一种铜离子显色试剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及离子检测技术领域，特指一种铜离子显色试剂及其制备方法和应用。

背景技术：

铜离子是人体内含量仅次于铁和锌的第三种必需元素，它在骨骼的形成、细胞呼吸、造血功能、心血管疾病的预防、促进结缔组织形成等生理过程中起着重的作用，；同时也是集中金属酶的催化因子。它在人体中的含量对人类健康十分重要，通常随着人年龄的增长，人体对铜离子的需求也就越大，从婴儿时期的0.4～0.6mg到成人之后的1.5～3mg。若人体细胞中的铜离子平衡失调，可能会引起许多类似如老年痴呆症、朊病毒病的神经退行性疾病，另外利用重金属离子可以使蛋白质变性的原理，铜离子可以配制瓜果蔬菜等职务的杀菌剂—波尔多液，还可以作为木质或皮质材料的防腐剂。

目前常见的铜离子检测方法主要包括离子色谱法、分子光谱法(分光光度法、紫外可见分光光度法、荧光光谱法)和原子吸收/发射光谱法、电化学方法等。上述方法在使用成本、操作复杂程度、检测灵敏度及选择性方面各有优缺点。例如：国标中常用的二乙胺基二硫代甲酸钠分光光度法成本较低，但操作步骤繁琐，检测灵敏度相对有限；而高灵敏度的原子吸收/发射光谱法则需要借助价格和运行成本较为昂贵的大型仪器，以及高素质专业技术人员，从而限制了它们的使用范围。

相对而言，基于铜离子显色剂的紫外可见分光光度检测法在仪器普及程度、使用成本具有综合优势。该检测方法的灵敏度和选择性方面则取决于铜离子显色试剂的性能。

因此，本发明人对此做进一步研究，研发出一种铜离子显色试剂及其制备方法和应用，本案由此产生。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种铜离子显色试剂，其灵敏度高，在生物和环境等体系中检测低浓度的Cu²⁺分析等方面具有潜在的应用价值。

本发明的目的之二在于提供一种铜离子显色试剂的制备方法，以荧光素为母体，通过三步合成反应来制备，工艺简单。

本发明的目的之三在于提供一种铜离子显色试剂的应用，该显色试剂可建立简便快捷、高灵敏度的紫外可见分光光度铜离子检测法，

为解决上述技术问题，本发明的技术解决方案是：

一种铜离子显色试剂，包含6-O-己基肼荧光素甲酯，其结构式为：

一种铜离子显色试剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：荧光素甲酯的合成，将荧光素溶于甲醇，浓硫酸为催化剂，反应式如下：

步骤二：6-O-己基溴荧光素甲酯的合成，将步骤一得到的荧光素甲酯溶于无水乙腈中，加入BrCH₂(CH₂)₄CH₂Br和K₂CO₃，反应式如下：

步骤三：6-O-己基肼荧光素甲酯的合成，将步骤二中得到的6-O-溴已酰荧光素甲酯溶于无水乙腈中，加入水合肼，反应式如下：

优选的，在步骤一中，取荧光素3.32g溶于10mL的甲醇中，然后滴入2.5mL的浓硫酸做催化剂，用磁力搅拌器加热回流大约14小时，当反应停止后，再加入10g冰，之后用10gNaHCO₃粉末小心中和，过滤，再加入质量百分浓度为1％的醋酸溶液溶解反应中过量的NaHCO₃，过滤，水洗，干燥后得到荧光素甲酯2.946g。

优选的，在步骤二中，取荧光素甲酯0.5g溶于10mL无水乙腈中，加入BrCH₂(CH₂)₄CH₂Br 2.03mL，其物质的量浓度为13.2mmol/mL，以及K₂CO₃ 1.7g，放入90℃油浴加热搅拌5小时，混合物经饱和NaCl沉淀，过滤，干燥，得6-O-己基溴荧光素甲酯1.97g。

优选的，在步骤三中，取6-O-溴已酰荧光素甲酯1.35g溶于30mL无水乙腈中，加入水合肼5.4mL，常温搅拌2小时，然后旋转蒸发除去溶剂，真空干燥，得到6-O-己基肼荧光素甲酯0.57g。

一种铜离子显色试剂的应用，该显色试剂选择性的对溶液体系中的Cu²⁺进行高灵敏度快速响应，建立铜离子溶液浓度紫外可见分光光度检测法。

优选的，检测线性范围为0.3μmol/L-5μmol/L、检测限为0.03μmol/L。

优选的，将显色试剂溶于乙醇溶液，其中，6-O-己基肼荧光素甲酯物质的量浓度为50μmol/L-100μmol/L。

采用上述方案后，由于本发明采用简单合成路线，方便易得的原料，以荧光素为母体，通过三步合成反应制备了一种新型Cu²⁺显色试剂，该显色试剂可选择性的对溶液体系中的Cu²⁺进行高灵敏度快速响应，基于该显色试剂可建立简便快捷、高灵敏度的紫外可见分光光度铜离子检测法，在生物和环境等体系中检测低浓度的Cu²⁺分析等方面具有潜在的应用价值。6-O-己基肼荧光素作为新型荧光素衍生物，它具有相当的优越性和发展潜力。

附图说明

图1是本发明的6-O-己基肼荧光素甲酯的吸收光谱图，溶液1的吸收光谱曲线(a)，溶液2的吸收光谱曲线(b)，溶液3的吸收光谱曲线(c)；

图2是本发明的不同pH值6-O-己基肼荧光素甲酯和Cu²⁺显色反应的吸收峰峰值；

图3是本发明的显色效果随时间变化图；

图4是本发明不同金属离子与6-O-己基肼荧光素甲酯显色反应的吸收光谱曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详述。

