一种纳他霉素检测方法及检测卡与流程

本发明涉及纳他霉素检测技术领域，具体为一种纳他霉素检测方法及检测卡。

背景技术：

纳他霉素为近白色或奶油黄色结晶粉末。是一种无臭、无味，低剂量且安全性高的食品防腐剂。纳他霉素是由纳他链霉菌受控发酵制得一种白色至乳白色的无臭无味的结晶粉末，通常以烯醇式结构存在。它的作用机理是与真菌的麦角甾醇以及其他甾醇基团结合，阻遏麦角甾醇生物合成，从而使细胞膜畸变，最终导致渗漏，引起细胞死亡。在焙烤食品用纳他霉素对面团进行表面处理，有明显的延长保质期作用。

纳他霉素依靠其内酯环结构与真菌细胞膜上的甾醇化合物作用，形成抗生素—甾醇化合物，从而破坏真菌的细胞质膜的结构。大环内脂的亲水部分（多醇部分）在膜上形成水孔，损伤细胞膜通透性，进而引起菌内氨基酸，电解质等物质渗出，菌体死亡。当某些微生物细胞膜上不存在甾醇化合物时，纳他霉素就对其无作用，因此纳他霉素只对真菌产生抑制，对细菌和病毒不产生抗菌活性，纳他霉素被用于治疗真菌感染，包括假丝酵母、曲霉菌、镰刀霉等，也被用作眼药水或者口腔药剂中，在这些应用中，人体对纳他霉素的吸收较少。口服时，基本没有从胃肠道被吸收，因此使它不适用为系统传染的药物。纳他霉素在眼药水中也有应用，其5%的纳他霉素含量适用于治疗微生物引起的真菌性睑炎、结膜炎和角膜炎，包括腐皮镰刀菌角膜炎。

纳他霉素是一种天然、广谱、高效安全的酵母菌及霉菌等丝状真菌抑制剂，它不仅能够抑制真菌，还能防止真菌毒素的产生。纳他霉素对人体无害，很难被人体消化道吸收，而且微生物很难对其产生抗性，同时因为其溶解度很低等特点，通常用于食品的表面防腐。生物防腐剂。

1982年6月，美国FDA正式批准纳他霉素可以用作食品防腐剂。1996年，中国食品添加剂标准化学技术委员会正式批准纳他霉素可作为食品防腐剂。FAO/WHO联合食品添加剂专家委员会规定了人体可无条件接受每天摄入每公斤体重0.3mg的纳他霉素。JECFA/EC也授权通过批准。人体通常摄入量远远低于安全量以下，即使消费量很大的奶酪和香肠也如此。

纳他霉素作为一种微生物防腐剂以它安全、天然和健康的特点而倍受人们的关注。纳他霉素具有许多优点：延长食品的保质期，防止酵母和霉菌引起的变质；减少因为变质而引起的食品回收，降低生产成本；满足消费者对天然食品的要求；不改变食品的风味；低剂量、高效率；抗菌作用时间长。

我国国标GB2760规定了纳他霉素的适用范围和用量：乳酪、肉制品、肉汤、西式火腿、广式月饼、糕点表面等，用200-300mg/kg悬浮液喷雾或浸泡。残留量应小于10mg/kg，然而由于纳他霉素的性质，纳他霉素的含量在检测时操作复杂，且纳他霉素的稳定性受PH值、温度、氧化剂和金属等影响，所以导致纳他霉素的含量检测受到影响，因此，亟需一种快捷的纳他霉素检测方法和检测卡。

技术实现要素：

（一）解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种纳他霉素检测方法及检测卡，解决了纳他霉素检测操作复杂的问题。

（二）技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种纳他霉素检测方法，包括以下步骤：

S1、取2g的牛奶待测试样A用浓度为25％的氨水2g调节待测试样A的pH为7，得到待测试样B，将待测试样B4g和以9:1比例充分混合的甲醇和水溶液8ml，将其依次放置入固相萃取小柱。

S2、使所述待测试样B4g和以9:1比例充分混合的甲醇和水溶液充分离心混合，称重，使待测试样和混合溶液的总重量在2g±0.001g，在4.0℃的条件下12000r/min高速冷冻离心10min沉淀蛋白，滤膜过滤后获得试样处理液。

