂质，再用15L的40％乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱液，浓缩至500ml；

C.硅胶柱层析：将步骤B的500ml浓缩液用100-200目硅胶600g拌样，烘干后碾碎，取200-300目硅胶10kg，用乙酸乙酯湿法装柱。上样后，采用乙酸乙酯：甲醇：水洗脱剂，并按20:1:0-10:1:0.1的体积比由高到低梯度洗脱，TLC跟踪检测，收集洗脱液，浓缩得特女贞苷半成品310g；

D.中压制备：将步骤C的特女贞苷粗品310g用100ml的甲醇溶解上中压制备柱，用35％甲醇洗脱，浓缩得到纯度为95％左右的特女贞苷粗品270g；

E.产品回收：将步骤D得到95％左右的特女贞苷粗品270g加200ml纯水超声溶解，转移至4℃冰箱中冷藏8小时，等晶体析出后，抽滤固体，再重新用纯水加热溶解后重结晶，重复操作2次，冷冻干燥后得冷冻干燥后得特女贞苷对照品220g。

所得特女贞苷对照品经HPLC分析，纯度为99.4％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。