一种比伐卢定中氨基酸的检测分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于高效液相色谱检测领域，具体涉及一种比伐卢定中氨基酸的检测分析 方法。
【背景技术】
[0002] 高效液相色谱法是利用衍生化试剂将荧光基团加在氨基酸的氨基上，然后通过荧 光和紫外检测器进行检测。此方法较灵敏，分离条件较易改进，通用性强，分析速度较快。 1993年，Waters公司开发了反相高效液相色谱法方法-AccQ· Tag法。此法操作简单；灵敏度 极高，定量结果准确;精确度高，重复性好。能够较好地分离天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘 氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨 酸、赖氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸17种氨基酸。比伐卢定作为一种常见药，但是关于比伐卢定 中氨基酸成分的测定方法报道甚少，因此探寻比伐卢定中氨基酸成分的测定方法是目前迫 切需要解决的问题。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种比伐卢定中氨基酸的检测分析方法。
[0004] 基于上述目的，本发明采取如下技术方案： 一种比伐卢定中氨基酸的检测分析方法，包括如下步骤： (1) 衍生前处理程序:6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)柱前衍生； (2) 样品检测:AccQ· Tag氨基酸分析C18柱，3.9 X 150mm，4μπι，柱温:37°C，流速：1. OmL/ min，检测波长:254nmUV，流动相A:量取lOOmLAccQ· Tag洗脱剂A浓溶液，加入900mL水混合 均匀即得;流动相B:乙腈;流动相C:纯水； 梯度洗脱程序:~36min，流动相A: 100%~78%，流动相B: 0~22%，流动相C: 0; 36 · 0卜 4〇111；[11，流动相4:0%，流动相13:60%，流动相(：:40% ; 40 · 01~50min，流动相A: 100%，流动相B: 0，流动相C: 0; (3) 结果判定:将待测比伐卢定和氨基酸标样谱图对比，根据下式计算比伐卢定中各氨 基酸的含量， 计算公式：
MRX:测得氨基酸组分相对摩尔比值； Mx:样品衍生溶液中某氨基酸摩尔数； Aspl:样品衍生溶液中某氨基酸峰面积； Ai std:样品衍生溶液中内标物质峰面积； Aistd ' ：氨基酸标样衍生溶液中内标物质峰面积； Astd:氨基酸标样衍生溶液中某氨基酸峰面积； Rspl:样品衍生溶液中某氨基酸峰与内标物峰比值； :氨基酸标样衍生溶液中氨基酸峰与内标物峰比值的平均值； Cstd:氨基酸标准样品溶液衍生前所含对应氨基酸摩尔浓度，μπιο?/μL; S :测定得到样品衍生溶液中的氨基酸的摩尔数之和。
[0005] 所述步骤(1)中柱前衍生包括氨基酸标样衍生溶液和样品比伐卢定衍生溶液的制 备，样品比伐卢定衍生溶液的制备包括如下步骤： 1) 水解样品的制备 取比伐卢定25mg，一式两份，精密称定，置10ml容量瓶中，加水释释定容至刻度，混匀； 用微量移液器移取50μ1上述溶液注入清洁的自动进样瓶底部，置真空干燥箱，55°C真空干 燥样品溶液l〇min;在20ml的反应瓶中加入300μ1的含0.1%苯酚的6mol/L盐酸，将自动进样 瓶放入反应瓶，用氮气吹扫反应瓶2分钟，用瓶塞密封反应瓶，在110°C水解24小时;冷却反 应瓶，打开瓶塞，擦去自动进样瓶外过量的盐酸，并在55°C真空干燥，得水解样品； 2) 含内标物的水解样品 加500ul水到水解样品中，溶解，涡旋混匀，得到水解样品稀释液，量取100μΙ水解样品 稀释液注入清洁的6 X 50mm样品管，加入140μ1炫-氨基丁酸内标稀释液，加入110μ1水，涡 旋混匀，得到含内标物的水解样品，该含内标物的水解样品含内标的浓度为0. 〇〇〇 Ιμπιο 1 /μ 1 ； 3) 样品的衍生 分别量取1〇μ1含内标物的水解样品，注入清洁的6 X 50mm样品管底部，加入70μ1硼酸盐 缓冲液到样品管中，涡旋混合，加入20μ1衍生试剂到样品管中，立即涡旋混匀，放置1分钟， 将样品管用封口膜密封后，在55°C加热10分钟，取出，放冷至室温，即得样品衍生溶液。
[0006] 所述步骤(2)中AccQlag洗脱剂A浓溶液的配制过程如下： (a) EDTA溶液的配制： 称取EDTA 100mg，溶于100ml水中，超声振荡至全部溶解； (b) 称取NaAc · 3H2〇 190.4g，加1000ml纯水，搅拌，溶解，用浓磷酸(质量分数85wt%，物 质的量浓度15mol/L，下同）调pH值为5.2; (c) 向（b)中依次加入步骤(a)的EDTA溶液、O.lg叠氮钠、23.7ml三乙胺； (d) 将(c)的混合溶液用浓磷酸调pH值至4.95; (e)将(d)的混合溶液用水溶性过滤器过滤，滤液4°C储备，备用。
