一种越橘提取物的鉴别及其中原花青素含量的测定方法与流程

本发明涉及一种植物提取物的鉴别及其中原花青素含量的测定方法，具体涉及一种越橘提取物的鉴别及其中原花青素含量的测定方法。

背景技术：

原花青素(Proanthocyanidins，PC)是植物中广泛存在的一大类多酚化合物的总称，属于生物类黄酮，由不同数量的儿茶素或表儿茶素聚合而成，其最高平均聚合度达十五聚体。按聚合度的大小，通常将二至四聚体称为低聚原花青素(简称OPC)，将五聚体以上的称为高聚原花青素(简称PPC)。原花青素是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂，同时还具有良好的抗癌、抗炎、调节血压、保护视力、软化血管等作用，是多种功能性食品的有效成分，其来源广泛，葡萄籽、银杏叶、越橘、樱桃、玫瑰花、松树皮中均含有原花青素。由于原花青素的多种健康功能，近年来从植物中提取的各种原花青素已广泛应用于各类保健食品中，其成分鉴别和含量测定是评价保健食品功能的重要指标。

目前对原花青素的检测方法主要有分光光度法和高效液相色谱法。

分光光度法的基本原理是利用原花青素在无机酸存在和加热的条件下被降解，产生红色的花青素，在546nm处有最大吸收，通过分光光度计测定原花青素在水解过程中生成的花青素离子，从而测定原花青素类化合物。此方法具有代表性的是2003版的《保健食品评价与技术规范》。此法虽能测得原花青素总量，但方法中规定的原花青素对照品过于笼统(葡萄籽提取物，纯度95％)，不易购得，准确度较低，且该方法不能鉴别原花青素成分及来源。

高效液相色谱法的基本原理是样品经过前处理后，利用HPLC色谱柱将原花青素中的各类组分分离，再用标准品定量。此法不仅可鉴别原花青素的成分及来源，还可测定原花青素含量，但由于原花青素的组分黄烷-3-醇类的立体异构化，原花青素以许多立体异构体形式存在，且各聚合体和同聚异构体之间极性相近，因此，利用HPLC对原花青素进行分离分析和结构表征非常困难，目前有关利用HPLC对原花青素进行定性定量的研究也仅限于原花青素单体及低聚体。

由于不同来源原花青素提取物的产品价格差异较大，各类原花青素产品检测标准较低，且检测主要集中于原花青素含量，导致一些商家将低价格的原花青素产品掺加到高价格产品中，以次充好，扰乱市场，甚至危害食用者的健康和安全。对比市场目前几个厂家的原料发现，质量不一，液相色谱图与SW/T 22013国际商务标准中标准品液相色谱图的出峰情况差别较大，因此市售越橘提取物存在真假混淆的可能。

目前用于鉴别越橘提取物的方法采用SW/T 2-2013国际商务标准经高效液相色谱(HPLC)法进行分析检测，通过样品与标准品液相色谱图的比对鉴别越橘提取物的真假；原花青素含量的测定采用《保健食品检验与评价技术规范》2003版“保健食品中原花青素的测定”，通过分光光度法测定原花青素在水解过程中生成的花青素离子，从而测定原花青素类化合物。由于越橘提取物的鉴别和其中原花青素含量的测定方法相互独立，步骤繁琐，且通过分光光度法测定原花青素的含量，其测定结果易受越橘提取物中所含花青素的影响，造成测定结果不准确。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服现有技术中越橘提取物的鉴别和其中原花青素含量的测定方法相互独立、步骤繁琐、测定结果不准确的技术问题，提供一种简单、快速、准确的越橘提取物的鉴别和其中原花青素含量的测定方法。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：采用高效液相色谱法，提供一种越橘提取物的鉴别及其中原花青素含量的测定方法，包括以下步骤：

(1)供试样品的制备：称取100mg～150mg供试越橘提取物原料于25mL容量瓶中，加入20mL甲醇，超声处理20min～30min，冷却至室温后，加甲醇定容至刻度，摇匀，以4000r/min离心20～30min后，取上清液备用；

(2)经水解供试品溶液的制备：将正丁醇与盐酸按95∶5的体积比混合后，制得正丁醇与盐酸的混合溶液，取出18mL正丁醇与盐酸的混合溶液置于具塞锥瓶中，再加入0.6mL硫酸亚铁铵溶液和3mL步骤(1)中制备的试样溶液，混匀，置98℃～100℃沸水浴回流，加热1h后立即置2℃～10℃冷水中冷却，再用10％磷酸水溶液定容至25mL容量瓶中，经0.45μm微孔滤膜过滤后，即得经水解处理的供试品溶液A；

