本发明涉及抗原检测技术领域，进一步涉及基于胶体金免疫层析技术的金黄色葡萄球菌快速检测方法，具体涉及一种检测奶牛乳房炎中金黄色葡萄球菌的胶体金试纸及其制备方法。
背景技术：
奶牛乳房炎，也称奶牛乳腺炎，是奶牛乳腺受到物理、化学及病原微生物感染等刺激后引起的炎症反应，是奶牛常见病之一，且发病率呈上升趋势。全球约三分之一奶牛患有各种类型的乳房炎，在我国奶牛乳房炎发病率为30％-70％，其中隐性乳房炎发病率高达50％-70％，近半数由金黄色葡萄球菌引起。金黄色葡萄球菌致病性主要是由于它产生多种毒素和酶，这些毒力因子影响金黄色葡萄球菌吸附、入侵组织和逃避宿主防御的能力。β-溶血素是一种具有神经磷脂酶c样活性的溶血素，能特异性裂解细胞膜的鞘磷脂，而使细胞膜发生渗透，进而导致细胞溶解，在金属离子存在时，β-溶血素活性更强。研究表明，牛源金黄色葡萄球菌比人源金黄色葡萄球菌更多表现β溶血，更少表现α溶血。在对奶牛乳腺上皮细胞的吸附、扩散中，β-溶血素是诱导红细胞溶解主要的原因，同时还增强了α溶血素溶血能力。
奶牛乳房炎的分类有不同标准，按轻重缓急分为最急性乳房炎、急性乳房炎、慢性乳房炎及亚临床乳房炎，按照临床症状分为临床型乳房炎和隐性乳房炎。乳房炎诊断包括临床诊断和实验诊断，临床诊断根据不同微生物引起的临床症状不同，可对乳房炎进行初步诊断。由于隐性乳房炎无明显临床症状，需借助试验方法对其进行诊断，一般包括体细胞计数法、乳汁pH检查、电导率法、病原微生物鉴定、PCR诊断法、美国加州乳房炎检验法、蛋白组学诊断法、酶学检验法、微量元素检验法等。但这些方法对检测人员的技术要求高，需要特殊的实验室设备，且费时、不经济。为了开发更加快速、便捷的检测方法，现有技术的研究者进行了诸多尝试，至今仍未取得理想的使用效果，究其原因，是此类方法的开发不仅应当着眼于金黄色葡萄球菌的抗原特性本身，还应当结合奶牛乳房炎这一特定的使用环境。此外，现有技术的快捷检测方法在抗原抗体反应层面设计不尽合理，所选用的显色试剂的发光性能有待提升，从而造成检测流程复杂、灵敏性不佳等问题；而现有技术中常规的血清学检测方法则更难以满足上述要求。
技术实现要素：
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种检测奶牛乳房炎中金黄色葡萄球菌的胶体金试纸及其制备方法，以解决现有技术中对奶牛乳房炎中金黄色葡萄球菌的常规血清学检测方法流程复杂、操作时间较长。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术中基于抗原抗体反应的金黄色葡萄球菌快速检测方法，由于发光体系设计不合理从而导致检测灵敏性较低。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种检测奶牛乳房炎中金黄色葡萄球菌的胶体金试纸，该胶体金试纸包括胶体金免疫层析反应体系，其中：其中金标蛋白是重组的金黄色葡萄球菌A蛋白，包被抗原是金黄色葡萄球菌β-溶血素，质控线是羊抗牛IgG。
一种上述胶体金试纸的制备方法，包括以下步骤：
1)取金黄色葡萄球菌β-溶血素包被于硝酸纤维膜形成检测线，取羊抗牛IgG包被所述硝酸纤维素膜形成质控线，即得到分析膜；
2)制备胶体金溶液，并采用胶体金标记体系标记SPA，将所得的金标蛋白在支持膜上固相化，即得到胶体金-SPA复合物结合垫；
3)取步骤1)所得的分析膜、步骤2)所得的胶体金-SPA复合物结合垫、吸水纸、样品垫、底板，组装试纸，即得到所述检测奶牛乳房炎中金黄色葡萄球菌的胶体金试纸。
作为优选，步骤1)所述金黄色葡萄球菌β-溶血素是通过以下方法制备的：金黄色葡萄球菌标准株接种于THB培养基中，摇床培养48小时，离心，取上清，经过滤除菌、超滤、柱层析纯化后，得到浓度为1～2mg/mL的金黄色葡萄球菌β-溶血素溶液。
作为优选，步骤2)所述胶体金溶液是通过柠檬酸钠还原法制备的。
作为优选，步骤2)所述胶体金标记体系中：胶体金颗粒的粒径为20～30nm。
作为优选，步骤2)所述胶体金标记体系中：蛋白与胶体金的结合反应pH为5.9～6.2。
作为优选，步骤2)所述胶体金标记体系中：胶体金上结合的蛋白量为20～60μg/mL。
作为优选，步骤2)所述胶体金标记体系中：稳定剂为PEG。