S3、称取1mg纳他霉素，用甲醇定容在10ml棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存至检测前；然后，用50％甲醇(含2％甲酸)稀释，分别配制5-50μg/L的纳他霉素标准溶液；分别注入高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定。

S4、将所述试样处理液通过过滤膜后供高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，所获得的检验数据通过计算得到牛奶中的纳他霉素的含量。

优选的，所述固相萃取小柱为SPE-MCX固相萃取小柱。

优选的，所述步骤S2中的混合时间为8分钟。

优选的，所述色谱柱为反相色谱柱，流速为1.0ml/min，进样系统为自动进样器，温度：30℃。

一种纳他霉素检测卡，包括壳体，所述壳体分为外壳体和内壳体，所述外壳体内壁的底部设置有卡环，所述内壳体的底部开设有环形槽，所述内壳体的顶部开设有凹槽，内壳体的表面开设有通槽，所述通槽的靠近凹槽内壁的一端粘附有检测试纸，所述所述通槽的靠近外壳体外壁的一端固定连接有透镜，所述外壳体的外壁粘贴有比色卡，所述比色卡位于透镜的一侧。

优选的，所述内壳体的底部固定连接有手持柄。

优选的，所述凹槽的深度为内壳体长度的0.8倍。

优选的，所述通槽的底端与凹槽的底端位于同一水平线。

优选的，所述内壳体和外壳体均为圆柱状，且外壳体的大小与内壳体大小适配。

（三）有益效果

本发明提供了一种纳他霉素检测方法及检测卡。具备以下有益效果：

（1）、该纳他霉素检测方法及检测卡，只需要10分钟即可完成纳他霉素的检测，同时降低了误差，达到了简单快速的效果，操作简单，同时，通过内壳体表面的比色卡可快速的观察到纳他霉素的含量，操作简单。

（2）、该纳他霉素检测方法及检测卡，通过设置卡环和环形槽，扣合外壳体可以对内壳体进行保护，且闭合紧密，通过设置凹槽，充作加样孔的作用，将待测液倒入凹槽内，浸染检测试纸，通过设置透镜，便于观察检测试纸的颜色，通过设置比色卡，可直接与检测试纸的颜色进行对比，从而得出含量。

附图说明

图1为本发明纳他霉素检测卡的结构正剖图；

图2为本发明内壳体结构正视图。

图中：1壳体、101外壳体、102内壳体、2卡环、3环形槽、4凹槽、5通槽、6检测试纸、7透镜、8比色卡、9手持柄。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供以下技术方案：

实施例一

一种纳他霉素检测方法，包括以下步骤：

S1、取2g的牛奶待测试样A用浓度为25％的氨水2g调节待测试样A的pH为7，得到待测试样B，将待测试样B4g和以9:1比例充分混合的甲醇和水溶液8ml，将其依次放置入固相萃取小柱，固相萃取小柱为SPE-MCX固相萃取小柱。

S2、使所述待测试样B4g和以9:1比例充分混合的甲醇和水溶液充分离心混合，混合时间为8分钟，称重，使待测试样和混合溶液的总重量在2g±0.001g，在4.0℃的条件下12000r/min高速冷冻离心10min沉淀蛋白，滤膜过滤后获得试样处理液。

S3、称取1mg纳他霉素，用甲醇定容在10ml棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存至检测前；然后，用50％甲醇(含2％甲酸)稀释，分别配制5μg/L的纳他霉素标准溶液；分别注入高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，得出数据，色谱柱为反相色谱柱，流速为1.0ml/min，进样系统为自动进样器，温度：30℃。

S4、将所述试样处理液通过过滤膜后供高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，所获得的检验数据通过计算得到牛奶中的纳他霉素的含量，只需要10分钟即可完成纳他霉素的检测，同时降低了误差，达到了简单快速的效果，操作简单。

实施例二

一种纳他霉素检测方法，包括以下步骤：

S1、取2g的牛奶待测试样A用浓度为25％的氨水2g调节待测试样A的pH为7，得到待测试样B，将待测试样B4g和以9:1比例充分混合的甲醇和水溶液8ml，将其依次放置入固相萃取小柱，固相萃取小柱为SPE-MCX固相萃取小柱。