(3)未经水解供试品溶液的制备：取18mL步骤(2)制得的正丁醇与盐酸混合溶液于25mL容量瓶中，加入0.6mL硫酸亚铁铵溶液和3mL步骤(1)中制备的试样溶液，用10％磷酸水溶液定容至刻度，经0.45μm微孔滤膜过滤后，即得未经水解处理的供试品溶液B；

(4)花青素标准品溶液的制备：精确称取10mg矢车菊素标准品于25mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，摇匀。从中移取2mL于100mL容量瓶中，用10％磷酸水溶液定容至刻度，经0.45μm微孔滤膜过滤后，即得花青素标准品溶液C；

(5)HPLC分析检测：精密吸取步骤(2)制得的经水解处理的供试品溶液A、步骤(3)制得的未经水解处理的供试品溶液B、步骤(4)制得的花青素标准品溶液C各15μL，依次注入高效液相色谱仪，得到高效液相色谱图，其中HPLC色谱条件如下：

a)色谱柱：Agilent C18，4.6×250mm，5μm；

b)流动相A：水∶甲酸＝91.5∶8.5，(V/V)；流动相B：水∶乙腈∶甲醇∶甲酸＝41.5∶22.5∶22.5∶8.5，(V/V/V/V)；

梯度条件为0～35min：7～25％B；35～45min：25～65％B；45～46min：65～100％B；46～50min：100％B；50～51min：100～7％B；51～60min：7％B；

c)检测波长：535nm；

d)流速：1.0mL/min。

(6)越橘提取物真假的鉴别：

将步骤(5)所得的未经水解处理的供试品溶液B的高效液相色谱图与国际商务标准SW/T 2-2013中的越橘提取物标准品液相色谱图(图1所示)进行对比，如供试品为假的越橘提取物，则色谱图与越橘提取物标准品色谱图会有明显不同。

(7)供试样品中花青素含量的计算：

将步骤(5)所得的经水解处理的供试品溶液A、未经水解处理的供试品溶液B及花青素标准品溶液C的高效液相色谱图，按外标法分别计算未经水解处理的供试品和经水解处理的供试品中花青素的含量，二者的差值即为试样中由原花青素水解为花青素的量，从而得出试样中原花青素的含量。

供试品中游离花青素含量以质量分数w₁计，数值以％表示，按下述公式计算：

w₁＝∑w_j

式中：

W_j——供试品中各游离花青素组分的质量分数，％；

A_j——供试品溶液中各游离花青素组分的峰面积(越橘提取物标准品液相色谱图中峰9，16，18，19，20)

A_std——花青素标准品溶液C中矢车菊素的峰面积；

C_std——花青素标准品溶液C中矢车菊素的浓度，单位为mg/mL；

m₁——供试品的称样量，单位为mg；

V₁——供试品的定容体积，单位为mL；

P——花青素标准品溶液C中矢车菊素的纯度，％；

MW_j——供试品溶液中相应的游离花青素组分的分子量；

MW_std——矢车菊素的分子量。

本发明的有益效果：本发明提供一种越橘提取物的鉴别及其中原花青素含量的测定方法，其有益效果在于：

(1)将越橘提取物的鉴别与原花青素含量测定的步骤简化、结合，供试越橘提取物经简单的前处理后采用可靠的HPLC分析检测，即可简便、准确的在测定越橘提取物中原花青素含量的同时鉴别越橘提取物的真假；

(2)将供试品中的原花青素水解为花青素后，经HPLC检测花青素含量，将其与未经水解处理的供试品中花青素的含量相减，通过所得差值反映试样中由原花青素水解为花青素的量，从而得出试样中原花青素的含量，整个过程中无需考虑试样中原花青素含有的黄烷醇聚合物的类型和聚合度，同时也可排除试样中本身含有的花青素对含量测定结果的干扰；

(3)未经水解处理的供试品溶液的HPLC谱图，除了用于测定供试品中本身含有的花青素的含量外，还可用于与越橘提取物标准品HPLC谱图的对比，从而鉴别供试越橘提取物的真假，前处理方法简单、操作步骤少，分析方法快速、准确，真伪鉴别方法容易、明确。

本发明操作简便、结果准确，适用于以越橘提取物为原料的保健品、医药品和/或化妆品中越橘提取物的鉴别及其中原花青素含量的测定。

附图说明

图1为国际商务标准SW/T 2-2013中的越橘提取物标准品HPLC色谱图；

图2为实施例1中未经水解处理的供试样品溶液B的HPLC色谱图；

图3为实施例1中经水解处理的供试样品溶液A的HPLC色谱图；

图4为实施例2中未经水解处理的供试样品溶液B的HPLC色谱图；

图5为实施例2中经水解处理的供试样品溶液A的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。本发明中所使用的方法如无特殊规定，均为常规的生产方法；所使用的试剂，如无特殊规定，均为常规的市售产品。

