本发明涉及氨基酸检测技术领域，尤其涉及一种美洲大蠊溶液中总氨基酸含量的检测方法。
背景技术：
康复新液是一种外科常用药，其原料为美洲大蠊。康复新液在临床上被广泛应用于烧伤、烫伤、战伤、创面感染及顽固性溃疡、褥疮等，使用简便易行，疗效较好，该单品种产品市场销量很好。康复新液产品富含丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸等18种氨基酸，因此总氨基酸含量是产品质量的主要评估指标之一。康复新液的原料提取物即美洲大蠊乙醇提取物、半成品即康复新液待灌液和成品康复新液均需对总氨基酸含量进行质量控制，由于其中的丙氨酸含量比重最大，故以丙氨酸作为总氨基酸含量的评估标准。
现有的康复新液中总氨基酸含量的检测方法包括以下步骤：对照品溶液的制备：精密称取在105℃干燥至恒重的丙氨酸对照品50mg，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取5mL稀释摇匀后的溶液，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。标准曲线的建立：精密量取所述对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于10mL具塞试管中，加水至1mL；然后依次加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液(pH5.0)1.0mL、1％抗坏血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚试液3.0mL，摇匀，置于沸水浴中加热15分钟，取出，放冷；再加入80％乙醇3.0mL，摇匀，采用紫外分光光度法试验，在570nm波长处分别测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。待测品的测定：精密量取康复新液待测品2mL，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取1mL稀释摇匀后的溶液，置于10mL具塞试管中，然后依次加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液(pH5.0)1.0mL、1％抗坏血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚试液3.0mL，摇匀，置于沸水浴中加热15分钟，取出，放冷；再加入80％乙醇3.0mL，摇匀，在570nm波长处测定紫外吸收度，从所述标准曲线上读出待测品溶液中氨基酸的含量，计算，即得。国家标准规定：康复新液成品每1mL含总氨基酸以丙氨酸(C3H7NO2)计，不得少于0.72mg。
现有的标准曲线法可检测出康复新液中总氨基酸的含量，但是检测方法操作复杂，检测耗时较长(一般在2h以上)，影响生产周期。
技术实现要素：
有鉴于此，本申请提供一种美洲大蠊溶液中总氨基酸含量的检测方法，本申请提供的检测方法操作简便、检测时长较短，生产周期较短。
本申请提供一种美洲大蠊溶液中总氨基酸含量的检测方法，包括以下步骤：
提供浓度为0.014mg/mL～0.018mg/mL的丙氨酸对照品溶液；
将美洲大蠊溶液待测品用水稀释，稀释后的待测品与茚三酮溶液进行反应，得到预处理的待测品；同时将所述丙氨酸对照品溶液与所述茚三酮溶液同样进行反应，得到预处理的对照品；
将所述预处理的待测品、预处理的对照品分别和乙醇溶液混合后，采用紫外分光光度法检测，分别得到570nm波长处的待测品吸收度和对照品吸收度；
按照式1所示公式计算，得到美洲大蠊溶液中总氨基酸含量；
美洲大蠊溶液待测品总氨基酸含量＝丙氨酸对照品溶液浓度/对照品吸收度*待测品吸收度*待测品稀释倍数式1。
优选的，所述美洲大蠊溶液选自康复新液或康复新液待灌液；
所述茚三酮溶液为茚三酮乙二醇甲醚试液。
优选的，所述稀释后的待测品与茚三酮溶液的反应在缓冲液和抗坏血酸溶液存在的条件下进行；
所述缓冲液不含与茚三酮反应的基团，且所述缓冲液的pH值为5～7。
优选的，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、邻苯二甲酸盐缓冲液或枸橼酸类缓冲液。
优选的，所述待测品稀释倍数为50倍，稀释后的待测品的用量为1mL；
所述缓冲液的pH值为5，浓度为0.2mol/L，用量为1mL；
所述抗坏血酸溶液的质量浓度为1％，用量为0.1mL；
