一种泛影酸原料药的高效液相色谱定性定量分析方法及其应用与流程

本发明属于药物分析检测领域，具体的说，是关于一种泛影酸原料药的高效液相色谱定性定量分析方法及其应用，所述高效液相色谱方法用于对泛影酸原料药、泛影酸原料药合成中的原料及关键中间体进行成分分析以及用于对泛影酸原料药的含量进行快速测定。

背景技术：

泛影酸(Diatrizoic acid，结构式如下式所示)，化学名为3,5-双(乙酰氨基)-2,4,6-三碘-苯甲酸，为X线诊断用阳性造影剂，供配制泛影葡胺、泛影酸钠或复方泛影葡胺注射液应用。主要用于泌尿系造影，亦用于心血管、脑血管、周围血管、胆管等造影及各种注射法造影如关节腔、子宫输卵管及瘘管等造影，

泛影酸的工艺路线如下，因此泛影酸原料药中很能会存在原料硝基物、及其中间体氨基物和碘代物，

目前，有少量的文献有关于泛影酸分析方法的文献报道，泛影葡胺注射液收录于《中国药典》2005年版，含量测定方法是采用加氢氧化钠试液、加热回流处理样品，然后用硝酸银滴定，该方法操作繁琐，实验误差大。《中国药物与临床》2011年第5期，宁慧青等人发表的题目为《高效液相色谱法测定泛影葡胺注射液含量》文章中，采用甲醇-缓冲液(0.025mol/L磷酸二氢钠水溶液，用磷酸调节pH＝3.0)＝10-90为流动相，控制流速在1.0mL/min，但是该方法是对制剂中的泛影酸进行检测，对生产中可能存在的中间体，没有说明。该方法在实际检测的中，可以检测合成工艺中的氨基物，却无法检测出合成路径中的关键中间体碘代物及原料硝基物。因此，研究一种泛影酸的高效液相色谱分析方法，这对医药生产企业来说显得尤为重要。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种方便快捷、结果准确可靠的泛影酸原料药的高效液相色谱定性定量分析方法，以解决现有的硝酸银滴定法操作繁琐、实验误差大的问题；本发明的第二个目的是提供一种高效液相色谱定性定量分析方法在泛影酸原料药的成分分析以及泛影酸原料药的含量测定中的应用，保证原料药的生产和质量。

为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种泛影酸原料药的高效液相色谱定性定量分析方法，以核壳型色谱柱为色谱柱，以乙腈和磷酸水为流动相，采用等度洗脱的方式进行分离，所述乙腈和磷酸水的体积配比为30:70。

根据本发明，所述的色谱柱为Phenomenex Kinetex 5μm XB-C18 100A 150×4.6mm。

根据本发明，所述磷酸水溶液的pH值为2.0。

进一步的，所述高效液相色谱定性定量分析方法采用如下的色谱分离条件进行分离：

流动相的流速为1.00mL/min；

色谱柱温度为30℃；

检测波长为238nm；

进样量为10μL。

进一步的，所述等度洗脱的时间为12min。

一种泛影酸原料药的高效液相色谱定性定量分析方法在泛影酸原料药的成分分析和含量检测中的应用。

本发明的泛影酸原料药的高效液相色谱定性定量分析方法及应用，其有益效果是：

1、不仅能够对泛影酸原料药的含量进行快速的测定，还能够对合成中的原料及关键中间体进行检测，保证原料药的生产和质量；

2、能够准确测定泛影酸原料药的含量，以及测定泛影酸原料药的纯度，比药典沉淀滴定法方便快捷、准确，解决了泛影酸原料药的质量控制问题，确保了泛影酸原料药的质量，为工业化大生产带来了巨大的社会意义，具有很强的实用性。

附图说明

图1为实施例1分离度溶液的色谱图；

图2为实施例1氨基物储备液的色谱图；

图3为实施例1泛影酸对照品溶液的色谱图；

图4为实施例2分离度溶液的色谱图；

图5为实施例2碘代物储备液的色谱图；

图6为实施例2氨基物储备液的色谱图；

图7为实施例2硝基物储备液的色谱图；

图8为实施例3的其中一针泛影酸对照品溶液的色谱图；

图9为实施例3的其中一针泛影酸供试品溶液的色谱图；

图10为实施例3的泛影酸的线性关系图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。

实施例1-4所用到的仪器如下：

(1)戴安(DIONEX)UltiMate 3000，含UltiMate 3000Pump，UltiMate 3000Autosampler，UltiMate 3000Column Compartment，UltiMate 3000Photodiode Arrary detector，Chromeleon工作站，美国戴安公司；

