一种升麻素苷和5‑O‑甲基维斯阿米醇苷对照品的制备方法与流程

本发明属于中药现代化技术领域，涉及一种中药化学对照品的制备方法，具体来说，本发明提供了一种从防风药材中分离高纯度升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品的方法。

背景技术：

防风为伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schischk.未抽花茎的干燥根。现今主要分布于黑龙江、内蒙古、辽宁、吉林、河北和山东等地，分布较广适应性强，为我国最常用的传统中药之一，味辛苷，性温，归膀胱、肝、脾经，具有解表祛风、胜湿、止痉的功效。主治外感风寒、头痛目眩、周身尽痛、风寒麻痹、骨节疼痛、四肢挛急等症。

升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷是在2010年版一部中收载的指标成分，升麻素苷(Prim-O-glucosylcimifugin)，分子式为C₂₂H₂₈O₁₁，5-O-甲基维斯阿米醇苷(5-O-methylvisamminolβ-D-glucopyranoside)，分子式为C₂₂H₂₈O₁₀，它们的结构式如下：

针对防风组成的中药制剂(如辛夷鼻炎丸、玉屏风散、童康平等)中升麻素苷和5-O甲基维斯阿米醇苷的检测方法的专利较多，如申请号201310504883.5的专利申请公开“辛夷鼻炎丸含量的测定方法”。而目前国内关于升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品的分离纯化文献报道很少，加之，升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷已在2010版药典中被列为标准，这两种对照品的需求量越来越大，尤其5-O-甲基维斯阿米醇苷在药材中含量很低，从药材中分离出单体非常困难，因此从防风中分离纯化升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品显得非常必要，具有广泛的应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品的分离纯化方法。该方法不但可实现升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品的同步分离，且分离效率高，工艺稳定，成本低廉，可大量制备得到纯度大于99％的升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品。

本发明的第一方面提供了一种升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品的制备方法，所述的方法包括以下步骤：

(i)提供升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的醇提混合物；

(ii)所述的醇提混合物与溶剂混合，得到第一混合物，并利用中压制备柱分离所述的第一混合物，从而获得升麻素苷粗品和5-O-甲基维斯阿米醇苷粗品；和

(iii)利用溶剂对升麻素苷粗品和/或5-O-甲基维斯阿米醇苷粗品进行重结晶，从而获得升麻素苷对照品和/或5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品。

在另一优选例中，所述步骤(ii)还包括步骤：

(ii-1)以30-35％(v/v)甲醇溶液作为中压制备柱的第一洗脱剂，进行第一阶段洗脱，浓缩洗脱液以获得升麻素苷粗品；和

(ii-2)以45-50％(v/v)甲醇溶液作为中压制备柱的第二洗脱剂，进行第二阶段洗脱，浓缩洗脱液以获得5-O-甲基维斯阿米醇苷粗品。

在另一优选例中，所述步骤(ii)中的中压制备柱设有柱压0-2MPa,较佳地为0.5-2MPa。

在另一优选例中，所述步骤(ii)中的中压制备柱的柱压下限选自下组：0MPa、0.1MPa、0.2MPa、0.3MPa、0.4MPa、或0.5MPa。

在另一优选例中，所述步骤(ii)中的中压制备柱的柱压上限选自下组：2MPa、2.1MPa、2.2MPa、2.3MPa、2.4MPa、或2.5MPa。

此处，当中压制备柱的柱压为0MPa时，是指中压制备柱处于标准大气压下。

在另一优选例中，所述步骤(ii)中的中压制备柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶。

在另一优选例中，所述步骤(ii)中的中压制备柱的填料粒径为40-60μm。

在另一优选例中，所述的升麻素苷粗品纯度≥93.0％。

在另一优选例中，所述的5-O-甲基维斯阿米醇苷粗品纯度≥98.0％。

在另一优选例中，所述步骤(iii)还包括步骤：

(iii-1)所述的升麻素苷粗品与纯水以及丙酮混合，使所述的升麻素苷粗品在混合溶剂中进行重结晶；分离并干燥所得结晶物，即获得升麻素苷对照品；和/或

(iii-2)所述的5-O-甲基维斯阿米醇苷粗品与甲醇以及丙酮混合，使所述的5-O-甲基维斯阿米醇苷粗品在混合溶剂中进行重结晶；分离并干燥所得结晶物，即获得5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品。

在另一优选例中，所述步骤(iii-2)在所述步骤(iii-1)之前，或同步进行。

在另一优选例中，所述步骤(ii)中使用45-55％(v/v)甲醇溶液与所述的升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的醇提混合物进行混合。

