用于肝纤维化诊断试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及癌症诊断检测用的试剂盒领域，具体为一种用于肝纤维化诊断试剂盒及其检测方法。

背景技术：

随着人们生活水平的提高，酒精肝和脂肪肝等“富贵病”发病率逐年提高，患病人数甚至已经超过乙肝患者。脂肪肝是一种由各种原因引起肝脂肪积蓄过多的的一种病理状态。约10%的单纯性脂肪肝会进展至脂肪性肝炎阶段，其中将有20%-40%可发展成为肝纤维化和肝硬化，最终导致肝癌。中国医师协会发布的数据显示，截至2010年底，我国目前有脂肪肝病人群至少有2亿人，未来由脂肪肝病人转化为肝纤维化和肝硬化的人数约在400-800万。酒精性肝病形势也十分严峻，不容忽视。截止2011年，保守估计我国酒精肝患者人数应在5000万左右，如不及时治疗，60%的酒精肝患者最终将转化为肝硬化甚至肝癌。目前我国肝纤维化人群应在1000万左右，有超过700万的肝硬化患者，而且患病人数不断增多。

大部分的慢性肝脏损伤都会引起肝纤维化和肝硬化，治疗终末期肝硬化的唯一有效手段就是肝移植，但是，即使是在发达国家，由于的供肝的不足和受者对手术不能耐受，肝移植技术无法完全解决肝硬化问题。近年来肝纤维化日益受到人们的重视，已成为肝病研究领域的热点。现认为肝纤维化尚有逆转至正常肝的可能，而肝硬变则否，认为阻止或延缓肝纤维化的发生和发展就能治愈大部分慢性肝病患者，给予有效治疗还可防止发展为肝硬化、肝癌。因此早期发现及治疗非常重要。

与大多数疾病的诊疗一样，早诊断、早治疗是治疗肝纤维化的重要条件，有助于减轻、逆转甚至治愈肝纤维化。准确判断肝纤维化程度是了解慢性肝病预后、评价抗纤维化疗效和决定治疗终点的关键环节。但由于肝纤维化没有特殊的临床表现，它的诊断目前主要还是依据肝脏组织病理学、影像学（B超、CT等）和血清学检查。其中，肝活检组织病理学检查至今仍是诊断肝纤维化，特别是肝纤维化分期的“金标准”。 但因其属损伤性检查，患者多不愿接受。血清肝纤维化标志物测定是无创伤性的，是肝纤维化患者的新希望。

目前，市场上还没有针对肝纤维化的快速高效诊断试剂盒问世，严重影响到肝纤维化早期发现及治疗。

技术实现要素：

本发明的目的是针对以上述现有肝纤维化诊断存在的不足，提供一种灵敏度高、准确性强，且使用方便高效的用于肝纤维化诊断试剂盒。

本发明另一目的是提供一种用于肝纤维化诊断试剂盒的检测方法。

为了实现本发明目的，本发明采取的技术方案是：用于肝纤维化诊断试剂盒，包括捕获抗体，所述捕获抗体是人微纤丝关联蛋白4制得的单克隆抗体。

所述用于肝纤维化诊断试剂盒，还包括检测抗体，所述检测抗体为人微纤丝关联蛋白4制得的多克隆抗体。

所述捕获抗体为将人微纤丝关联蛋白4克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的相应单克隆抗体。

所述捕获抗体的制备方法包括如下步骤：

（1）抗原的制备：把人微纤丝关联蛋白4的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；

（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的单克隆抗体为捕获抗体。

所述检测抗体为将人微纤丝关联蛋白4的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的相应多克隆抗体。

所述检测抗体的制备方法包括的步骤如下：

（1）抗原的制备：把人微纤丝关联蛋白4的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；

（2）检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的多克隆抗体为检测抗体。

所述捕获抗体预先包被于微量滴定板的孔内，可以简化步骤，提高检测效率。

用于肝纤维化诊断试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：

（1）抗原的制备：将人微纤丝关联蛋白4的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作为标准品用；

（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；

（3）检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；

（4）捕获抗体包被：

①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液 (pH9.6) 将浓度为 1μg/ml 的捕获抗体包被 微量滴定板的孔；②. 封盖微量滴定板并在 4℃ 下孵育过夜；③. 弃去包被液（碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体），并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入 200 μl PBST（磷酸盐吐温缓冲液），在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃环境中备用；

（5）封闭和加样：每孔添加 200μl 封闭缓冲液（1.2％BSA/PBS），封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。

用于肝纤维化诊断试剂盒的检测方法，其包括以下步骤：

（1） 抗原的制备：将人微纤丝关联蛋白4的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原；

（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；

（3）检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；

（4）捕获抗体包被：

①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液 (pH9.6) 将浓度为 1μg/ml 的捕获抗体包被微量滴定板的孔；

②.封盖微量滴定板并在 4℃ 下孵育过夜；

③.弃去包被液（碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体），并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入 200 μl PBST（磷酸盐吐温缓冲液），在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃环境中备用；