取荧光素3.32g溶于10mL的甲醇中，然后滴入2.5mL的浓硫酸做催化剂，用磁力搅拌器加热回流大约14小时，当反应停止后，再加入10g冰，之后用10g NaHCO₃粉末小心中和，过滤，再加入质量百分浓度为1％的醋酸溶液溶解反应中过量的NaHCO₃，过滤，水洗，干燥后得到荧光素甲酯2.946g。

取荧光素甲酯0.5g溶于10mL无水乙腈中，加入BrCH₂(CH₂)₄CH₂Br 2.03mL，其中，BrCH₂(CH₂)₄CH₂Br物质的量浓度为13.2mmol/mL，以及K₂CO₃ 1.7g，放入90℃油浴加热搅拌5小时，混合物经饱和NaCl沉淀，过滤，干燥，得6-O-己基溴荧光素甲酯1.97g。

取6-O-溴已酰荧光素甲酯1.35g溶于30mL无水乙腈中，加入水合肼5.4mL，常温搅拌2小时，然后旋转蒸发除去溶剂，真空干燥，得到6-O-己基肼荧光素甲酯0.57g。

以上述获得6-O-己基肼荧光素甲酯来进行以下测试。在测试之前，先将本发明的显色试剂溶于乙醇溶液，其中，6-O-己基肼荧光素甲酯物质的量浓度为50μmol/L-100μmol/L。

首先，测试6-O-己基肼荧光素甲酯和Cu²⁺的显色反应，取两个500mL烧杯，烧杯1保持空白加入250mL蒸馏水，烧杯2中加入250mL的2μmol/LCuSO₄溶液。向两个烧杯中分别滴加50μL的100μmol/L6-O-己基肼荧光素甲酯乙醇溶液。摇匀静止片刻，烧杯1中溶液(溶液1)颜色基本不变，烧杯2溶液(溶液2)从无色变成了浅褐色。表明6-O-己基肼荧光素甲酯和Cu²⁺会发生明显的显色反应。取烧杯2溶液100mL调为酸性(溶液3)待用。

如图1所示，在紫外可见分光光度计上对上述中最终得到的三种溶液(溶液1、溶液2和溶液3)进行吸收光谱扫描。图1表明，三种溶液在516nm处都有吸收峰，而6-O-己基肼荧光素甲酯空白溶液(溶液1)的光谱曲线a在516nm处仅有微弱吸收峰；当Cu²⁺存在时溶液2的光谱曲线b在516nm处产生了明显吸收峰；当溶液体系为酸性时的溶液3，其光谱曲线c在516nm处的吸收峰得到了显著增强。

其次，溶液体系pH对6-O-己基肼荧光素甲酯和Cu²⁺的显色反应的吸收光谱曲线的影响，考察pH 1-12溶液体系中6-O-己基肼荧光素甲酯和Cu²⁺的显色反应效果，其中6-O-己基肼荧光素甲酯浓度均为100μmol/L，铜离子浓度均为5μmol/L。pH＝1和pH＝2溶液体系由硝酸调节，pH 3-7由醋酸-醋酸钠缓冲调节，pH 8-12由硼酸-硼砂缓冲体系调节。在紫外—可见分光光度计分别扫描上述12种溶液的吸收光谱。各曲线的吸收峰峰值如图2所示，从图2可以看出，溶液体系的对6-O-己基肼荧光素甲酯和Cu²⁺显色反应的有明显影响，较强的酸性或碱性环境均为不利影响，而弱酸性条件下pH 4-6时，体系的吸光度较大，当pH＝4时，吸光度达到最大。因此后续检测过程中均在pH＝4溶液体系条件下进行。

再次，测试显色时间对吸光度的影响，在室温(25℃)下，考察显色反应吸光度随时间变化，显色反应开始后，每隔5分钟测试体系的吸收峰峰值，检测时段为1小时，如图3所示，从图3可以看出，在25min时，溶液体系达到了最大吸光度，之后基本稳定。因此，后续检测过程均在显色反应开始后25min进行。

最后，测试6-O-己基肼荧光素甲酯检测Cu²⁺的选择性，同等条件下考察常与铜离子共存的一些金属离子与6-O-己基肼荧光素甲酯显色反应的吸收光谱曲线，可知，它们在516nm处不产生吸收峰，如图4所示，这说明当这些金属离子与铜离子共存时不会干扰铜离子的分析检测。因此，本发明的试剂只与溶液中铜离子发生显色反应，吸收波长在516nm左右，与其它常见的金属离子不发生显色反应。

根据上述实验过程所得检测条件，改变Cu²⁺浓度，在516nm处测量吸光度，可知在铜离子浓度0.3μmol/L-5μmol/L范围内，吸光度与Cu²⁺浓度呈线性相关。线性关系为：y＝0.01668x+0.7768，R²＝0.9803，检测限为0.03μmol/L。式中y为吸光度，x为铜离子浓度单位μmol/L。

因而，将本发明的显示试剂运用于紫外可见分光光度检测法中，来检测在生物和环境等体系样品中的Cu²⁺，是一种方便快捷的铜离子检测方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术范围作任何限制，故但凡依本发明的权利要求和说明书所做的变化或修饰，皆应属于本发明专利涵盖的范围之内。