[0007] 本发明系统适用性试验和色谱系统回校均符合要求，测试结果可靠，且本发明省 去了购买water s提供的浓缩A液，节约了成本。
【附图说明】
[0008] 图1是空白溶液的高效液相色谱图； 图2至6是系统适用性试验中5针氨基酸标样衍生溶液的高效液相色谱图； 图7是色谱系统回校中氨基酸标样衍生溶液的高效液相色谱图； 图8、图9是样品衍生溶液1、样品衍生溶液2的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0009] 实施例1 比伐卢定氨基酸的测定： 1仪器及试剂:分析天平（±〇.〇lmg)、高效液相色谱仪戴安U-3000、微型旋涡混合仪、 真空干燥箱、干式恒温器、水解氨基酸标样(含17种水解氨基酸，天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、 甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮 氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸各2.5ymol/ml，胱氨酸为1.25μηιο 1/ml)、Waters AccQ · Fluor试剂盒 (氨基酸专利衍生剂）、AccQ· Tag洗脱剂A浓溶液、L-Ct-氨基丁酸、乙腈(色谱级）、浓盐酸 (分析纯）、苯酚(分析纯）、纯水(娃哈哈纯净水）。
[0010] 2色谱条件： 色谱柱:AccQ'Tag氨基酸分析柱C18 (3.9X150mm，4ym) 进样体积:5μ1， 柱温:37°C， 流速：1 .Oml/min， 检测波长:254nmUV 洗脱梯度程序见表1: 表1
流动相A:量取100mlACCQ'Tag洗脱剂A浓溶液，加入900ml水混合均匀即可； 流动相B:乙腈； 流动相C:纯水 AccQ· Tag洗脱剂A浓溶液的配制过程如下： (a) EDTA(乙二胺四乙酸二钠)溶液的配制： EDTA(二钠盐)称取100mg，溶于100ml水中，超声振荡溶解； 实际称样量:EDTA(二钠盐)称样量101.36mg; (b) 称取NaAc · 3H2〇 190.4g，加1000ml纯水，搅拌，溶解，用浓磷酸(质量分数85wt%，物 质的量浓度15mo 1 /L，下同）调pH值为5.2， NaAc · 3H2〇实际称样量190.43,加1000ml溶解后pH为8.03,再用浓磷酸调pH值为5.2; (c) 向（b)中依次加入10ml EDTA溶液、O.lg叠氮钠(NaN3)、23.7ml三乙胺(约17.2g); (d) 将(c)的混合溶液用浓磷酸调pH值至4.95; (e )将(d )混合溶液用水溶性过滤器过滤； (f)将(e)滤液置于4°C储备，备用(可保存6个月）。以上试剂级别均为分析纯。
[0011] 3溶液的配制： 3.1含0.1%苯酚的6mol/L盐酸称取苯酚100mg，置100ml容量瓶中，加浓盐酸（质量分 数36~38%，物质的量浓度约12mol/L，下同）50ml溶解后，加水释释定容至刻度，混匀，即 得。
[0012] 3.2 0.1N盐酸量取9ml浓盐酸，注入1000ml水中，混匀，即得。
[0013] 3.3 GC-氨基丁酸(AABA)内标储备液称取25.8mg α-氨基丁酸(AABA)置于100 ml容量瓶中，加0.1Ν盐酸稀释定容至刻度，混匀，即得。
[0014] 3.4涵-氨基丁酸(AABA)内标稀释液取100μ1:_-氨基丁酸(AABA)内标储备液，加 入到900μ1水中，混合均勾，即为0.00025μηιο1/μ1的禮-氨基丁酸(ΑΑΒΑ)内标稀释液。
[0015] 3.5含内标物的校正标样:在清洁的自动进样瓶中加入40μ1 1-氨基丁酸内标储 备液、40μ1 Waters水解氨基酸标样和920μ1水，混匀，此含内标物的校正标样中含各种氨基 酸和内标物的摩尔浓度均为ο · OOOlMiol/μΙ (含胱氨酸摩尔浓度为Ο · 00005μηιο1/μ1，相当 于含半胱氨酸摩尔浓度为〇 · 000?μπι〇1/μ1)。
[0016] 3.6样品水解取比伐卢定约25mg，精密称定（1式2份，记为样品1、样品2)，置10ml 容量瓶中，加水释释定容至刻度，混匀；用微量移液器移取50μ1上述溶液注入清洁的自动进 样瓶底部，置真空干燥箱，室温真空（真空度不高于. IMPa)干燥至少lh;在20ml的反应瓶 中加入300μ1的含0.1%苯酚的6mol/L盐酸，将自动进样瓶放入反应瓶，用氮气吹扫