（5）封闭

①.在微量滴定板的每个孔添加 200μl 封闭缓冲液（1.2％BSA/PBS），封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点；

②.封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时；

（6）加样

①.将 100 μl的样品添加到每个孔，在 37℃孵育60分钟;要得到准确的定量结果，通常做法是比较未知样品与标准曲线的信号。每个酶标板都必须测定标准品（两重测定或三重测定）和空白样，以确保准确性；

②.弃去样品，并洗涤微量滴定板三次，每次在微孔中加入 200μl PBST（磷酸盐吐温缓冲液）；

③.将 100 μl 浓度为 0.5μg/ml的检测抗体添加到每个孔；

④.封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时；

⑤.用 PBST 洗涤微量滴定板四次；

⑥.添加 100 μl 标记二抗；

⑦.封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时；

⑧.用 PBST 洗涤微量滴定板四次；

(7)检测

①.将 TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺） 溶液添加到每个孔，孵育 15-30 分钟，添加等体积的终止液，然后在450 nm 处读取光密度；

②.由系列稀释液得到的数据绘制标准曲线，浓度标在 X 轴（对数标度）上，而吸光度标在 Y轴（线性标度）上。通过内插法在此标准曲线上得出样品浓度。

本发明从众多的肿瘤标记物中，筛选出新肿瘤标记物人微纤丝关联蛋白4(MFAP4)组成肝纤维化快速诊断试剂盒。人微纤丝关联蛋白4定位于细胞外基质纤维,包括弹性蛋白和胶原蛋白。人微纤丝关联蛋白4通过二硫键形成二聚体存在于多种组织中，其N末端含有RGD整合素结合序列，能活化平滑肌细胞。我们的研究表明人微纤丝关联蛋白4是肝纤维化的理想标记物。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：具有灵敏度高准确性强的特点，其灵敏度及准确性均达到70%以上。

附图说明

图1是本发明用于肝纤维化诊断试剂盒的原理图；

图2是本发明用于肝纤维化诊断试剂盒的检测抗体最佳工作浓度的选择对比图；

图3是本发明用于肝纤维化诊断试剂盒的对临床血清标本的诊断及鉴别诊断对比说明图；

图4是本发明用于肝纤维化诊断试剂盒特异性的检测对比图；

图5是本发明用于肝纤维化诊断试剂盒敏感性的检测对比图；

图6是本发明用于肝纤维化诊断试剂盒在肝纤维化治疗前后血中检测到人微纤丝关联蛋白4的变化对比图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明用于肝纤维化诊断试剂盒进行详细的描述说明。

用于肝纤维化诊断试剂盒，包括捕获抗体，捕获抗体封闭缓冲液、标准品、标记抗体、洗涤液及显色液，所述标记抗体选用HRP标记二抗，所述捕获抗体是人微纤丝关联蛋白4制得的单克隆抗体； 其灵敏度及准确性均达到70%。

所述捕获抗体为将人微纤丝关联蛋白4克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的相应单克隆抗体。

所述捕获抗体的制备方法包括如下步骤：

（1）抗原的制备：通过分子克隆的方法把人微纤丝关联蛋白4基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；所述抗原的制备也可以使用现有常规方法制备，在此不再累赘；

（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的单克隆抗体为捕获抗体；所述哺乳动物是小鼠及兔子，优选小鼠；所述捕获抗体的制备也可以使用现有常规方法制备，在此不再累赘。

所述检测抗体包括人微纤丝关联蛋白4制得的多克隆抗体。

所述捕检测抗体为将人微纤丝关联蛋白4的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的相应多克隆抗体。所述检测抗体的制备方法包括如下步骤：

（1）抗原的制备：通过分子克隆的方法把人微纤丝关联蛋白4基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；

（2）检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的多克隆抗体为检测抗体。所述哺乳动物是小鼠及兔子，优选兔子。

其中，所述捕获抗体可以预先包被于 PVC 材质的微量滴定板的孔内，可以简化步骤，提高检测效率。

用于肝纤维化诊断试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：

（1） 抗原的制备：通过分子克隆的方法将人微纤丝关联蛋白4基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作为标准品用；

（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；

（3）检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；

（4）捕获抗体包被：

①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液 (pH9.6) 将浓度为 1μg/ml 的捕获抗体包被于微量滴定板的孔；

②.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在 4℃下孵育过夜；

③.弃去包被液（碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体），并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入 200 μl PBST（磷酸盐吐温缓冲液），在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃环境中备用；所述洗涤液为PBS（磷酸盐缓冲液）中加入一定量的Tween 20，所述Tween 20的质量百分比浓度为0.05%；

（5）封闭

①.在微量滴定板的每孔添加 200μl 封闭缓冲液（为含1.2％BSA（牛血清白蛋白）的PBS（磷酸盐缓冲液）），用于封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点；