实施例1

提供一种越橘提取物的鉴别及其中原花青素含量的测定方法，包括以下步骤：

(1)供试样品的制备：称取100mg供试越橘提取物原料于25mL容量瓶中，加入20mL甲醇，超声处理30min，冷却至室温后，加甲醇定容至刻度，摇匀，以4000r/min离心20min后，取上清液备用；

(2)经水解供试品溶液的制备：将正丁醇与盐酸按95∶5的体积比混合后，制得正丁醇与盐酸的混合溶液，取出18mL正丁醇与盐酸的混合溶液置于具塞锥瓶中，再加入0.6mL硫酸亚铁铵溶液和3mL步骤(1)中制备的试样溶液，混匀，置100℃沸水浴回流，加热1h后立即置4℃冷水中冷却，再用10％磷酸水溶液定容至25mL容量瓶中，经0.45μm微孔滤膜过滤后，即得经水解处理的供试品溶液A；

(3)未经水解供试品溶液的制备：取18mL步骤(2)制得的正丁醇与盐酸混合溶液于25mL容量瓶中，加入0.6mL硫酸亚铁铵溶液和3mL步骤(1)中制备的试样溶液，用10％磷酸水溶液定容至刻度，经0.45μm微孔滤膜过滤后，即得未经水解处理的供试品溶液B；

(4)花青素标准品溶液的制备：精确称取10mg矢车菊素标准品于25mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，摇匀。从中移取2mL于100mL容量瓶中，用10％磷酸水溶液定容至刻度，经0.45μm微孔滤膜过滤后，即得花青素标准品溶液C；

(5)HPLC分析检测：用微量移液器吸取步骤(2)制得的经水解处理的供试品溶液A、步骤(3)制得的未经水解处理的供试品溶液B、步骤(4)制得的花青素标准品溶液C各15μL，依次注入高效液相色谱仪，得到高效液相色谱图，其中HPLC色谱条件如下：

a)色谱柱：Agilent C18，4.6×250mm，5μm；

b)流动相A：水∶甲酸＝91.5∶8.5，(V/V)；流动相B：水∶乙腈∶甲醇∶甲酸＝41.5∶22.5∶22.5∶8.5，(V/V/V/V)；

梯度条件为0～35min：7～25％B；35～45min：25～65％B；45～46min：65～100％B；46～50min：100％B；50～51min：100～7％B；51～60min：7％B；

c)检测波长：535nm；

d)流速：1.0mL/min。

(6)越橘提取物真假的鉴别：

将步骤(5)所得的未经水解处理的供试品溶液B的高效液相色谱图(图2所示)与国际商务标准SW/T 2-2013中的越橘提取物标准品液相色谱图(图1所示)进行对比，发现图2与图1出峰情况相似，判断该供试品为真的越橘提取物。

因无实际标准品对照，且检测设备系统适应性不同，会导致出峰时间不同，因此供试样品与越橘提取物标准品色谱图的比对主要考虑出峰个数及大致峰面积是否相似。

(7)供试样品中花青素含量的计算：

将步骤(5)所得的经水解处理的供试品溶液A(图3所示)、未经水解处理的供试品溶液B及花青素标准品溶液C的高效液相色谱图，按外标法分别计算未经水解处理的供试品和经水解处理的供试品中花青素的含量，二者的差值即为试样中由原花青素水解为花青素的量，从而得出试样中原花青素的含量。

供试品中游离花青素含量以质量分数w1计，数值以％表示，按下述公式计算：

w₁＝∑w_j

式中：

W_j——供试品中各游离花青素组分的质量分数，％；

A_j——供试品溶液中各游离花青素组分的峰面积(越橘提取物标准品液相色谱图中峰9，16，18，19，20)；

A_std——花青素标准品溶液C中矢车菊素的峰面积；

C_std——花青素标准品溶液C中矢车菊素的浓度，单位为mg/mL；

m₁——供试品的称样量，单位为mg；

V₁——供试品的定容体积，单位为mL；

P——花青素标准品溶液C中矢车菊素的纯度，％；

MW_j——供试品溶液中相应的游离花青素组分的分子量；

MW_std——矢车菊素的分子量。

经计算，未经水解处理的供试品溶液中游离花青素的含量为4.7％，经水解处理的供试品溶液中游离花青素的含量为53.5％，即试样中由原花青素水解产生花青素的量为48.8％，从而得出试样中原花青素的含量为48.8％。