所述茚三酮溶液的用量为3mL。
优选的，所述乙醇溶液的质量浓度为80％，用量为3mL。
优选的，所述稀释后的待测品与茚三酮溶液的反应通过在沸水浴中加热实现。
优选的，所述加热的时间为15min。
与现有技术相比，本申请提供的美洲大蠊溶液中总氨基酸含量的检测方法包括以下步骤：提供浓度为0.014mg/mL～0.018mg/mL的丙氨酸对照品溶液；将美洲大蠊溶液待测品用水稀释，得到稀释后的待测品；所述稀释后的待测品与茚三酮溶液进行反应，得到预处理的待测品，再将其和乙醇溶液混合，按照紫外分光光度法检测，在570nm波长处测得待测品吸收度；将所述丙氨酸对照品溶液与稀释后的待测品同时同法操作，测得对照品吸收度；按照式1所示公式计算，即得。本申请利用美洲大蠊溶液中总氨基酸与茚三酮的显色反应，以及氨基酸浓度与570nm波长的紫外吸收度具有良好的线性关系，采用单点对照品比较法检测得到美洲大蠊溶液中总氨基酸含量，耗时在30min以内。因此，本申请提供的检测方法操作简便，能大大减少检测时间，同时其精密度和重复性等都符合生产对总氨基酸含量检测的要求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的检测方法的精密度试验折线图。
具体实施方式
下面对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请提供了一种美洲大蠊溶液中总氨基酸含量的检测方法，包括以下步骤：
提供浓度为0.014mg/mL～0.018mg/mL的丙氨酸对照品溶液；
将美洲大蠊溶液待测品用水稀释，稀释后的待测品与茚三酮溶液进行反应，得到预处理的待测品；同时将所述丙氨酸对照品溶液与所述茚三酮溶液同样进行反应，得到预处理的对照品；
将所述预处理的待测品、预处理的对照品分别和乙醇溶液混合后，采用紫外分光光度法检测，分别得到570nm波长处的待测品吸收度和对照品吸收度；
按照式1所示公式计算，得到美洲大蠊溶液中总氨基酸含量；
美洲大蠊溶液待测品总氨基酸含量＝丙氨酸对照品溶液浓度/对照品吸收度*待测品吸收度*待测品稀释倍数式1。
本申请提供了一种总氨基酸含量(康复新液和美洲大蠊提取液等)的快速检测技术，效率高。
本申请实施例制备成浓度为0.014mg/mL～0.018mg/mL的丙氨酸对照品溶液，浓度在0.016mg/mL最佳。所述丙氨酸对照品的来源可为中国药品生物制品鉴定所(140680-201002)，含量为100.0％。
本申请实施例精密量取美洲大蠊溶液待测品，置于量瓶中用水稀释至刻度，摇匀，得到稀释后的待测品。
在本申请中，所述美洲大蠊溶液包括美洲大蠊提取液如美洲大蠊乙醇提取液或稀释溶解的美洲大蠊提取物、康复新液(成品)和康复新液待灌液(康复新液半成品，总氨基酸要求控制在0.77mg/mL以上)等。本申请实施例中所述美洲大蠊溶液选自康复新液或康复新液待灌液，优选为康复新液待灌液。
在本申请中，所述待测品稀释倍数优选为50倍，如精密量取待测品2mL，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得到稀释后的待测品。本申请实施例精密量取稀释后的待测品1mL，置于10mL具塞试管中。
得到稀释后的待测品后，本申请实施例加入茚三酮溶液进行反应，得到预处理的待测品；同时将所述丙氨酸对照品溶液与所述茚三酮溶液同样进行反应，得到预处理的对照品。
本申请加入茚三酮溶液，利用美洲大蠊溶液中总氨基酸与茚三酮的显色反应进行总氨基酸含量的检测。在本申请的实施例中，所述茚三酮溶液为茚三酮乙二醇甲醚试液。本申请对所述茚三酮溶液的来源没有特殊限制，具体的，所述茚三酮乙二醇甲醚试液的配制方法包括：取2.5g茚三酮，加入50mL乙二醇甲醚使溶解，另取浓度为0.01mol/L的氰化钾溶液5mL，用乙二醇甲醚稀释至250mL，将上述茚三酮乙二醇甲醚溶液和氰化钾乙二醇甲醚溶液这两种溶液混匀，放置24小时即得试液，所述试液在2℃～8℃于暗处保存，储存一周待用；所述茚三酮乙二醇甲醚试液的用量可为3mL。
在本发明的优选实施例中，所述稀释后的待测品与茚三酮溶液的反应在缓冲液和抗坏血酸溶液存在的条件下进行，得到预处理的待测品。其中，所述抗坏血酸溶液的质量浓度优选为1％，用量优选为0.1mL。
所述缓冲液一般不含与茚三酮反应的基团如胺基等，且所述缓冲液的pH值优选为5～7；所述缓冲液优选自磷酸盐缓冲液、邻苯二甲酸盐缓冲液或枸橼酸类缓冲液如枸橼酸缓冲液。在本申请的优选实施例中，所述缓冲液的pH值为5，浓度可为0.2mol/L，用量可为1mL。