S2、使所述待测试样B4g和以9:1比例充分混合的甲醇和水溶液充分离心混合，混合时间为8分钟，称重，使待测试样和混合溶液的总重量在2g±0.001g，在4.0℃的条件下12000r/min高速冷冻离心10min沉淀蛋白，滤膜过滤后获得试样处理液。

S3、称取1mg纳他霉素，用甲醇定容在10ml棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存至检测前；然后，用30％甲醇(含2％甲酸)稀释，分别配制20μg/L的纳他霉素标准溶液；分别注入高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，得出数据，色谱柱为反相色谱柱，流速为1.0ml/min，进样系统为自动进样器，温度：30℃。

S4、将所述试样处理液通过过滤膜后供高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，所获得的检验数据通过计算得到牛奶中的纳他霉素的含量，只需要10分钟即可完成纳他霉素的检测，同时降低了误差，达到了简单快速的效果，操作简单，同时通过计算纳他霉素含量的变化，可以观察纳他霉素标准溶液浓度和稀释溶液甲醇浓度的变化对检测结果的影响，进行记录。

实施例三

一种纳他霉素检测方法，包括以下步骤：

S1、取2g的牛奶待测试样A用浓度为25％的氨水2g调节待测试样A的pH为7，得到待测试样B，将待测试样B4g和以9:1比例充分混合的甲醇和水溶液8ml，将其依次放置入固相萃取小柱，固相萃取小柱为SPE-MCX固相萃取小柱。

S2、使所述待测试样B4g和以9:1比例充分混合的甲醇和水溶液充分离心混合，混合时间为8分钟，称重，使待测试样和混合溶液的总重量在2g±0.001g，在4.0℃的条件下12000r/min高速冷冻离心10min沉淀蛋白，滤膜过滤后获得试样处理液。

S3、称取1mg纳他霉素，用甲醇定容在10ml棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存至检测前；然后，用20％甲醇(含2％甲酸)稀释，分别配制20μg/L的纳他霉素标准溶液；分别注入高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，得出数据，色谱柱为反相色谱柱，流速为1.0ml/min，进样系统为自动进样器，温度：0℃。

S4、将所述试样处理液通过过滤膜后供高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，所获得的检验数据通过计算得到牛奶中的纳他霉素的含量，只需要10分钟即可完成纳他霉素的检测，同时降低了误差，达到了简单快速的效果，操作简单，同时利用得出的纳他霉素含量分别与实施例一和实施例二中的纳他霉素含量进行对比，得出甲醇浓度和自动进样器温度的变化，对纳他霉素浓度检测的影响，从而统计得出甲醇浓度、纳他霉素标准溶液浓度和自动进样器温度变化对纳他霉素检测含量的影响。

如图1-2所示，一种纳他霉素检测卡，包括壳体1，壳体1分为外壳体101和内壳体102，内壳体102和外壳体101均为圆柱状，且外壳体101的大小与内壳体102大小适配，通过对壳体1形状的设定，在拿取携带的时候更加方便，外壳体101内壁的底部设置有卡环2，内壳体102的底部开设有环形槽3，通过设置卡环2和环形槽3，扣合外壳体101可以对内壳体102进行保护，且闭合紧密，内壳体102的顶部开设有凹槽4，通过设置凹槽4，充作加样孔的作用，将待测液倒入凹槽4内，浸染检测试纸6，凹槽4的深度为内壳体102长度的0.8倍，内壳体102的表面开设有通槽5，内壳体102的底部固定连接有手持柄9，通槽5的靠近凹槽4内壁的一端粘附有检测试纸6，通槽5的底端与凹槽4的底端位于同一水平线，通槽5的靠近外壳体101外壁的一端固定连接有透镜7，通过设置透镜7，便于观察检测试纸6的颜色，外壳体101的外壁粘贴有比色卡8，比色卡8位于透镜7的一侧，通过内壳体102表面的比色卡8可快速的观察到纳他霉素的含量，操作简单，将标准溶液倒入凹槽4内，标准溶液浸湿检测试纸6，通过透镜7观察检测试纸6的颜色，与透镜7一侧的比色卡8进行颜色对比，从而得出标准溶液中的纳他霉素的含量。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。