实施例2

提供一种越橘提取物的鉴别及其中原花青素含量的测定方法，包括以下步骤：

(1)供试样品的制备：称取150mg供试越橘提取物原料于25mL容量瓶中，加入20mL甲醇，超声处理35min，冷却至室温后，加甲醇定容至刻度，摇匀，以4000r/min离心30min后，取上清液备用；

(2)经水解供试品溶液的制备：将正丁醇与盐酸按95∶5的体积比混合后，制得正丁醇与盐酸的混合溶液，取出18mL正丁醇与盐酸的混合溶液置于具塞锥瓶中，再加入0.6mL硫酸亚铁铵溶液和3mL步骤(1)中制备的试样溶液，混匀，置98℃沸水浴回流，加热1h后立即置8℃冷水中冷却，再用10％磷酸水溶液定容至25mL容量瓶中，经0.45μm微孔滤膜过滤后，即得经水解处理的供试品溶液A；

(3)未经水解供试品溶液的制备：取18mL步骤(2)制得的正丁醇与盐酸混合溶液于25mL容量瓶中，加入0.6mL硫酸亚铁铵溶液和3mL步骤(1)中制备的试样溶液，用10％磷酸水溶液定容至刻度，经0.45μm微孔滤膜过滤后，即得未经水解处理的供试品溶液B；

(4)花青素标准品溶液的制备：精确称取10mg矢车菊素标准品于25mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，摇匀。从中移取2mL于100mL容量瓶中，用10％磷酸水溶液定容至刻度，经0.45μm微孔滤膜过滤后，即得花青素标准品溶液C；

(5)HPLC分析检测：用微量移液器吸取吸取步骤(2)制得的经水解处理的供试品溶液A、步骤(3)制得的未经水解处理的供试品溶液B、步骤(4)制得的花青素标准品溶液C各15μL，依次注入高效液相色谱仪，得到高效液相色谱图，其中HPLC色谱条件如下：

a)色谱柱：Agilent C18，4.6×250mm，5μm；

b)流动相A：水∶甲酸＝91.5∶8.5，(V/V)；流动相B：水∶乙腈∶甲醇∶甲酸＝41.5∶22.5∶22.5∶8.5，(V/V/V/V)；

梯度条件为0～35min：7～25％B；35～45min：25～65％B；45～46min：65～100％B；46～50min：100％B；50～51min：100～7％B；51～60min：7％B；

c)检测波长：535nm；

d)流速：1.0mL/min。

(6)越橘提取物真假的鉴别：

将步骤(5)所得的未经水解处理的供试品溶液B的高效液相色谱图(图4所示)与国际商务标准SW/T2-2013中的越橘提取物标准品液相色谱图(图1所示)进行对比，发现图4与图1出峰情况明显不同，判断该供试品为假的越橘提取物。

因无实际标准品对照，且检测设备系统适应性不同，会导致出峰时间不同，因此供试样品与越橘提取物标准品色谱图的比对主要考虑出峰个数及大致峰面积是否相似。

(7)供试样品中花青素含量的计算：

将步骤(5)所得的经水解处理的供试品溶液A(图5所示)、未经水解处理的供试品溶液B及花青素标准品溶液C的高效液相色谱图，按外标法分别计算未经水解处理的供试品和经水解处理的供试品中花青素的含量，二者的差值即为试样中由原花青素水解为花青素的量，从而得出试样中原花青素的含量。

供试品中游离花青素含量以质量分数w₁计，数值以％表示，按下述公式计算：

w₁＝∑w_j

式中：

w_j——供试品中各游离花青素组分的质量分数，％；

A_j——供试品溶液中各游离花青素组分的峰面积(越橘提取物标准品液相色谱图中峰9，16，18，19，20)；

A_std——花青素标准品溶液C中矢车菊素的峰面积；

C_std——花青素标准品溶液C中矢车菊素的浓度，单位为mg/mL；

m₁——供试品的称样量，单位为mg；

V₁——供试品的定容体积，单位为mL；

P——花青素标准品溶液C中矢车菊素的纯度，％；

MW_j——供试品溶液中相应的游离花青素组分的分子量；

MW_std——矢车菊素的分子量。

经计算，未经水解处理的供试品溶液中游离花青素的含量为2.1％，经水解处理的供试品溶液中游离花青素的含量为17.3％，即试样中由原花青素水解产生花青素的量为15.2％，从而得出试样中原花青素的含量为15.2％。

惟以上所述者，仅为本发明的具体实施例而已，当不能以此限定本发明实施的范围，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。