在本申请的一个实施例中，所述缓冲液为磷酸二氢钾-氢氧化钠溶液，pH值为6.8，配制方法可为：把25mL 0.2mol/L的磷酸二氢钾与23.6mL 0.1mol/L氢氧化钠混合均匀，加水稀释至100mL。在本申请的一个实施例中，所述缓冲液为pH值为5的磷酸盐缓冲液，配制方法可为：取0.2mol/L磷酸二氢钠溶液一定量，用氢氧化钠试液调节pH值至5，即得。在本申请的一个实施例中，所述缓冲液为pH值为5.6的邻苯二甲酸盐缓冲液，配制方法可为：取邻苯二甲酸氢钾10g，加水900mL，搅拌使溶解，用氢氧化钠试液(必要时用稀盐酸)调节pH值至5.6，加水稀释至1000mL，混匀，即得。在本申请的一个实施例中，所述缓冲液为pH值为5.8的磷酸盐缓冲液，配制方法可为：取磷酸二氢钾8.34g与磷酸氢二钾0.87g，加水使溶解成1000mL，即得。在本申请的一个实施例中，所述缓冲液为pH值为5的枸橼酸缓冲液，浓度为0.2mol/L，用量为1mL。在本申请的一个实施例中，所述缓冲液为pH值为6.2的枸橼酸盐缓冲液，配制方法可为：取枸橼酸4.2g，加1mol/L的20％乙醇制氢氧化钠溶液40mL使溶解，再用20％乙醇稀释至100mL，即得；或者，取2.1％枸橼酸水溶液，用50％氢氧化钠溶液调节pH值至6.2，即得。在本申请的一个实施例中，所述缓冲液为pH值为6.5的磷酸盐缓冲液，配制方法可为：取磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液15.2mL，用水稀释至100mL，即得。在本申请的一个实施例中，所述缓冲液为pH值为6.6的磷酸盐缓冲液，配制方法可为：取磷酸二氢钠1.74g、磷酸氢二钠2.7g与氯化钠1.7g，加水使溶解成400mL，即得。
在本发明的优选实施例中，所述稀释后的待测品与茚三酮溶液的反应通过在沸水浴中加热实现，加热一定时间后取出反应容器，放冷，得到预处理的待测品。所述沸水浴为本领域技术人员所熟知的，温度为98℃～100℃；所述加热的时间优选为15min。
本申请实施例精密量取所述丙氨酸对照品溶液，与稀释后的待测品同时同法操作，如同时将所述丙氨酸对照品溶液与所述茚三酮溶液同样进行反应，得到预处理的对照品。在此，对得到预处理的对照品的过程不作赘述。
得到预处理的待测品和预处理的对照品后，本申请实施例分别再加入乙醇溶液，摇匀，按照紫外分光光度法检测，分别得到570nm波长处的待测品吸收度和对照品吸收度；最后按照式1所示公式计算，即得美洲大蠊溶液中总氨基酸含量。
在本申请的一个实施例中，所述乙醇溶液的质量浓度为80％，用量可为3mL。紫外(可见光)分光光度法，是根据物质分子对波长为200nm～760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。本申请采用紫外分光光度法，利用氨基酸浓度与570nm波长的紫外吸收度具有良好的线性关系，通过单点对照品比较法检测美洲大蠊溶液中总氨基酸含量。本申请对所述紫外分光光度法检测没有特殊限制，在570nm波长处同时同法测得待测品和对照品的吸收度即可。
得到待测品和对照品的吸收度，本申请按照式1所示公式计算，得到美洲大蠊溶液中总氨基酸含量；
美洲大蠊溶液待测品总氨基酸含量＝丙氨酸对照品溶液浓度/对照品吸收度*待测品吸收度*待测品稀释倍数式1。式1中“*”代表乘号。
本申请提供的检测方法可适用于实验室检测具体的总氨基酸含量，操作简便，能大大减少检测时间，同时其精密度和重复性等都符合生产对总氨基酸含量检测的要求。
为了进一步理解本申请，下面结合实施例对本申请提供的美洲大蠊溶液中总氨基酸含量的检测方法进行具体地描述。
以下实施例所用丙氨酸对照品的来源为中国药品生物制品鉴定所(140680-201002)，含量为100.0％；康复新液及康复新液半成品均为湖南科伦制药有限公司生产；紫外分光光度仪型号为TU-1950(北京普析公司)；所用的茚三酮乙二醇甲醚试液的配制方法包括：取2.5g茚三酮，加入50mL乙二醇甲醚使溶解，另取浓度为0.01mol/L的氰化钾溶液5mL，用乙二醇甲醚稀释至250mL，将上述茚三酮乙二醇甲醚溶液和氰化钾乙二醇甲醚溶液这两种溶液混匀，放置24小时即得试液，所述试液在2℃～8℃于暗处保存，储存一周待用。
实施例1精密度试验
精密称取丙氨酸对照品16mg，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；再精密量取稀释后的对照品5mL，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得浓度为16μg/mL的丙氨酸对照品溶液。