在另一优选例中，所述步骤(iii-1)中纯水的电导率≤18.2μs/cm。

在另一优选例中，所述步骤(iii-2)中甲醇的纯度为≥99.5％。

在另一优选例中，所述步骤(iii-1)和(iii-2)的丙酮的纯度≥99.5％。

在另一优选例中，所述步骤(iii-1)中，加入的丙酮为纯水的5-10倍量(v/v)；和/或

所述的步骤(iii-2)中，加入的丙酮为甲醇的5-10倍量(v/v)。

在另一优选例中，所述步骤(iii-1)中重结晶操作重复次数大于等于2次。

在另一优选例中，所述步骤(iii-2)中重结晶操作重复次数大于等于2次。

在另一优选例中，所述的升麻素苷对照品纯度≥99.0％，较佳地，纯度≥99.3％，更佳地，纯度≥99.5％。

在另一优选例中，所述的5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品纯度纯度≥99.0％，较佳地，纯度≥99.5，更佳地，纯度≥99.6％。

在另一优选例中，所述的升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的醇提混合物由包括以下步骤的方法制备得到：

(i-1)混合防风药材和乙醇溶液，冷浸醇提，固液分离后浓缩液体部分，从而获得第一浓缩液；

(i-2)使用大孔树脂吸附所述的第一浓缩液，然后分别用4-5倍柱体积的水洗脱杂质，再用1-2倍柱体积的55-65％乙醇溶液洗脱目标物，收集洗脱液，浓缩以获得第二浓缩液；和

(i-3)使用硅胶柱层析分离所述的第二浓缩液，采用二氯甲烷:甲醇洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩以获得步骤(i)中所述的升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的醇提混合物。

在另一优选例中，所述的乙醇溶液与防风药材以5-8(L/kg)倍量混合。

在另一优选例中，所述的乙醇溶液的体积百分比浓度为70-90％(v/v)，较佳地，为80％(v/v)。

在另一优选例中，所述的大孔树脂为聚苯乙烯型非极性吸附树脂。

在另一优选例中，所述的大孔树脂的孔隙率为42-46％。

在另一优选例中，所述的二氯甲烷:甲醇洗脱剂中各组分的体积比为10:1-5:1。

本发明的第二方面提供了一种升麻素苷对照品和/或5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品，所述的升麻素苷对照品和/或5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品由如本发明第一方面所述的方法制备得到。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为实施例1所得升麻素苷对照品的HPLC检测图谱。

图2为实施例1所得5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品的HPLC检测图谱。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次研发出一种高纯度升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品的制备方法。本制备方法采用中压制备柱分离纯化升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷醇提物，在一定的压强下，分离效率大大提高，并且通过重结晶来进一步提高目标物质的纯度。在此基础上，完成了本发明。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明一种优选的技术方案如下：

A.原料提取：将防风药材按照体积质量比L/Kg加入5～8倍量的乙醇溶液，冷浸提取提取72h，抽滤，合并滤液，浓缩至无醇味；

所述的乙醇溶液的体积百分比浓度为80％；

B.大孔树脂富集：将步骤A的浓缩液用大孔树脂静态吸附过夜，然后分别用4-5倍柱体积的水洗脱杂质，再用1-2倍柱体积的65％乙醇溶液洗脱目标物，收集洗脱液，浓缩至原体积的1/10；

C.硅胶柱层析：将步骤B的浓缩液用100-200目的硅胶拌样，烘干后碾碎，取200-300目硅胶，二氯甲烷湿法装柱。上样后，采用二氯甲烷：甲醇洗脱剂，并按10:1-5:1的体积比由高到低梯度洗脱，TLC跟踪检测，收集洗脱液，浓缩得升麻素苷半成品和5-O-甲基维斯阿米醇苷的半成品；

D.中压制备:将步骤C的升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的半成品用50％甲醇水溶解上中压制备柱，用33％甲醇洗脱，浓缩得到纯度为93％左右得升麻素苷粗品；用48％甲醇溶液洗脱，浓缩得到纯度为98％左右的5-O-甲基维斯阿米醇苷粗品；

E.产品回收：将步骤D得到的93％左右的升麻素苷粗品用少量的纯水加热溶解后加入5倍量的丙酮稀释，转移至4℃冰箱中冷藏结晶，等晶体析出后，抽滤固体，再重新用纯水加热溶解后用5倍量的丙酮稀释重结晶，重复操作2-3次冷冻干燥后得到纯度为99％以上升麻素苷对照品；将步骤D得到的98％左右的5-O-甲基维斯阿米醇苷粗品用少量的甲醇加热溶解后加入5倍量的丙酮稀释，转移至4℃冰箱中冷藏结晶，等晶体析出后，抽滤固体，再重新用甲醇加热溶解后用5倍量的丙酮稀释重结晶，重复操作2-3次冷冻干燥后得到纯度为99％以上5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品。