作为优选，步骤3)中组装试纸前先对步骤1)所得的分析膜执行以下操作：取步骤1)所得的分析膜经0.4％(v/v)浓度的甘油浸泡0.5h，再在37℃下烘干2h，而后取脱脂奶粉溶液和BSA溶液在4℃条件下封闭分析膜1h，而后洗涤、干燥。
作为优选，步骤3)所述组装试纸，具体包括以下操作：
A)取粘性底板；
B)将分析膜黏于底板4～10cm位置，检测线在前，质控线在后；
C)将胶体金-SPA复合物结合垫贴于底板2cm位置，上端压于分析膜上端，重叠0.5cm；
D)将样品垫黏贴于底板上，下端压于胶体金-SPA复合物结合垫上端，重叠1cm；
E)吸水垫黏于底板上，上端压于分析膜的下端，重叠1cm。
本发明提供了一种检测奶牛乳房炎中金黄色葡萄球菌的胶体金试纸及其制备方法，该技术方案根据抗原、抗体特异结合的免疫反应原理，利用胶体金免疫层析技术，以重组的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)作为金标蛋白，以高纯度的金黄色葡萄球菌β-溶血素作为包被抗原，利用羊抗牛IgG为质控线制备胶体金试纸条。本发明在确定了上述反应体系的基础上通过实验手段优选了具体操作条件，在保证反应性能的基础上设计了可行的试纸复合模式，所得的产品可以检测奶牛金黄色葡萄球菌抗体，与传统的血清学方法比，更快速、特异、简便，5分钟内可眼观实验结果。适用于金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎的诊断、检疫和流行病学调查，由于其结果判断直观，成本低，养殖人员可根据需要随时进行检测，适合基层推广。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1金黄色葡萄球菌β-溶血素提取与鉴定
1.1金黄色葡萄球菌β-溶血素提取
金黄色葡萄球菌标准株接种于THB培养基中，37℃过夜培养，按1％将其接种于1000mLTHB培养基中，37℃摇床培养48小时，菌液10000×g离心15分钟，弃菌体，上清通过0.45μm滤膜过滤除菌，经10KD超滤管超滤、SephadexG-50柱层析纯化后，Bradford法测β-溶血素浓度为1-2mg/mL，置于4℃冰箱保存待用。
1.2CAMP试验
在绵阳血琼脂平板上打直径6mm孔，向孔中加入50μL纯化的β-溶血素，37℃过夜，4℃1小时，可观察到CAMP现象。
实施例2胶体金的制备
2.1柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒
100mL0.01％HAuCl4溶液加热至沸腾，迅速加入一定量1％柠檬酸三钠水溶液，开始有些蓝色，然后浅蓝、蓝色，再加热出现红色，煮沸7-10分钟出现透明的橙红色，根据柠檬酸三钠用量与胶体金颗粒直径的关系制备直径10nm、15nm、25nm、50nm、60nm的胶体金颗粒，电镜下观察其分散度和均匀度，选择25nm粒径进行标记。
2.2胶体金标记蛋白
将SPA经0.05mol/L pH7.0NaCl4℃透析过夜，10000×g4℃离心1小时。
胶体金溶液经0.1mol/LHCl调节pH至5.9-6.2。
将胶体金溶液分装10管，每管1mL，将SPA调节胶体金溶液的pH值后，分装10管，每管1ml，用0.05mol/L，pH9.0硼酸盐缓冲液作系列稀释为5-50mg/ml，分别取1ml加入1管胶体金溶液中，对照组加1ml稀释液(不含蛋白质)，混匀；放置5min后，在上述各管内加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀静置2小时，观察结果，根据颜色变化情况，确定SPA和胶体金的用量比例。按上述比例将SPA和胶体金混合后，每25mLSPA-胶体金混合物加入1mLPEG溶液。超速离心法纯化胶体金-SPA复合物，最后用0.01mol/LPBS(0.02％NaN3)混悬，4℃保存。电镜下观察胶体金-SPA复合物的质量和分散度。
实施例3试纸条的组装
3.1 β-溶血素抗原包被量确定
采用斑点金免疫渗滤试验确定抗原包被量，抗原经PBS按1:2-1:256倍比稀释，各取2μL点样于0.45微孔滤膜上，干燥后，置于5％脱脂奶粉中封闭2小时，PBST洗涤3-5次，每次5分钟，干燥后，滴加β-溶血素阳性血清，洗涤干燥后，滴加胶体金-SAP复合物，静置观察红色斑点。
3.2羊抗牛IgG包被量的确定