(2)Ultra Sonic Cleaner USK Type超声波清洗器；

(3)色谱柱：Kinete XB-C18 100A 5μm 150×4.6mm，广州费罗门科学仪器有限公司。

实施例1-3中的样品制备如下：

(1)泛影酸对照品溶液：称取泛影酸对照品10mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加2ml-3ml甲醇溶解并用流动相(乙腈和水配溶液)定容至刻度，摇匀，配置成浓度约为0.2mg/mL的乙腈水溶液。

(2)泛影酸供试品溶液：称取泛影酸供试品10mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加2ml-3ml甲醇溶解并用流动相(乙腈和水配溶液)定容至刻度，摇匀，配置成浓度约为0.2mg/mL的乙腈水溶液。

(3)分离度溶液：称取泛影酸对照品10mg、碘代物、氨基物以及硝基物质对照品1mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加2ml-3ml甲醇溶解并用流动相(乙腈和水配溶液)定容至刻度，摇匀。其中泛影酸的浓度约为0.2mg/mL，碘代物、氨基物和硝基物的浓度约为20μg/mL。

(4)碘代物储备液：称取碘代物1mg，精密称定，置50ml容量瓶中，流动相(乙腈和水配溶液)溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度约为20μg/mL的乙腈水溶液。

(5)氨基物储备液：称取碘代物0.5mg，精密称定，置50ml容量瓶中，流动相(乙腈和水配溶液)溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度约为10μg/mL的乙腈水溶液。

(6)硝基物储备液：称取碘代物1mg，精密称定，置50ml容量瓶中，流动相(乙腈和水配溶液)溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度约为10μg/mL的乙腈水溶液。

实施例1采用文献的方法定性检测泛影酸以及合成泛影酸的原料硝基物、关键中间体

《中国药物与临床》2011年第5期，宁慧青等人发表的题目为《高效液相色谱法测定泛影葡胺注射液含量》的文献中对制剂中泛影酸进行检测。但对生产中可能存在的中间体没有说明。为此申请人用文献中的方法对原料药和原料药中可能存在有关物质进行检测，步骤如下：

(1)色谱条件

流动相流速：1.0mL/min；

色谱柱温度：30℃；

进样体积：5μL；

检测波长：238nm；

色谱柱：Agilent SB-C18 5μm 150×4.6mm；

流动相等度洗脱：甲醇：缓冲液(0.025mol/L磷酸二氢钠水溶液，用磷酸调节pH＝3.0)＝10：90，等度洗脱20min。

(2)计算方式

连续进样两针分离度溶液，再连续进样分离度溶液、泛影酸对照品溶液、碘代物储备液、氨基物储备液和硝基物储备液。根据相对保留时间和全波长扫描的紫外吸收图，进行定性分析。

(3)液相结果

典型谱图见图1、2、3，图1为分离度溶液的色谱峰，其中9.167min数值为泛影酸的峰，3.488min数值为氨基物的峰。图2为氨基物储备液的色谱峰，保留时间为3.505min，图3为泛影酸对照品溶液的色谱峰，保留时间为8.733min。另外，碘代物储备液和硝基物储备液没有出现色谱峰。

结论：采用实施例1的液色谱分析方法可以检测出泛影酸以及泛影酸合成中的中间体氨基物，但无法检测出合成中的重要中间体及原料硝基物。

实施例2泛影酸、合成泛影酸的原料硝基物、关键中间体的分离检测

(1)色谱条件

流动相流速：1.0mL/min；

色谱柱温度：30℃；

进样体积：10μL；

检测波长：238nm；

色谱柱：Phenomenex Kinetex 5μm XB-C18 100A 150×4.6mm；

流动相等度洗脱：乙腈：磷酸水(pH＝2.0)＝30：70，等度洗脱20min。

(2)计算方法

连续进样分离度溶液、碘代物储备液、氨基物储备液、硝基物储备液。根据相对保留时间以及紫外吸收光谱图，通过分离度溶液的峰鉴别对原料药中可能存在的有关物质进行定性分析，用面积归一法确定分离度溶液中杂质的含量和有关物质的化学纯度。

(3)液相结果

典型谱图见4、5、6、7。图4为分离度溶液液相色谱图，其中1.740min为泛影酸的峰，1.282min为氨基物的峰，7.088min为碘代物的峰，8.032min为硝基物的峰，氨基物、碘代物和硝基物的含量为6.95％，2.70，34.20。图5为碘代物储备液的色谱图，其中7.027min为碘代物的峰，纯度为95.12％。图6为氨基物储备液的色谱图，其中1.283min为氨基物的峰，纯度为98.77％。图7为硝基物储备液的色谱图，其中7.540min为硝基物的峰，纯度为99.91％。根据相对保留时间和全波长扫描的紫外吸收图，进行定性分析，确定原料药中可能存在的有关物质，以及初步确定杂质的含量，对原料的生产进行检测。