精密量取康复新液(M140941)待测品2mL，取10份(1份做1次试验)，分别置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；分别精密量取稀释后的待测品1mL，置于10mL具塞试管中，依次加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液(pH5.0)1.0mL、1％抗坏血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚试液3.0mL，摇匀，置于沸水浴中加热15分钟，取出，放冷；再加入80％乙醇3.0mL，摇匀，按照紫外分光光度法试验，在570nm波长处测定吸收度。
精密量取所述丙氨酸对照品溶液1mL，置于10mL具塞试管中，与稀释后的待测品同时同法操作，测定吸收度。
按照式1所示公式计算，得到所述康复新液中总氨基酸(以丙氨酸计)含量，结果参见表1和图1，表1为本申请实施例提供的检测方法的精密度试验结果，图1为本申请实施例提供的检测方法的精密度试验折线图。
表1本申请实施例提供的检测方法的精密度试验结果
用格鲁布斯法对表1和图1中数据进行取舍，十次测定平均值为0.81992mg/mL，极差为0.0171，标准偏差为0.00601，相对标准偏差为0.73％。
检验最大值：T＝(0.8277-0.81992)/0.00601＝1.29；
检验最小值：T＝(0.81992-0.8106)/0.00601＝1.55；
查表可知，T0.99,10＝3.25；
因最大值、最小值的T均符合T＜T0.99,10，故最大、最小值应保留，进行统计计算。计算结果包括：
本发明实施例提供的检测方法的精密度为：RSD＝0.73％；
根据精密度实验结果，查测定次数n＝10；
显著性水平α＝0.01(置信度为99％)；
置信系数T＝3.17；
单次测量值的置信界限为：X±TS＝0.81992±0.01905；
根据单次测量值置信范围，确定相对误差标准为：
TS/X＝±0.01905/0.81992*100％＝±2.3％。
由此可知，本申请具有99％的把握，两次平行测定的数据的相对误差不超过2.3％。
实施例2回收率试验
精密量取康复新液(M140516)待测品2mL，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取稀释后的待测品1mL，置于10mL具塞试管中，依次加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液(pH5.0)1.0mL、1％抗坏血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚试液3.0mL，摇匀，置于沸水浴中加热15分钟，取出，放冷；再加入80％乙醇3.0mL，摇匀，按照紫外分光光度法试验，在570nm波长处测定吸收度。
精密量取浓度为16μg/mL的丙氨酸对照品溶液1mL，置于10mL具塞试管中，与稀释后的待测品同时同法操作，测定吸收度。按照式1所示公式计算，得到所述康复新液中总氨基酸(以丙氨酸计)含量。
将测得总氨基酸含量的康复新液M140604(含量为0.80mg/mL)作溶剂，取9份(编号为1至9)，每份100mL，分别溶解、稀释不同质量的丙氨酸对照品，再采用上述紫外分光光度法测定并推算出对照品的实测质量。结果参见表2，表2为本申请实施例提供的检测方法的回收率试验结果。
表2本申请实施例提供的检测方法的回收率试验结果
实测量指除去试样测量值后的标准物质实测量，所述试样测量值为0.80mg/mL。
对表2准确度的实验结果进行统计分析，分析结果包括：平均回收率为100.58％，相对标准偏差为0.94％，达到生产对检验的精度要求；回收率在98.0％～102.0％之间。由此可知，本申请实施例提供的检测方法准确度良好。
实施例3
精密称取丙氨酸对照品16mg，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；再精密量取稀释后的对照品5mL，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得浓度为16μg/mL的丙氨酸对照品溶液。