方法同3.1。
3.3分析膜处理
NC膜经0.4％甘油浸泡半小时，37℃烘干箱中烘干2小时，固定蛋白。不同浓度的脱脂奶粉(1％、3％、5％、7％)和BSA(1％、3％、5％、7％)封闭分析膜，4℃，1小时，滴加胶体金溶液，根据背景颜色选择封闭液。
检测线和质控线包被的分析膜，经封闭和洗涤后，分别置于37℃、室温、4℃干燥，根据颜色变化选择最佳干燥条件。
3.4胶体金-SPA复合物结合垫的制备
将玻璃纤维膜剪成规格均一的小块作为结合垫，浸泡于胶体金-SPA溶液中30分钟，室温干燥。
3.5样品垫制备
将玻璃纤维膜剪切成一定规格大小的条带，浸入预处理液中于37℃孵育2小时，取出，37℃烘干，待用。
3.6分析膜的包被
将NC膜剪成一定规格条带，两端分别包被β-溶血素和羊抗牛IgG，包被β-溶血素作为检测线(T线)，包被羊抗牛IgG作为质控线(C线)，然后依据上述优选的封闭条件和烘干条件进行处理。
3.7试纸条组装
1)取粘性底板剪成一定规格；
2)将分析膜黏于底板4-10cm位置，检测线在前，质控线在后；
3)将金标结合垫贴于底板2cm位置，上端压于分析膜上端，重叠0.5cm；
4)将样品垫黏贴于底板上，下端压于金标结合垫上端，重叠1cm；
5)吸水垫黏于底板上，上端压于分析膜的下端，重叠1cm；
6)装配成型的试纸条保存于干燥的环境中，待检测用。
实施例4试纸条灵敏度检测
将金黄色葡萄球菌β-溶血素阳性血清进行2倍梯度稀释，用3批实验室自制试纸条进行检测，确定该试纸条对梯度稀释的阳性血清的灵敏度，结果见表1。由表1可见，3批试制条检测梯度稀释阳性血清的结果一致，血清效价均价侧至1:32倍。
表1对梯度稀释的阳性血清的灵敏度检测
注：结果判定标准为质控线显示红色，检测线显示红色为阳性；质控线显示红色，检测线不显色为阴性；质控线不显色为试验不成立。
实施例5试纸条特异性试验
采用实验室自制的3批奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌抗体胶体金试纸条对已知的10份阳性样本、10份阴性样本进行检测。结果试纸条的平均阳性符合率为80％，有2份未检出，平均阴性符合率为86.67％。具体结果见表2。
表2试纸条对已知样本的特异性试验
注：结果判定标准为检测结果与已知结果一致判为阳性标为“+”，检测结果与已知结果不一致判为阴性标为“-”
实施例6
本实施例公开一种检测奶牛乳房炎中金黄色葡萄球菌的胶体金试纸及其制备方法，该试纸可以检测奶牛金黄色葡萄球菌抗体，与传统的血清学方法比，更快速、特异、简便。适用于金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎的诊断、检疫和流行病学调查。
本实施例的解决方案是根据抗原、抗体能特异结合的免疫学原理，利用胶体金免疫层析技术，以重组的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)作为金标蛋白，以高纯度的金黄色葡萄球菌β-溶血素作为包被抗原，利用羊抗牛IgG为质控线制备胶体金试纸条。
上述检测奶牛乳房炎中金黄色葡萄球菌的胶体金试纸的其制备方法，包括以下步骤：
(1)提取金黄色葡萄球菌β-溶血素
金黄色葡萄球菌标准株接种于THB培养基中，摇床培养48小时，离心，取上清，经过滤除菌、超滤、柱层析纯化后，测得浓度为1-2mg/mL，置于4℃冰箱保存待用。
(2)制备分析膜
将步骤(1)制备的金黄色葡萄球菌β-溶血素包被于硝酸纤维膜形成检测线(T线)，羊抗牛IgG包被硝酸纤维素膜形成质控线(C线)，备用。
(3)制备胶体金-SPA复合物结合垫
利用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液，并采用标记体系标记SPA，将金标抗体在支持膜上固相化。
(4)组装试纸条
将步骤(2)的分析膜、步骤(3)的胶体金-SPA复合物结合垫、吸水纸、样品垫、底板组装成胶体金快速检测试纸条。
步骤(3)中的标记体系为：胶体金颗粒在25nm均一、稳定，抗体蛋白与胶体金结合最适宜的pH为5.9-6.2，最适结合胶体金的蛋白量为20-60μg/mL，最佳稳定剂为PEG。
本实施例的优点在于：能有效检测奶牛乳汁中或血清中的金黄色葡萄球菌抗体，与常规的血清学检测方法相比，检测快速、不需要使用人员的特殊技能，不需要特殊的仪器设备，5分钟内可眼观实验结果。