结论：采用实施例2的色谱分析方法可以对泛影酸原料药中可能存在原料硝基物及其关键中间体等进行分离检测，还可以初步测定起始原料硝基物和氨基物的化学纯度，保证了起始原料的含量符合质量标准。同时测定反应中重要中间产物碘代物的纯度，对该反应进行全面的监控和质量控制。

实施例3泛影酸原料药的含量测定

(1)采用与实施例1相同的色谱条件，具体如下：

流动相流速：1.0mL/min；

色谱柱温度：30℃；

进样体积：10μL；

检测波长：238nm；

色谱柱：Phenomenex Kinetex 5μm XB-C18 100A 150×4.6mm；

流动相等度洗脱：乙腈：磷酸水(pH＝2.0)＝30：70，等度洗脱20min。

(2)计算方法

泛影酸的含量：W_试＝(A_试·m_对·W_对)/(A_对·m_试)

式中：

A_对—对照品溶液中，泛影酸峰面积的平均值；

A_试—供试品溶液中，泛影酸面积的平均值；

m_对—泛影酸对照品的质量，单位为克(g)；

m_试—泛影酸供试品的质量，单位为克(g)；

W_对—泛影酸对照品的质量分数，以％表示；

W_试—泛影酸供试品的质量分数，以％表示。

(3)液相结果

对标准品进样五针，其中一针线性泛影酸对照品溶液的典型图谱见图8(其它四针的典型图谱基本一致，省略)。如图8所示，泛影酸对照品溶液的5个样品分别进样所得的峰面积的平均值为103.2610mAu*min，RSD为0.11％。

对供试品进样五针，五针线性泛影酸供试品溶液的典型图谱见图9(其它四针的典型图谱基本一致，省略)，如图9所示，为泛影酸供试品溶液的5个样品所得峰面积平均值为92.6476mAu*min，RSD为0.24％。

采用外标法将对照品和供试品的峰面积的平均值代入计算方法的方程式中即可得供试品泛影酸的含量为93.75％。

实施例4实施例3的检测方法的方法学考察：

(1)精密度

按照实施例3的方法，选取同一批泛影酸对照品，按泛影酸对照品溶液的制备方法，依次配置0.19mg/mL、0.19mg/mL、0.2mg/mL、0.21mg/mL、0.22mg/mL、0.23mg/mL的泛影酸测试溶液，进行6次重复试验，每个溶液进样1针用泛影酸测试溶液计算主峰回收率。泛影酸的重复性试验检测结果如表1所示。

表1泛影酸的重复性试验检测结果

从表1可以看出，6次测定结果，泛影酸的平均回收率为104.62％，回收率的相对标准偏差RSD％为1.43％，小于2.0％，(RSD≤2.0％，精密度符合验证要求)。

结论：实施例3的色谱分析方法检测泛影酸含量的精密度高，重现性好。

(2)线性关系

按照实施例3的方法，称取泛影酸对照品0.7mg、2mg、2.9mg、4.1mg、5.3mg精密称定，置10mL容量瓶中，加2ml甲醇溶解并用流动相(乙腈和水配溶液)定容至刻度，摇匀。对样品浓度(X)和峰面积(Y)进行数据回归分析，线性回归方程为Y＝361.87X+28.43,R²＝0.9983；线性关系如图10所示，泛影酸的线性测试结果如表2所示。

表2泛影酸的线性测试结果

从表2和图10可以看出：在0.07mg/ml-0.53mg/ml浓度范围内，峰面积和浓度呈良好的线性关系。

(3)准确度

按照实施例3的方法，配制系线性范围内80％，100％，120％低中高三个浓度，计算回收率。按照实施例3的方法，称取泛影酸对照品1.2mg、1.7mg、2.0mg精密称定，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并用流动相(乙腈和水配溶液)定容至刻度，摇匀。分别进样低中高三个浓度的样品，回收率在98.30％-104.95％之间(回收率在90.0％-120.0％，符合验证要求)。泛影酸的回收率测试结果如表3所示。

表3泛影酸的回收率测试结果

结论：采用实施例3的方法检测泛影酸的含量具有良好的准确度。

综上所述，本发明的一种泛影酸的高效液相色谱分析方法，可以有效将泛影酸原料及中间体分离而进一步准确对纯度进行检测，对泛影酸原料药进行质量控制。

以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。