精密量取康复新液(M140516)待测品2mL，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取稀释后的待测品1mL，置于10mL具塞试管中，依次加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液(pH5.0)1.0mL、1％抗坏血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚试液3.0mL，摇匀，置于沸水浴中加热15分钟，取出，放冷；再加入80％乙醇3.0mL，摇匀，按照紫外分光光度法试验，在570nm波长处测定吸收度。
精密量取所述丙氨酸对照品溶液1mL，置于10mL具塞试管中，与稀释后的待测品同时同法操作，测定吸收度。按照式1所示公式计算，得到所述康复新液中总氨基酸(以丙氨酸计)含量。
按照上述方法，由两名检验员分别检验上述康复新液待测品，检验10次，结果参见表3，表3为本发明实施例对康复新液M140516和M140627的检测结果。
实施例4
按实施例3的检测方法，由所述两名检验员分别检验康复新液(M140627)待测品，检验10次，结果参见表3。
表3本发明实施例对康复新液M140516和M140627的检测结果
对表3检验结果进行统计分析，分析结果参见表4，表4为本发明实施例对康复新液M140516和M140627检测结果的统计分析结果。
表4本发明实施例对康复新液M140516和M140627检测结果的统计分析结果
从上述数据看出：本申请实施例检测数据均能符合≤2.3％的相对误差要求，RSD均符合生产的精密度要求，且经统计平均每个样品测定时间为25min。
实施例5
精密量取批号为M140604的康复新液半成品待测品2mL，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取稀释后的待测品1mL，置于10mL具塞试管中，依次加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液(pH5.0)1.0mL、1％抗坏血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚试液3.0mL，摇匀，置于沸水浴中加热15分钟，取出，放冷；再加入80％乙醇3.0mL，摇匀，按照紫外分光光度法试验，在570nm波长处测定吸收度，其结果为0.4755。
精密量取浓度为0.016mg/mL的丙氨酸对照品溶液1mL，置于10mL具塞试管中，与稀释后的待测品同时同法操作，测定吸收度，其结果为0.4730。
按照式1所示公式计算：
半成品待测品总氨基酸含量＝0.016/0.4730*0.4755*50＝0.80mg/mL；
所述康复新液半成品中总氨基酸(以丙氨酸计)含量为0.80mg/mL，符合不少于0.77mg/mL的规定。所述半成品检测含量合格，可灌装成成品。
实施例6
精密量取批号为M140516的康复新液(已知浓度为0.81mg/mL)0.5mL、1mL、2mL、4mL、6mL，分别置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，分别制成待测样品溶液①～⑤；分别精密量取稀释后的待测品1mL，置于10mL具塞试管中，依次加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液(pH5.0)1.0mL、1％抗坏血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚试液3.0mL，摇匀，置于沸水浴中加热15分钟，取出，放冷；再加入80％乙醇3.0mL，摇匀，按照紫外分光光度法试验，在570nm波长处测定吸收度。
精密量取浓度为0.004mg/mL、0.008mg/mL、0.016mg/mL、0.032mg/mL、0.048mg/mL的丙氨酸对照品溶液1mL，置于10mL具塞试管中，与稀释后的待测品同时同法操作，测定吸收度，并按照式1所示公式计算计算待测品含量，结果如表5：
表5本发明实施例采用不同浓度对照品溶液检测结果的统计分析结果
从上述数据看出：当对照品浓度为0.016mg/mL时，检测值与样品已知浓度最为接近。
由以上实施例可知，本申请采用单点对照品比较法检测得到美洲大蠊溶液(如康复新液成品和半成品)中总氨基酸含量，耗时在30min以内。本申请提供的检测方法操作简便，能大大减少检测时间，同时其精密度和重复性等都符合生产对总氨基酸含量检测的要求。