实施例7
一种检测奶牛乳房炎中金黄色葡萄球菌的胶体金试纸的制备方法，包括以下步骤：
1)取金黄色葡萄球菌β-溶血素包被于硝酸纤维膜形成检测线，取羊抗牛IgG包被所述硝酸纤维素膜形成质控线，即得到分析膜；
2)制备胶体金溶液，并采用胶体金标记体系标记SPA，将所得的金标蛋白在支持膜上固相化，即得到胶体金-SPA复合物结合垫；
3)取步骤1)所得的分析膜、步骤2)所得的胶体金-SPA复合物结合垫、吸水纸、样品垫、底板，组装试纸，即得到所述检测奶牛乳房炎中金黄色葡萄球菌的胶体金试纸。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)所述金黄色葡萄球菌β-溶血素是通过以下方法制备的：金黄色葡萄球菌标准株接种于THB培养基中，摇床培养48小时，离心，取上清，经过滤除菌、超滤、柱层析纯化后，得到浓度为1mg/mL的金黄色葡萄球菌β-溶血素溶液。
步骤2)所述胶体金溶液是通过柠檬酸钠还原法制备的。
步骤2)所述胶体金标记体系中：胶体金颗粒的粒径为20nm。
步骤2)所述胶体金标记体系中：蛋白与胶体金的结合反应pH为5.9。
步骤2)所述胶体金标记体系中：胶体金上结合的蛋白量为20μg/mL。
步骤2)所述胶体金标记体系中：稳定剂为PEG。
步骤3)中组装试纸前先对步骤1)所得的分析膜执行以下操作：取步骤1)所得的分析膜经0.4％(v/v)浓度的甘油浸泡0.5h，再在37℃下烘干2h，而后取脱脂奶粉溶液和BSA溶液在4℃条件下封闭分析膜1h，而后洗涤、干燥。
步骤3)所述组装试纸，具体包括以下操作：
A)取粘性底板；
B)将分析膜黏于底板4cm位置，检测线在前，质控线在后；
C)将胶体金-SPA复合物结合垫贴于底板2cm位置，上端压于分析膜上端，重叠0.5cm；
D)将样品垫黏贴于底板上，下端压于胶体金-SPA复合物结合垫上端，重叠1cm；
E)吸水垫黏于底板上，上端压于分析膜的下端，重叠1cm。
实施例8
一种检测奶牛乳房炎中金黄色葡萄球菌的胶体金试纸的制备方法，包括以下步骤：
1)取金黄色葡萄球菌β-溶血素包被于硝酸纤维膜形成检测线，取羊抗牛IgG包被所述硝酸纤维素膜形成质控线，即得到分析膜；
2)制备胶体金溶液，并采用胶体金标记体系标记SPA，将所得的金标蛋白在支持膜上固相化，即得到胶体金-SPA复合物结合垫；
3)取步骤1)所得的分析膜、步骤2)所得的胶体金-SPA复合物结合垫、吸水纸、样品垫、底板，组装试纸，即得到所述检测奶牛乳房炎中金黄色葡萄球菌的胶体金试纸。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)所述金黄色葡萄球菌β-溶血素是通过以下方法制备的：金黄色葡萄球菌标准株接种于THB培养基中，摇床培养48小时，离心，取上清，经过滤除菌、超滤、柱层析纯化后，得到浓度为2mg/mL的金黄色葡萄球菌β-溶血素溶液。
步骤2)所述胶体金标记体系中：胶体金颗粒的粒径为30nm。
步骤2)所述胶体金标记体系中：蛋白与胶体金的结合反应pH为6.2。
步骤2)所述胶体金标记体系中：胶体金上结合的蛋白量为60μg/mL。
步骤3)所述组装试纸，具体包括以下操作：
A)取粘性底板；
B)将分析膜黏于底板10cm位置，检测线在前，质控线在后；
C)将胶体金-SPA复合物结合垫贴于底板2cm位置，上端压于分析膜上端，重叠0.5cm；
D)将样品垫黏贴于底板上，下端压于胶体金-SPA复合物结合垫上端，重叠1cm；
E)吸水垫黏于底板上，上端压于分析膜的下端，重叠1cm。
实施例9
一种检测奶牛乳房炎中金黄色葡萄球菌的胶体金试纸的制备方法，包括以下步骤：
1)取金黄色葡萄球菌β-溶血素包被于硝酸纤维膜形成检测线，取羊抗牛IgG包被所述硝酸纤维素膜形成质控线，即得到分析膜；
2)制备胶体金溶液，并采用胶体金标记体系标记SPA，将所得的金标蛋白在支持膜上固相化，即得到胶体金-SPA复合物结合垫；
3)取步骤1)所得的分析膜、步骤2)所得的胶体金-SPA复合物结合垫、吸水纸、样品垫、底板，组装试纸，即得到所述检测奶牛乳房炎中金黄色葡萄球菌的胶体金试纸。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。