本发明的主要优点

1、采用重结晶方法进行产品回收，产品得率高，纯度高；

2、溶剂消耗少，工艺过程中的溶剂都可回收再利用；

3、溶剂毒性小，所用的溶剂为乙醇、甲醇、纯水，环境污染小；

4、操作简便，生产周期短，分离效率高，工艺稳定可靠，重现性好，成本低廉，适合工业化生产；

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品的制备方法，按如下工艺步骤进行：

A.原料提取；将防风药材10Kg，加入50L体积分数为80％的乙醇溶液冷浸提取72h，过滤，合并滤液，浓缩至无醇味，共5L；

B.大孔树脂富集：称取4KgAB-8大孔吸附树脂，将步骤A的浓缩液用大孔树脂静态吸附12个小时，然后用40L的水洗脱杂质，再用6L的65％乙醇溶液洗脱目标物，收集洗脱液，浓缩至100ml；

C.硅胶柱层析：将步骤B的100ml浓缩液用100-200目硅胶100g拌样，烘干后碾碎，取200-300目硅胶500g，用二氯甲烷湿法装柱。上样后，采用二氯甲烷：甲醇洗脱剂，并按10:1-5:1的体积比由高到低梯度洗脱，TLC跟踪检测，收集洗脱液，分别浓缩得升麻素苷半成品8.7g和5-O-甲基维斯阿米醇苷半成品6.5g；

D.中压制备：将步骤C的升麻素苷半成品8.7g用30ml水溶解后上中压制备柱用33％甲醇洗脱，浓缩得到纯度为93％的升麻素苷粗品5.2g；将步骤C的5-O-甲基维斯阿米醇苷半成品6.5g用20ml的甲醇溶解上中压制备柱，用48％的甲醇洗脱，浓缩得到98％的5-O-甲基维斯阿米醇苷粗品4.2g；

E.产品回收：将步骤D得到的93％左右的升麻素苷粗品5.2g用10ml的纯水加热溶解后加入50ml的丙酮稀释，转移至4℃冰箱中冷藏12小时，等晶体析出后，抽滤固体，再重新用纯水加热溶解后用5倍量的丙酮稀释重结晶，重复操作2-3次冷冻干燥后得到纯度为99％以上升麻素苷对照品4.1g；将步骤D得到的98％左右的5-O-甲基维斯阿米醇苷粗品4.2g用10ml的甲醇加热溶解后加入5倍量的丙酮稀释，转移至4℃冰箱中冷藏12小时，等晶体析出后，抽滤固体，再重新用甲醇加热溶解后用5倍量的丙酮稀释重结晶，重复操作2-3次冷冻干燥后得到纯度为99％以上5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品3.6g。

图1为实施例1所得升麻素苷对照品的HPLC检测图谱，图2为实施例1所得5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品的HPLC检测图谱。所得升麻素苷对照品经HPLC分析纯度为99.3％，5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品经HPLC分析纯度为99.6％。

实施例2

升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品的制备方法，按如下工艺步骤进行：

A.原料提取；将防风药材5Kg，加入35L体积分数为80％的乙醇溶液冷浸提取72h，过滤，合并滤液，浓缩至无醇味，共3L；

B.大孔树脂富集：称取2KgAB-8大孔吸附树脂，将步骤A的浓缩液用大孔树脂静态吸附12个小时，然后用20L的水洗脱杂质，再用3L的65％乙醇溶液洗脱目标物，收集洗脱液，浓缩至50ml；

C.硅胶柱层析：将步骤B的50ml浓缩液用100-200目硅胶50g拌样，烘干后碾碎，取200-300目硅胶300g，用二氯甲烷湿法装柱。上样后，采用二氯甲烷：甲醇洗脱剂，并按10:1-5:1的体积比由高到低梯度洗脱，TLC跟踪检测，收集洗脱液，分别浓缩得升麻素苷半成品4.8g和5-O-甲基维斯阿米醇苷半成品4.3g；

D.中压制备：将步骤C的升麻素苷半成品4.8g用20ml水溶解后上中压制备柱用33％甲醇洗脱，浓缩得到纯度为95％的升麻素苷粗品3.7g；将步骤C的5-O-甲基维斯阿米醇苷半成品4.2g用10ml的甲醇溶解上中压制备柱，用48％的甲醇洗脱，浓缩得到97％的5-O-甲基维斯阿米醇苷粗品3.2g；

E.产品回收：将步骤D得到的95％左右的升麻素苷粗品3.7g用6ml的纯水加热溶解后加入30ml的丙酮稀释，转移至4℃冰箱中冷藏12小时，等晶体析出后，抽滤固体，再重新用纯水加热溶解后用5倍量的丙酮稀释重结晶，重复操作2-3次冷冻干燥后得到纯度为99％以上升麻素苷对照品3.2g；将步骤D得到的98％左右的5-O-甲基维斯阿米醇苷粗品3.2g用100ml的甲醇加热溶解后加入5倍量的丙酮稀释，转移至4℃冰箱中冷藏12小时，等晶体析出后，抽滤固体，再重新用甲醇加热溶解后用5倍量的丙酮稀释重结晶，重复操作2-3次冷冻干燥后得到纯度为99％以上5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品2.5g。

所得升麻素苷对照品经HPLC分析纯度为99.5％，5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品经HPLC分析纯度为99.5％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。