②.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时。

用于肝纤维化诊断试剂盒的检测方法，其包括以下步骤：

（1） 抗原的制备：通过分子克隆的方法将人微纤丝关联蛋白4基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作为标准品用；

（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；

（3）检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；

（4）捕获抗体包被：

①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液 (pH9.6) 将浓度为 1μg/ml 的捕获抗体包被 微量滴定板的孔；

②.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在 4℃下孵育过夜；

③.弃去包被液（碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体），并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入 200 μl PBST（磷酸盐吐温缓冲液，可以是含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液），在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃环境中备用；所述洗涤液为PBS（磷酸盐缓冲液）中加入一定量的Tween 20，所述Tween 20的质量百分比浓度为0.05%；

（5）封闭

①.在微量滴定板的每个孔添加 200μl 封闭缓冲液（1.2％BSA/PBS），封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点；

②.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时；

（6）加样

①.将 100 μl 适当稀释（稀释20倍）的样品添加到每个孔，在 37℃ 下孵育 60 分钟;要得到准确的定量结果，通常做法是比较未知样品与标准曲线的信号。每个酶标板都必须测定标准品（两重测定或三重测定）和空白样，以确保准确性；

②.弃去样品，并洗涤微量滴定板三次，每次在微孔中加入 200μl PBST（磷酸盐吐温缓冲液）；

③.将 100 μl浓度为 0.5μg/ml的检测抗体添加到每个孔；

④.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在37℃孵育 1小时；

⑤.用 PBST 洗涤微量滴定板四次；

⑥.添加 100 μl 标记二抗，其在使用前便已在PBS中稀释10000倍（1：10000）。所述标记二抗可以为HRP标记羊抗兔。

⑦.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在37℃孵育 1小时。

⑧.用 PBST 洗涤微量滴定板四次。

(7)检测

①.将 TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺） 溶液添加到每个孔，孵育 15-30 分钟，添加等体积的终止液 (2 M H₂SO₄)，然后用酶联免疫检测仪在450 nm 处读取光密度。

②.由系列稀释液得到的数据绘制标准曲线，浓度标在 X 轴（对数标度）上，而吸光度标在 Y轴（线性标度）上。通过内插法在此标准曲线上得出样品浓度。

本发明用于肝纤维化诊断试剂盒把人微纤丝关联蛋白4升高作为诊断早中期肝纤维化的标准,检测原理如图1所示；人微纤丝关联蛋白4下降作为肝纤维化治疗效果评估的标准。可以用于临床上通过检测血中肿瘤标记物水平的高低对肝纤维化的治疗效果进行动态评估。另外还可以用于临床上对肝纤维化的复发及预后判断的应用。

试验效果说明

双抗体夹心 ELISA最佳实验条件的选择

包被鼠抗人微纤丝关联蛋白4单抗最佳工作浓度的选择 ：根据方阵法确定包被浓度为1ug/mL时，单克隆抗体的OD值为1.07，所以其最佳包被浓度为1ug/mL。如图2所示， 兔抗人微纤丝关联蛋白4多抗最佳工作浓度的选择：随着单抗稀释倍数的增加，待测肝纤维化病例血清和正常人血清 OD值有递减的趋势，当抗体浓度为 1：200时，阳性对照 (阳性对照 OD值减去空白对照 OD值 )与正常对照 (正常对照 OD值减去空白对照 OD值 )A450nm之比 (简称 P／N值 )较高，故选择兔抗人抗体最佳工作浓度为 1：200。血清摸索的最佳工作浓度为 1：25。封闭液摸索最佳工作溶度为 1.2％BSA。

临床血清标本检测

共检测了106份血清标本，以医院经病理确诊为肝纤维化患者血清为阳性对照组（45例（其中早期肝纤维化20例，晚期肝纤维化25例）），非肝纤维化患者包括肝炎、正常人群血清为阴性对照组（61例（正常40例，肝炎21例）） ，PBST为空白对照，通过上述双抗夹心 ELISA法进行定性及定量检测临床血清标本。如图2所示，以 P／N值 >2为双抗夹心ELISA阳性判定标准，以病理诊断为标准对临床血清标本进行检测；图3说明肝纤维化患者血清中人微纤丝关联蛋白4的水平显著高于正常人（P<0.01）。早期肝纤维化结果检测灵敏性（SN）为 55％（11/20），晚期肝纤维化检测灵敏性（SN）为 68％（17/25）；正常人检测特异性（SP）为 75％（30/40），肝炎患者检测特异性（SP）为 57％（12/21）。见图4-5。

临床对肝纤维化的治疗效果进行动态评估

为确定本试剂盒能否用于对肝纤维化的治疗效果进行动态评估，我们收集了23份肝纤维化患者治疗前后的血清。23个患者的检测结果参见图6，结果显示肝纤维化患者治疗前后的血清中人微纤丝关联蛋白4的水平有显著差异（P<0.05）。有效治疗后血清中人微纤丝关联蛋白4的水平会大大下降，提示本试剂盒能用于对肝纤维化的治疗效果进行动态评估。